Abstract

Purpose

Há uma necessidade de complementar ou substituir o ferramentas de diagnóstico convencionais, ou seja, cistoscopia e do tipo B ultra-som, para câncer de bexiga (BC). Nosso objetivo foi identificar marcadores de metilação do DNA inovadoras para BC através de perfis de todo o genoma de linhas celulares BC e subsequente PCR (MSP) de triagem específico-metilação de amostras clínicas de urina.

Experimental Design by

O metil -ADN técnica de captura de domínio de ligação (MBD), methylCap /SEQ, foi realizada para rastrear específica hipermetilado ilhas CpG em duas linhas de células BC (5637) e T24. Os melhores cem alvos hipermetilado foram sequencialmente pesquisados ​​por MSP em amostras de urina para reduzir gradualmente o número de destino e optimizar a composição do painel de diagnóstico. O desempenho diagnóstico do painel obtido foi avaliado em diferentes cenários clínicos.

Resultados

Um total de 1.627 alvos promotor hypermethylated nas linhas celulares BC foi identificado pela Illumina seqüenciamento. Os Top 104 alvos hypermethylated foram reduzidos a oito genes (vax1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20 e LMX1A) após a triagem DNA da urina em um pequeno tamanho da amostra, de 8 de controlo normal e 18 indivíduos BC. Validação em uma amostra independente de 212 pacientes BC permitiu a otimização dos cinco alvos de metilação, incluindo vax1, KCNV1, TAL1, PPOX1 e CFTR, que foi obtida em nosso estudo anterior, para o diagnóstico BC com uma sensibilidade e especificidade de 88,68% e 87,25 %, respectivamente. Além disso, a metilação do vax1 e LMX1A foi encontrado para ser associado com o BC recorrência.

Conclusões

Identificamos uma promissora painel de marcadores de diagnóstico para detecção não invasiva antecipado e posterior vigilância BC.

Citation: Zhao Y, Guo S, Sun J, Huang Z, Zhu T, Zhang H, et al. (2012) Methylcap-Seq Revela Novos Marcadores de metilação do DNA para o Diagnóstico e Previsão de recorrência de cancro da bexiga em uma população chinesa. PLoS ONE 7 (4): e35175. doi: 10.1371 /journal.pone.0035175

editor: Angela H. Ting, Cleveland Clinic Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de janeiro de 2012; Aceito: 09 de março de 2012; Publicação: 17 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios National Science Foundation (30872963); Laboratório State Key de oncogenes e relacionadas fundação Genes (91-11-01); projeto Medical guia da Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai (114119a4100); subvenções Shanghai Science Foundation (09ZR1429900); e Xangai Cancer Institute, mestre fundação de doutorado (SB09-07). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga (BC) é uma das principais causas de morbidade relacionada ao câncer e mortalidade eo sexto tipo de câncer mais comum no mundo [1]. Na China, a incidência de BC continua a subir [2]. BC incidência aumenta com a idade; a média de idade no momento do diagnóstico é de aproximadamente 60 anos, e é 3 vezes mais comum em homens do que em mulheres [3]. Tabagismo e exposição a agentes cancerígenos foram identificados como fatores de risco [4]. Aproximadamente 75-80% dos novos casos BC ocorrer como superficial ou carcinoma

em lesões in situ

, enquanto a 20-25% restantes presente como uma doença mais avançada, com um prognóstico pobre. No entanto, mesmo nos tumores superficiais, apenas 20% são curáveis. Aproximadamente 60-70% dos pacientes irão recair dentro de 5 anos, e de 10-20% de tumores irão progredir para uma doença mais agressivo [5], o que requer monitorização frequente para a recorrência da doença [6]. Cistoscopia é o procedimento mais comum BC de diagnóstico, e mostra alta sensibilidade (SN) e especificidade (SP). No entanto, cistoscopia requer proficiência alta operador e a natureza invasiva da cistoscopia reduz o seu valor como uma ferramenta de triagem. Outros métodos ideais são necessários para a detecção precoce, não-invasivo e de vigilância da BC.

