Resistência

Sumário

para tratamento de TKI é um grande obstáculo no tratamento eficaz de NSCLC. Além estado da mutação EGFR, os mecanismos envolvidos são pouco conhecidos. Algumas evidências suporta um papel para microRNA 21 na modulação de sensibilidade às drogas de quimioterapia, mas seu papel na resistência NSCLC TKI ainda permanece inexplorado. Este estudo teve como objetivo investigar se NSCLC miR-21 mediada resistência aos inibidores da tirosina quinase resulta também de Pten alvo. Aqui, mostramos miR-21 promove o câncer, regula negativamente a expressão Pten em tecidos humanos NSCLC: miR-21 níveis de expressão elevados foram associados com DFS mais curtos em 47 pacientes com NSCLC; altos miR-21 /baixos níveis de expressão de PTEN indicou uma má resposta clínica TKI e sobrevivência global mais curto em mais 46 pacientes com NSCLC submetidos a tratamento TKI.

In vitro

ensaios mostraram que o miR-21 foi regulada concomitantemente para a sub-regulação de Pten em /GR células em comparação com as células PC-9-9 PC. Além disso, a sobre-expressão de miR-21 diminuiu significativamente a sensibilidade a gefitinib por Akt e ERK vias expressão Pten e activando-regular negativamente em células PC-9, enquanto que o miR-21 knockdown restaurado drasticamente a sensibilidade a gefitinib de /GR por células para cima 9 PC- regulação da expressão Pten e inativação de AKT e ERK,

in vivo

e

in vitro

. Propomos alteração de miR-21 expressão /Pten como um novo mecanismo para a resistência TKI no câncer de NSCLC. Nossos resultados fornecem uma nova base para a utilização de miR 21 /Pten baseada em estratégias terapêuticas para reverter a resistência gefitinib em NSCLC

Citation:. Shen H, Zhu F, Liu J, Xu T, Pei D, Wang R, et ai. (2014) Alteração na Mir-21 /PTEN Expressão Modula Resistência Gefitinib em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (7): e103305. doi: 10.1371 /journal.pone.0103305

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 04 de março de 2014; Aceito: 27 de junho de 2014; Publicação: 24 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Os dados são incluídos dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (81101705 e 81272532), os clínicos projetos de ciência e tecnologia na província de Jiangsu (centro de investigação clínica, BL2012008) eo Natural Science Foundation da província de Jiangsu (BK2011852). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é a principal causa de morte relacionada com câncer em todo o mundo. [1] Infelizmente, apesar dos avanços na detecção precoce do câncer, a maioria dos pacientes com NSCLC são diagnosticados com a doença em estágio avançado, resultando em mau prognóstico, com uma sobrevida média de apenas 10-12 meses. [2], [3] O desenvolvimento de drogas que têm como alvo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), tais como EGFR-TKI (gefitinib e erlotinib) melhorou a eficácia da terapia de NSCLC. Com efeito, a presença de mutações de activação do EGFR exão desempenha um papel essencial na predição da eficácia terapêutica de EGFR-TKI. [2] Estas mutações ativadoras do EGFR, muitas vezes se correlacionam significativamente com uma histologia associada ao adenocarcinoma, tabagismo, sexo e etnia. [3] Assim, EGFR-TKI tem sido recomendada como a terapia de primeira linha para pacientes com NSCLC com mutações EGFR. Infelizmente, a sua eficácia clínica é limitada pelo desenvolvimento de resistência adquirida: a maioria dos doentes que respondem inicialmente, subsequentemente, detectar a progressão da doença com o uso contínuo de TKI durante cerca de 9-11 meses; [4] cerca de 50% dos doentes que respondem inicialmente ao EGFR-TKI adquirir resistência a EGFR-TKI, enquanto mutação do EGFR T790M em contas exon20 para 50% desta resistência adquirida; [4] mais 20% de TKI adquiriu resultados de resistência de amplificação MET. [2] Ainda não está claro como os restantes 30% dos pacientes desenvolvem resistência adquirida.

MicroRNA (miRNA), conhecido para suprimir intrinsecamente mRNA, emparelhando com a região 3 ‘não traduzida (UTR) do mRNA foi mostrada para modular negativamente a expressão de genes alvo. [5], [6] como genes reguladores, miARN regular a cerca de um terço dos genes e desempenham um papel importante em funções celulares, incluindo a proliferação, o crescimento, a diferenciação e a apoptose. [7], [8] Nos últimos anos, o papel crucial do miARNs na carcinogénese foram demonstradas. [9] Além disso, algumas funções miRNAs como supressores tumorais

in vitro.

[10], [11] Portanto, a sobre-expressão de tais miRNAs possam suprimir as proteínas-alvo, que funcionam como fatores cancerígenos. [7], [12] Em contraste com ARN interferente curto, miARNs é acreditado para regular o mesmo caminho em múltiplos níveis. [10] miR-21 é um importante oncogénica miARN, estreitamente relacionada com o crescimento de tumores e metástases. [13], [14] Com efeito, a expressão de miR-21 foi mostrado estar associado com prognóstico pobre e quimio-sensibilidade em adenocarcinoma do cólon. [15], [16] Para além disso, anti-miR-21 suprimiu o crescimento de células de cancro da mama por meio de infra-regulação do factor anti-apoptótico, linfoma de culas B 2 (Bcl-2). [17], [18] Estes dados, em conjunto, apoiar um papel importante alterado miR-21 expressão durante o desenvolvimento do tumor. Então, nós investigamos se miR-21 modula a sensibilidade TKI em pacientes com NSCLC também.

Nós descobrimos que a regulação positiva de miR-21 e sub-regulação da Pten em 47 tecidos tumorais NSCLC comparação com os seus tecidos normais adjacentes, e que os seus níveis de expressão correlacionados negativamente. miR-21 expressão correlacionada com DFS mais curtos nos 47 pacientes com NSCLC. Além disso, nossos dados mostraram uma boa correlação entre altos miR-21 /baixos níveis de expressão de PTEN e baixa sensibilidade TKI com sobrevida global curta em 46 pacientes com NSCLC submetidos a tratamento TKI. Portanto, temos a hipótese de que a alteração da expressão de miR-21-Pten modula sensibilidade TKI em células de câncer de pulmão. Descobrimos que miR-21 foi regulada Concomittantly com a regulação negativa da Pten in /GR células 9 pc-em comparação com células PC-9,

in vitro

. Além disso, a sobre-expressão de miR-21 diminuiu significativamente a sensibilidade a gefitinib através de sub-regulação da expressão Pten e activação de Akt e ERK vias, enquanto knockdown de miR-21 restaurado drasticamente a sensibilidade a gefitinib de /GR células 9 PC-por-se-regulação Pten expressão e inativando AKT e ERK vias de sinalização, tanto

in vivo

e

in vitro

.

Materiais e Métodos

Materiais

gefitinib foi um presente tipo de AstraZeneca (Tocris, Reino Unido). Os anticorpos contra PTEN, fosfo-ERK1 /2, fosfo-AKT (Ser-473), e AKT total de foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os anticorpos contra ERK2 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA). Os anticorpos contra o GAPDH foram obtidos a partir de Kangcheng Company (Xangai, China). reagentes Lipofectamine e Trizol foram adquiridos da Life Technologies (Grand Island, NY, EUA). MiR-21 imita e miR-21 inibidor foram fornecidos pela GenePharma (Xangai, China). A alta capacidade de ARN-ADNc de Kit e de alimentação da mistura de SYBR Verde PCR Master foram adquiridos a Applied Biosystems (Carlsbad, CA). As linhas celulares PC-9 foram adquiridos a partir do Type Culture Collection da Academia Chinesa de Ciências, Shanghai, China. A linha PC-9 gefitinib resistente célula (PC-9 /GR), que foi induzida por exposição das células PC-9 a concentrações crescentes de gefitinib como relatado anteriormente [19], [20], foi gentilmente fornecido pelo Departamento de Oncologia, Shanghai pulmonar Hospital, Universidade Tongji, em Xangai.

espécimes clínicos

espécimes NSCLC humanos pares (n = 47) e amostras de tecidos adjacentes normais pareados foram coletadas de pacientes submetidos a procedimentos cirúrgicos padrão na Primeira Affiliated Hospital da Universidade de Nanjing Medical, Jiangsu (China), com o consentimento informado por escrito dos pacientes. Uma parte de cada amostra de tecido foi imediatamente congeladas em nitrogênio líquido, enquanto a outra parte foi fixada em formalina para exame histológico.

embebidos em parafina amostras de pacientes com NSCLC (n = 46), que estavam recebendo EGFR tratamento de TKI, foram coletadas a partir do departamento de patologia do primeiro Hospital Afiliado da Universidade médica de Nanjing, Jiangsu (China), com o consentimento informado escrito dos pacientes. Todas as amostras foram histologicamente classificados e classificados de acordo com estágio TNM por um patologista clínico cego. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Institutional Review Committee do primeiro hospital afiliada da Universidade Médica de Nanjing, Nanjing (China).