A faceta epigenética do genoma conecta o genótipo de um indivíduo para influências ambientais que moldam o padrão de transcrição do gene hereditário e portanto, influenciar o fenótipo da célula [7]. Regulação ao nível epigenético é crítico para o desenvolvimento de eucariotas superiores [8], e regulação aberrante pode influenciar directamente e /ou indirectamente o padrão de integridade e a expressão do gene do genoma de células, resultando no desenvolvimento de vários tipos de desordens, incluindo o cancro [ ,,,0],9]. A hipermetilação locais de genes supressores de tumores [10] e a hipometilação de ADN genómico mundial [11], [12], [13], frequentemente, em cancros humanos [14], [15]. Avanços recentes têm mostrado que a hipermetilação anormal de genes supressores de tumores é um biomarcador emergente para o diagnóstico e prognóstico do cancro. Em aC, vários genes metilados foram identificados, e o seu papel como marcadores urinários também foi avaliada [16]. Estes estudos demonstraram claramente as vantagens do uso de múltiplos hipermetilação do gene análises em amostras de tecido e de urina para se obter informação de diagnóstico e de prognóstico. Por exemplo, no nosso estudo anterior, foram identificados um painel de 11 genes metilados que poderiam ser utilizados como marcadores à base de urina para rastreio aC; No entanto, este painel tinham limitações. O número de genes no painel era demasiado grande para o teste clínico conveniente, e a especificidade foi insuficiente [17]. Para melhorar a eficiência de diagnóstico e identificar alvos de genes que podem predizer a recorrência ou progressão, é necessário encontrar novos alvos e validar o seu valor clínico em um grande grupo. No entanto, até agora, poucos estudos BC têm usado uma abordagem de alto rendimento escala genômica para triagem de genes diferencialmente metilados [18], [19]

MethylCap-seq é uma técnica desenvolvida recentemente para a ampla genoma perfis de metilação de DNA; Esta técnica consiste em capturar os fragmentos de ADN metilado por seus domínios de ligação a metil-CpG (MBDS) e a subsequente sequenciação do ADN eluído profunda. Um sal de eluição de gradiente classifica o genoma em fracções com diferentes estados de metilação. Os perfis obtidos deste modo proporcionar um mapa de todo o genoma detalhada das regiões metiladas e permitem a detecção da metilação do DNA em regiões genómicas diferentes [20].

O contexto genómico é definido como aqueles encontrados na base de dados UCSC. A região de metilação diferencial destaque (DMR) de distribuição em CBCs e BMs: (A) de distribuição geral; (B) distribuição no refGene; (C) distribuição em ambos os refGene e CGI.

Neste estudo, utilizado pela primeira vez MBD MethylCap-seq para obter um perfil de metilação global de linhas celulares BC (CBCs), que acreditava que iria fornecer informações sobre metilação aberrante específica-aC. Subsequentemente, o ADN a partir da urina de pacientes com CM foi rastreada para os 100 primeiros alvos hipermetilado de CBCs para identificar locais de metilação específico do BC. Este número diminuiu gradualmente, e a qualidade melhorada do marcador durante as etapas do processo de triagem. Finalmente, adquirimos um novo conjunto de marcadores de metilação do DNA de diagnóstico que podem ser utilizados para a detecção precoce, não-invasivo e de vigilância da BC.

Materiais e Métodos

coleção

Paciente e amostra de controlo

com o consentimento informado ea aprovação do Medical Institutional Review Board of Zhongshan Hospital, Universidade de Fudan, amostras de urina foram coletadas de 212 pacientes com diagnóstico BC confirmada, 41 pacientes com lesões urinário não cancerosos hospitalizados durante o mesmo período de tempo, e 149 controlos normais. Um grupo de amostras de urina anulado emparelhados também foi coletado de 21 pacientes BC antes e após a cirurgia, que incluiu ressecção transuretral de cancro da bexiga mais quimioterapia intravesical (TURBC + IC). Além disso, um outro grupo de 48 amostras de urina foi recolhida a partir de pacientes fortemente suspeita de um tumor maligno da bexiga. Todos os pacientes BC e controles vieram de dois hospitais: o Departamento de Urologia do Hospital Zhongshan, Xangai, China e do Centro de Saúde nº 2 Shimen Comunidade Street, Jingan District, Xangai. As amostras foram coletadas entre 2006 e 2009. O tumor-nódulo-metástase (TNM) /classificação das amostras de pacientes BC foi determinada de acordo ao Comité Misto americana sobre as orientações câncer [21] (Tabela 1). As amostras (50 ml de urina fresca) foram centrifugadas a 3000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi então decantado e o sedimento foi lavado uma vez com 1 × solução salina de tampão fosfato (PBS) e imediatamente congelado a -80 ° C.