cultura celular

pc-9 Humana e pc-9 /célula GR linhas, e as células HEK293T foram cultivadas em RPMI e DMEM, respectivamente, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C, num ambiente humidif içado contendo 5% de CO

2 .

transfecção celular

HSA-miR-21 ou HSA-miR-NC imita foram transfectados em células PC-9 utilizando o reagente de lipofectamina (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações finais de HSA-miR-21 ou HSA-miR-NC imita para a transfecção foram de 40 nM. Um procedimento semelhante foi utilizado para transfectar miR-21 inibidor (40 nM) ou NC em /GR células 9 PC-.

A viabilidade celular ensaio

PC-9 /GR células PC-9 e foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 4 x 10

3 células /poço e deixadas a aderir durante a noite. Em paralelo, células PC-9 foram semeadas em placas de 96 cavidades e foram transfectadas, com o miR-21 mímico e NC durante 24 h, enquanto que as células de PC-9 /GR foram transfectadas com miR-21 inibidor. Após adesão celular, gefitinib foi adicionado a uma concentração final de 2,5-40 pmol /L. Após 72 h de incubação, a viabilidade celular foi avaliada utilizando a célula de contagem Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories), de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra foi preparada em triplicado e três experimentos independentes foram realizadas.

embalagem Lentivirus e criação de linha celular estável

Para knockdown estavelmente miR-21 expressão no pc-9 /GR células, a embalagem lentiviral foi usado kit (Thermo Fisher Scientific). Lentivírus transportando o miR-21 inibidor ou um controlo negativo (o miR-NC) foi embalado seguindo as instruções do fabricante. genética verde proteína fluorescente (GFP) foi inserida no sistema de embalagem e co-expressa com miARNs. Lentivírus foi embalado em células HEK293T e segregada para o meio. As células PC-9 /GR foram infectados por lentivírus que transportam o miR-21 inibidor ou miR-CN na presença de polibreno (Sigma-Aldrich), e seleccionada por puromicina (Sigma-Aldrich) durante 2 semanas para obter pc-9 GR /miR -21 inibidor e PC-9 GR /linhas celulares estáveis ​​de miR-NC.

ensaio de apoptose

a apoptose foi medida como descrito previamente [21]. Resumidamente, as células foram tripsinizadas e marcadas com Alexa Fluor 647 Anexina V (BioLegend) e 7-AAD (BD Pharmingen), e analisada por citometria de fluxo. As células foram consideradas apoptótica quando eram anexina V-positiva e 7-AAD-negativas.

Isolamento de ARN e quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), análise

Os ARNs totais foram extraídos a partir de cultura células ou amostras de tecidos humanos, utilizando o reagente TRIzol de acordo com as instruções do fabricante. Para medir os níveis de expressão de miR-21, os ARN foram transcritas de haste-laçada iniciador de RT utilizando o kit de RT PrimeScript Reagente (Takara), como descrito anteriormente [21], [22]. As sequências dos iniciadores de RT foram como se segue: o miR-21-TA, 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG TCAACATC -3 ‘; U6-RT, 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3 ‘. qRT-PCR foi realizada utilizando SYBR Premix DimerEraser (Takara) em um sistema 7900HT (Applied Biosystems). miR-21 iniciadores de qPCR foram: sentido, 5’-ACACTCCAGCTGGG TAGCTTATCAGACTGA -3 ‘; anti-sentido, 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG -3 ‘. iniciadores U6 snRNA qPCR foram: sentido, 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ‘; anti-sentido, 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ‘. A expressão de miR-21 foi normalizada para os níveis de U6 e o ​​método de ciclo limiar comparativa (2

-ΔΔCT) foi usada com U6 como controlo.

Extracção de proteínas e Western Blotting

células ou tecidos foram colhidas e lisadas em gelo durante 30 minutos em tampão de RIPA (Beyotime) suplementado com 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Os lisados ​​foram submetidos a ensaio de transferência de Western como descrito anteriormente [23] e detectado com anticorpos contra PTEN, fosfo-AKT (Ser-473), Akt total, a fosfo-ERK, ERK total, a GAPDH.

A imuno-histoquímica (IHQ )

, tecidos embebidos em parafina e fixado em formalina recolhidos a partir de doentes com NSCLC (N = 46), foram seccionados a 5 um, e incubadas com anticorpos contra Pten (Cell Signaling Technology). A avaliação dos sinais de IHC foi realizada por dois patologistas experientes de uma maneira cega. Cinco campos de alta potência (200 ×) foram selecionados aleatoriamente em cada amostra. As percentagens de células tumorais foram categorizadas em cinco classes semi-quantitativos: 0 (células positivas ≤5%), 1 (6% -25% de células positivas), 2 (26% -50% de células positivas), 3 (51% -75 % de células positivas), e 4 ( 76% de células positivas). A intensidade da coloração foi também semi-quantitativamente determinada numa escala de 0-3 como se segue: 0 (negativa), 1 (fracamente positivo), 2 (moderada positivo), e 3 (fortemente positivas). Os produtos de contagens percentuais de intensidade de coloração IHC produziu contagens finais: 0 (negativo), + (1-4), ++ (5-8), e +++ (9-12) como anteriormente descrito [24]

.

a hibridação in situ

ISH foi realizado em amostras de parafina incorporação de NSCLC para investigar a resposta clínica ao TKI e miR-21 de expressão. Resumidamente, as lâminas foram tratadas e hibridizadas com a sonda de 10 pmoles (e DIG marcado com oligonucleótido modificado com LNA; Exiqon) complementar de miR-21, de acordo com as instruções do fabricante. Após a incubação com anti-DIG-HRP fragmentos Fab conjugados com peroxidase de rábano, as sondas hibridadas foram detectadas por incubação com uma solução de 3’3-diaminobenzidina com núcleos contra-coradas com hematoxilina de Carazzi. Os padrões de coloração foram analisados ​​por 3 especialistas e a proporção de células de tumor coradas positivamente foi classificada como se segue: 0 (sem células positivas), 1 ( 10% de células positivas), 2 (10% de células positivas -50%), 3 ( 50% de células positivas). As células em cada intensidade de coloração foram registados numa escala de 0 (sem coloração), 1 (fraca coloração, azul claro ou amarelo), 2 (coloração moderada, azul ou amarelo), e 3 (de coloração forte, azul escuro ou amarelo) . Para os tumores que apresentavam coloração heterogênea, o padrão predominante foi considerado para pontuação. O índice de coloração (SI) foi calculado como a proporção de células de tumor coradas positivamente × intensidade de coloração. Usando este método, a expressão de miR-21 foi pontuada como 0, 1, 2, 3, 4, 6 ou 9. Em caso de discordância (pontuação discrepância 1), as lâminas foram reexaminados e foi alcançado um consenso pelos peritos .

modelo de tumor xenoenxerto em ratinhos nus

Para ensaios de crescimento do tumor, ratos nu masculina 6 semanas de idade (BALB /cA-nu (nu /nu) foram adquiridas da SLAC Centro animal ( Xangai, China), e mantidos em) condições especiais isentos de agentes patogénicos (SPF. Protocolos para experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de University Medical Nanjing animal Welfare. Alíquotas de células (4 × 10

6) foram suspensos em 150 mL FBS meio RPMI isento de meio DMEM e injectado subcutaneamente no flanco posterior de ratinhos nus (n = 6). O tamanho do tumor foi medido utilizando um paquímetro de sete em sete dias, até que foram sacrificados no dia 35 após o implante e volume tumoral foi calculado como 0,5 x Comprimento × Largura

2.

a análise estatística

Os valores foram obtidos a partir de pelo menos três experiências independentes e apresentados como médias ± sE. Estudante de não pareado

t

teste foi realizado e os valores foram consideradas significativamente diferentes quando

P

. 0,05

Resultados

Up-regulação do miR-21 e para baixo-regulação do Pten correlacionar negativamente com menor DSF em tecidos tumorais de pacientes com NSCLC humanos