A imagem da base de dados peruca UCSC está à esquerda, ea resultado BSP em que pelo menos 5 clones foram sequenciados para cada locus está à direita. O círculo preto indica C metilado no contexto CpG; o círculo branco indica não metilado C no contexto CpG

linhas de células e tecido normal da bexiga mucosa

Dois CBCs, T24 (ATCC No: HTB-4). e 5637 (ATCC n : HTB-9), foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas até atingirem a fase logarítmica em meio L-DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C numa atmosfera de 5 % de CO

2 incubadora humidificada. As células foram colhidas por raspagem, e as pelotas de células foram lavadas duas vezes com 1 x PBS. Dois tecidos da bexiga mucosas normais (BM1 e BM2) foram obtidos de doadores de órgãos saudáveis. Por razões económicas, as duas CBCs foram reunidas para construir a biblioteca BCC, como foram as duas amostras BM. Desta forma, poderíamos adquirir todas as informações metilação de cada uma das 2 amostras.

informações MBD methylCap-seq foi usado para selecionar genes diferencialmente hypermethylated no cancro da bexiga. O número da amostra na figura refere-se ao do processo de triagem. O estado de metilação do gene alvo foi rastreada em amostras com tamanhos diferentes. Nesta fase, o número de amostras aumentou progressivamente, enquanto que o número de genes diminuiu progressivamente.

MBD-methylCap-sequenciação

Uma preparação de ADN a partir de tecidos congelados e linhas celulares foi gerado utilizando um /método de extracção orgânico convencional proteinase K como anteriormente descrito [22]. Quantidades iguais de ADN das células 5637 e T24 foram combinadas para formar a biblioteca de BCC, e quantidades iguais de ADN a partir das células BM1 e BM2 foram combinadas para formar a biblioteca BM. Em 1,5 mL tubos de centrífuga, 1,5 ug de ADN das amostras combinadas (BCC ou BM) em 100 ul de tampão TE foram sonicados para produzir a gama de tamanhos desejada (200-300 pb). -Reparação final, de adição de base de adenosina e de ligação do adaptador passos foram realizados como previamente descrito [23].

O ™ comercial MethylMiner ADN metilado Enriquecimento Kit (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, EUA) foi utilizado para seleccionar metilado DNA para sequenciamento. Para cada grupo, 1,2 ug do ADN tratado foi processado de acordo com o protocolo do fabricante. Após uma eluição gradiente de NaCl, foram coletadas as duas últimas fracções de DNA altamente metilado, o que correspondeu a 1 M e as concentrações de 2 M de NaCl. O ADN de controlo ponto-a fornecido pelo kit foi usada para confirmar a precisão do ensaio. O DNA recuperado (na gama dos nanogramas) foi quantificada por Qubit ™ (Invitrogen), e 12 ciclos de amplificação por PCR foram realizadas para obter material suficiente (na gama de microgramas) para sequenciação de profundidade. Finalmente, um ug do produto de PCR foi aplicado ao genoma Analyzer II (Illumina, Inc., San Diego, CA) para gerar 75 pb de comprimento desemparelhado lê. duplicados de PCR foram retirados da análise. Usamos ferramentas de alinhamento BWA com as configurações padrão para mapear essas leituras para o conjunto hg19 humana referência genoma (UCSC) [24]. Em seguida, os picos (regiões hypermethylated) foram identificados utilizando software MACS [25], e as ilhas de CpG humanos (CGI) foram transferidos do banco de dados UCSC. O perfil de metilação do genoma gerado foi carregado para uma base de dados pública (Gene Expression Omnibus: GSE 33839)

MSP e BSP

conversão de bissulfito e análise de PCR foram realizadas como descrito anteriormente [22] . A sequenciação de bissulfito de PCR (BSP) e pares de iniciadores específicos de metilação de PCR (MSP) foram concebidos com o auxílio do software em linha apropriada (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html; Tabela S1, S2 Tabela). Os produtos de MSP foram clonados e verificados por sequenciação. O

In vitro

ADN metilado das células 5637 e T24 foi obtido com o CpG Sss metiltransferase M. I (NEB) e utilizado como um controlo positivo. A água foi utilizada como um controlo sem modelo. bissulfito sequenciação foi realizada como descrito anteriormente [17], e os fragmentos amplificados por PCR foram purificados em gel e clonados num vector pBS-T II (TianGen Incl., Pequim, China). Pelo menos 5 clones foram sequenciados individualmente para determinar os padrões de metilação do locus alvo. A porcentagem de metilação BSP foi calculado como o número de citosinas metiladas, dividido pelo número total de citocinas em todos os amplicons analisados.