Para determinar os níveis de expressão de proteína de miR-21 e Pten em tecidos tumorais de pacientes com NSCLC humanas, avaliou-se 47 pares de câncer espécimes de tumor e tecidos normais adjacentes (Tabela S1) por qRT-PCR e encontrada uma expressão significativamente mais elevada de miR-21 em 37/47 (78,7%) em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais adjacentes (Fig. 1A). Desde Pten é um dos objectivos importantes de miR-21, [25], [26] foi investigada a relação entre a expressão de miR-21 e Pten em NSCLC humana espécimes tanto por imunotransferência e imuno-histoquímica (IHC). Nós descobrimos que os níveis de proteína PTEN foram significativamente reduzidos em tecidos 34/47 (72,3%) de tumor em comparação com as normais adjacentes (Fig. 1B). Além disso, os níveis de expressão relativos de Pten foram avaliados por dois patologistas experientes de maneira cega, e marcado com contagens finais IHC de 0 (negativo), + (fraco), ++ (moderada) e +++ (forte) (Fig. 1C ). Os níveis de miR-21 foram reduzidos na alta intensidade Pten (Fig. 1D). Além disso, a análise de gráfico de dispersão mostrou uma correlação inversa entre miR-21 níveis de expressão e pontuação IHC de sinais de PTEN (Fig. 1e). Estes resultados demonstraram que os níveis de expressão de miR-21 estavam inversamente correlacionados com níveis de PTEN em tecidos NSCLC. Para melhor avaliar a correlação entre o miR-21 /níveis de expressão de PTEN e prognóstico em pacientes com NSCLC, utilizou-se a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier e teste log-rank para avaliar os normalizados miR-21 níveis de expressão (tumor /normal) e sobrevida livre de doença ( DFS). Os resultados mostraram que os pacientes com miR-21 níveis de expressão elevados tiveram uma sobrevida livre de doença mais curto (DFS) em comparação com pacientes com baixa expressão de miR-21 (Fig. 1F).

(A) Os níveis de expressão de miR- 21 foram regulados positivamente em 37/47 pares de tecidos NSCLC relativamente aos espécimes normais adjacentes. MiR-21 foram analisados ​​por haste-laçada qRT-PCR, e normalizadas para os níveis de U6. Fold alterações foram obtidos pela relação de miR-21 abundância em tecidos de cancro de que, em tecidos normais adjacentes. *

P

0,05 indica diferença significativa comparando o miR-21 de expressão em tecidos de tumor com os tecidos normais adjacentes. (B) os níveis de proteína em tecidos representativas PTEN NSCLC (T) e as amostras normais adjacentes (N), avaliada por imunotransf erência, GAPDH foi usada como controlo de carga. (C) Pten imuno-histoquímica (IHQ) resultados de seções NSCLC, 0 (negativos), + (fracamente positivo), ++ (moderadamente positiva) e +++ (fortemente positiva). (D) A análise de correlação entre os níveis de proteína PTEN e miR-21 níveis de expressão em tecidos NSCLC. pontuação IHC foram usadas para descrever os níveis de proteína PTEN em tecidos tumorais, avaliados por patologistas experientes de modo cego. curvas de regressão (E) lineares de expressão de miR-21 e níveis de proteína PTEN. curvas (F) de Kaplan-Meier descrevendo a sobrevida livre de doença de acordo com a expressão de miR-21. O valor de corte dos subgrupos (alto e baixo) de miR-21 nível de expressão foi o valor percentil 50.

Up-regulação do miR-21 e sub-regulação das proteínas PTEN estão associadas com a má TKI sensibilidade e sobrevivência global mais curto em tecidos de tumor de doentes com NSCLC submetidos a tratamento de humanos TKI

estudos anteriores demonstraram que o miR-21 induz a resistência à cisplatina em NSCLC [27]. Além disso, Wang et al. encontrado que o miR-214 regula a resistência adquirida a gefitinib via PTEN /Akt em linhas celulares de EGFR mutante [28]. Dado o efeito potencial de miARN na modulação da sensibilidade ao fármaco, foi investigado se a alteração da expressão de miR-21 /Pten se correlaciona com a sensibilidade de TKI. Após o acompanhamento do tratamento clínico dos 47 pacientes com NSCLC, encontramos apenas 5 pacientes que usaram o tratamento TKI. Um paciente mostrando uma resposta parcial (PR) apresentaram nível de expressão de miR-21 (tumor /normal) de apenas 0,16; três pacientes com doença estável (SD) exibido médios miR-21 os níveis de expressão 2,57; um paciente com uma doença progressiva (DP) mostrou alta expressão de miR-21 a 33,15 (Fig. 2A). ensaios IHC em tecidos obtidos a partir destes cinco doentes mostraram que os níveis de expressão de PTEN negativamente correlacionada com a resposta clínica do inibidor da tirosina quinase: um tecido PD paciente mostrou expressão Pten de (-); PTEN expressão nas restantes quatro pacientes com PR e SD variou de (++) a (+++) (Fig. 2B). Para confirmar ainda mais nossos resultados, avaliamos miR-21 níveis de expressão utilizando ensaios ISH (Fig. 2D) e os níveis de expressão de PTEN por IHC em amostras embebidos em parafina de 46 pacientes com NSCLC tratados com TKI (gefitinib ou erlotinib) como tratamento e acompanhados sua clínica resposta e status de sobrevivência (Tabela S2). Como esperado, os níveis de expressão de miR-21 em pacientes com DP foram significativamente mais elevados do que aqueles em grupos PR e SD (Fig. 2C). Maiores miR-21 os níveis de expressão também indicado mais curta sobrevivência global em doentes tratados com TKI (Fig. 2E). Além disso, os níveis de expressão de PTEN em pacientes com DP foi significativamente menor do que nos grupos de doentes e PR SD (Fig. 2F), e maior expressão Pten correlacionado com a sobrevivência global maior em pacientes tratados com TKI (Fig. 2G). Estes resultados são todos de acordo e sugerir o envolvimento da alta expressão Pten miR-21 /baixa na modulação da sensibilidade TKI em NSCLC

.

(A) A resposta clínica de TKI e miR-21 níveis de expressão em pacientes com NSCLC 5 avaliadas por Q-RT PCR. (B) A resposta clínica dos níveis de TKI e expressão Pten em 5 pacientes com NSCLC testados por imuno-histoquímica. pacientes PR (resposta parcial) e SD (doença estável) teve relativamente mais baixos miR-21 níveis de expressão e mais elevados níveis de expressão de PTEN em comparação com os pacientes (doença progressiva) PD. (*

p Art 0,05). Análise (C) A correlação realizada entre o miR-21 os níveis de expressão e a resposta clínica ao TKI. (D) representativos de miR-21 e pontuações níveis em tecidos com NSCLC submetidos a tratamento TKI avaliadas por hibridização in situ. curvas (E) de Kaplan-Meier que descrevem a sobrevivência geral de acordo com a expressão de miR-21 em 46 doentes com NSCLC submetidos a tratamento TKI. Análise (F) Correlação entre os níveis de expressão realizada PTEN e a resposta clínica ao TKI. curvas (E) de Kaplan-Meier que descrevem sobrevida global de acordo com a expressão de Pten em 46 pacientes com NSCLC submetidos a tratamento TKI.

PC9 /células GR mostrar resistência significativa ao gefitinib, aumento da regulação do miR-21, a sub-regulação de Pten e activação de Akt, ERK em comparação com células PC9

de forma a testar se o efeito de miR-21 /baixa expressão Pten alta sobre a modulação da sensibilidade de TKI, que seleccionado PC-9, uma a linha celular sensível TKI, e a linha de células resistentes a gefitinib PC-9 /GR (gentilmente fornecida pelo Departamento de Oncologia, Xangai pulmonar Hospital, Universidade Tongji, Xangai) foram induzidas por exposição de PC-9 de células a concentrações crescentes de gefitinib como relatado anteriormente . [19], [20] Utilizou-se o ensaio CCK-8 para detectar a sensibilidade a gefitinib em PC-9 e GR células 9 PC-e descobriram que pc 9-Gr células eram resistentes a gefitinib em comparação com o PC-9 células (Fig. 3A , a Fig. 3B). A IC50 para a gefitinib em PC9 /GR células foram cerca de 2,54 mol /L, 200times mais elevado do que em células PC9 (0,0127 mol /L, P 0,001) (Fig. 3C). Após 72 h de 1 umol /L de tratamento com gefitinib, utilizou-se citometria de fluxo para avaliar a gefitinib induzida taxas de apoptose. Os nossos dados mostraram taxas significativamente mais elevadas de apoptose em células em comparação com PC9 PC9 /GR (15,04% versus 3,08%) (Fig. 3D). dados de qRT-PCR mostrou que o miR-21 era de 3,70 vezes supra-regulada em células PC9 /GR em comparação com células PC9 (Fig. 3E). Utilizando ensaios de transferência de Western, que mostrou perda Pten e activação de Akt e ERK em células PC-9 GR em comparação com as células PC-9, mas não mostrou AKT total e a diferença na expressão de ERK total entre as duas linhas de células (Fig. 3F, 3G).

(a, B) PC-9 e /GR células foram tratadas com gefitinib durante 72 h em 0,1% de soro contendo meio RPMI-9-PC. O crescimento celular foi medido por CCK-8 de ensaio em triplicado. O crescimento celular em 72 h é função da concentração de gefitinib. (C) gefitinib IC 50 em pc-9 e /GR células com ensaios em triplicado realizadas 9 pc-. ** Indica P 0,01. (D) as taxas de apoptose de PC-9 /GR e pc-9 células induzidas por gefitinib foram avaliados por citometria de fluxo. células PC-9 /GR e PC-9 foram tratadas com 1 umol /L gefitinib durante 72 horas antes da avaliação da apoptose. (E) os níveis de expressão relativa de miR-21 em PC-9 e /GR células avaliadas pela haste-laçada qRT-PCR 9-PC, e normalizadas para os níveis de U6. ensaios em triplicado foram realizadas para cada amostra de RNA. As diferenças significativas estão indicadas por * (P 0,05). (F) PTEN p-AKT, AKT, p-ERK, proteínas ERK em PC-9 e /GR células analisadas por Western blot 9-PC. (G) A quantificação da análise de Western blot mostrou que a expressão de proteínas PTEN foi reduzida em-9 PC /célula GR em comparação com as células PC-9 ** P 0,01; p-AKT e p-ERK expressão proteínas foram sobre-reguladas em células PC-9 GR em comparação com o PC-9 células ** P 0,01; não houve diferenças significativas de AKT totais e proteínas ERK totais entre PC-9 e /GR células.

elevada expressão de miR-21 sensibilidade reduzida gefitinib, capacidade invasiva aumentada 9 PC-e gefitinib reduzida induzidos apoptose em células PC-9 por Pten e ativando AKT e ERK vias de regulação para baixo

Os resultados acima descritos mostraram que miR-21 foi regulado para cima e Pten foi regulada para baixo no PC 9-GR células em comparação com PC-9 células. Portanto, temos a hipótese de que o miR-21 /Pten expressão alteração desempenha um papel importante na modulação da sensibilidade gefitinib no PC-9 células e 9-pc /GR células. Nós transfectadas células PC-9 com miR-21 imita e depois co-transfectadas com o plasmídeo nestas células Pten para observar se Pten pode resgatar o miR-21 induziu alterações biológicas em células PC-9. qPCR dados confirmaram que o miR-21 de expressão foi significativamente aumentada em 21 miR-células transfectadas imitam em comparação com as células transfectadas NC, ** p 0,01 (Fig. 4A). Em seguida, foi utilizado o kit de ensaio de CCK-8 para detectar a sensibilidade a gefitinib 24 h após a transfecção. Como esperado, o miR-21 fez reduzir a sensibilidade gefitinib em células PC-9 e sobre-expressão Pten poderia resgatar essa mudança sensibilidade gefitinib. ** P 0,01 (Fig. 4B, 4C). Para observar outras alterações de parâmetros após miR-21 transfecção, foi realizado um ensaio transpoço para determinar a influência de miR-21 sobre a capacidade invasiva. Descobrimos que o miR-21 transfectadas células PC-9 eram mais invasiva do que o grupo CN e a sobre-expressão pode resgatar Pten esta capacidade invasiva ** p 0,01 (Fig. 4D, 4E). A fim de detectar o impacto de miR-21 em gefitinib induziu apoptose, as células acima descritos foram tratados com 1 umol /L gefitinib durante 72 horas. Utilizando citometria de fluxo, verificou-se que, em células PC-9, uma acentuada diminuição na apoptose foi observada in mir 21 células transfectadas imitam em comparação com células NC transfectadas e miR-21 células mímico e plasmídeo Pten co-transf ectadas após tratamento com gefitinib (Fig. 4F). Para melhor compreender os mecanismos moleculares envolvidos na miR-21 induzida resistência gefitinib em células PC-9, ensaios de transferência de Western foram utilizados para avaliar a expressão de proteínas relacionadas. Em células PC-9, a expressão elevada de miR-21 resultou em repressão da expressão Pten e activação de p-AKT e p-ERK em comparação com o grupo NC, mas não alterou a expressão de proteína total de AKT e EKR. A sobre-expressão de expressão Pten pode resgatar a sobre-regulação de miR-21 induzida por activação de p-AKT e p-ERK. (Fig. 4G, 4H).

(A) os níveis de expressão relativos de miR-21 em pc-9 /NC + pCMV 6 células transfectadas, PC-9 /miR-21 imitar + pCMV 6 células transfectadas e /miR-21 transfectadas células plasmídeo + PTEN imitam PC-9 foram avaliadas pela haste-laçada qRT-PCR, e normalizadas para os níveis de U6. ensaios em triplicado foram realizadas para cada amostra de RNA. As diferenças significativas estão indicadas por ** (P 0,01). (B) Sensibilidade a gefitinib de PC-9 /CN + pCMV 6 células transfectadas, PC-9 /miR-21 mímico + pCMV 6 células transfectadas e-9 PC /miR-21 células plasmídeo transfectado + PTEN imitam foram avaliadas por CCK-8 ensaio. (C) IC50 para gefitinib no pc-9 /NC + pCMV 6 células transfectadas, PC-9 /miR-21 imitar + pCMV 6 células transfectadas e /miR-21 plasmídeo transfectado células + PTEN imitar 9 pc-. ** P 0,001, # P 0,01. (D) PC-9 /CN + pCMV 6 células transfectadas, PC-9/21-miR mímico + pCMV 6 células transfectadas e-9 PC /miR-21 transfectadas células plasmídeo + PTEN imitam foram usadas para ensaios de invasão celular. células de invasão coradas por 0,1% de violeta cristal foram contadas 24 h após o plaqueamento. painéis superiores: fotografias representativas das células invasoras (× 200). (E) O número de células invasivas por campo foi obtido a partir de pelo menos três cavidades replicadas e representados pela média ± SD (gráfico inferior). ** Indica diferença significativa entre o PC-9 /CN + pCMV 6 células transfectadas e + pCMV 6 células transfectadas PC-9/21-miR mímico (P 0,01). ## Mostram uma diferença significativa entre o PC-9 /miR-21 + pCMV 6 células transfectadas imitam e PC-9/21-miR mímico + células plasmídeo transfectado PTEN (p 0,01). (F) Apoptose taxas de PC-9 /CN + pCMV 6 células transfectadas, PC-9 /miR-21 mímico + pCMV 6 células transfectadas e PC-9 /miR-21 mímico + Pten células plasmídeo transfectadas induzidas por gefitinib foram avaliadas pela citometria de fluxo. Todas as células foram tratadas com 1 umol /L gefitinib durante 72 horas antes da avaliação da apoptose. (L) PTEN p-AKT, AKT, p-ERK, e ERK proteínas de PC-9 /CN + pCMV 6 células transfectadas, PC-9/21-miR mímico + pCMV 6 células transfectadas e PC-9 /miR- 21 células de plasmídeos transfectados + PTEN imitam foram analisados ​​por Western blot. (H) Quantificação da análise de Western blot mostrou diminuição da regulação das proteínas PTEN em PC-9/21 imita + pCMV 6 células transfectadas em comparação com o PC-9 /+ pCMV 6 células transfectadas NC (* P 0,05) e PC-9 /miR-21 células imitam + PTEN plasmídeo transfectado (# P 0,05); p-AKT e p-ERK proteínas expressão foram regulados positivamente no PC-9/21 imita + pCMV 6 células transfectadas em comparação com o PC-9 /+ pCMV 6 células transfectadas NC (* P 0,05) e PC-9 /miR- 21 células imitam + PTEN plasmídeo transfectado (# P 0,05). Não houve diferenças significativas em AKT total de ERK e proteínas totais entre as três células.

knockdown de miR-21 restaurou a sensibilidade a gefitinib, reduziu a capacidade invasiva aumentada e gefitinib induziu apoptose em PC-9 /GR por células-se-regulação Pten e inactivar o AKK e ERK

Para confirmar ainda mais a função de miR-21 sobre a regulação de sensibilidade a gefitinib em PC-9 /GR células, PC-9 /GR células foram transfectadas com o miR -21 inibidor para diminuir a expressão de miR-21 e, em seguida, co-transfectados com estas células Pten siARN. Em primeiro lugar, testou o efeito do Pten siRNA, nós transfectadas /GR células com dois Pten siRNAs e corrida siRNA (siSCR) 9 pc-. Tanto o Banco Mundial e os ensaios de qRT-PCR mostrou que siPTEN # 1 poderia diminuir a proteína PTEN (Fig. S1A), e nível de expressão de mRNA (Fig. S1B) mais eficaz do que 2 siPTEN #. Por isso escolhemos siPTEN # 1 para fazer ainda mais experiência. qPCR resultados confirmaram que o miR-21 de expressão foi significativamente diminuída em 21 miR-transfectadas células de inibidor em comparação com células NC, ** p 0,01 (Fig. 5A). CCK-8: dados do ensaio mostraram que o miR-21 knockdown diminuiu significativamente a sensibilidade a gefitinib de PC-9 /GR e redução do nível Pten expressão pode restaurar a sensibilidade a gefitinib de PC-9 /GR ** p 0,01 (Fig. 5B, 5C).