Estatísticas

As principais endpoints estatísticos deste estudo consistiu em comparar a metilação status de genes que poderia estar associada com BC e as variáveis ​​clínicas relevantes nos pacientes do grupo controle e câncer. A presença ou ausência de metilação usando MSP foi avaliado para determinar as associações entre estado de metilação e câncer ou de suas variáveis ​​clínicas usando tabulações cruzadas eo ×

2 ou exatas testes t de Fisher apropriado. A associação do BC recorrência com a metilação do gene e as variáveis ​​clínicas foi avaliada através de análises de logística regressão uni e multivariada. O resultado seleccionado para a análise de seguimento foi o risco cumulativo de recorrência, o qual foi definido como o tempo desde o diagnóstico aC até a data de recorrência do tumor. modelos uni e multivariada riscos proporcionais de Cox foram utilizados para avaliar os efeitos da metilação do gene e outras variáveis ​​clínicas de recidiva da doença. A curva de recorrência de risco cumulativo foi gerado pelo método de Kaplan-Meier e verificado pelo teste de log-rank. Todos os cálculos estatísticos foram realizados utilizando o software SPSS 13.0 pacote estatístico (SPSS Inc., Chicago, IL). Os valores de P duas faces inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

A regressão logística univariada múltipla foi realizada com a utilização de dados de metilação os 9 genes para avaliar a relação entre a metilação do gene e as características clinicopatológicas de BC. Os pormenores encontram-se descritos no texto. * P . 0,05

Resultados

Genomic perfis de metilação das bibliotecas BCC e BM revelou padrões de metilação característicos em BC

Nós perfilado a genome- ampla estatuto de metilação do DNA das bibliotecas BCC e BM gerando bibliotecas de DNA MBD-methylCap enriquecidas. As fracções MBD-enriquecidos foram submetidos a sequenciação de alto rendimento utilizando uma Illumina Genome Analyzer II para se obter mapas de metilação abrangentes. Conceptualmente, os fragmentos de ADN hipermetilado foram enriquecidas durante o processo de construção da biblioteca; Por conseguinte, a sequenciação adquiridas lê correspondência com as regiões hipermetilado no genoma. sequenciação profunda das bibliotecas preparados BCC e BM produziu aproximadamente 6.000.000 lê-se (75 bases /li) de cada biblioteca, que foram derivados a partir de cerca de 470 milhões de bases (Tabela S3). Esta quantidade de bases de sequenciação pode cobrir o CGI genómico em cerca de 10 vezes a profundidade. Assim, os conjuntos de dados fornecida com êxito as informações de todo o genoma.

Quando estas leituras foram mapeados no genoma, a distribuição desigual formado picos que representam as regiões hypermethylated do genoma. No total, obtivemos 210,051 picos (comprimento de picos dizer: 778 pb) nos CBCs e 229,538 picos (comprimento de picos dizer: 659 bp) na BMs (

P Art 0,001, MACS2.0; tabela S3).

Para obter as informações metilação relativa, foram comparados os picos entre os CBCs e BMS. Quase dois terços do total dos picos eram comuns entre as duas bibliotecas, e ignorou-os para esta análise. O restante um terço dos picos eram únicos, quer os CBCs ou BMS, o que foi denominado as regiões diferencialmente metilados (DMRs) que representam o estado de metilação relativamente elevada das regiões genómicas em comparação com o seu homólogo. Obtivemos 70,432 e 83,690 DMRs nos CBCs e BMS, respectivamente (Tabela S3, A Figura 1 A). Esta grande quantidade de DMR foi dispersa em diferentes contextos genômicas, e analisamos a associação da DMR com os diferentes contextos genômicos. O DMR relacionados com refGene foi 55237 e 45522 nos CBCs e BMS, respectivamente, indicando uma distribuição mais ou menos equilibrada em ambas as bibliotecas (Tabela S3, a Figura 1 B). No entanto, quando DMRs dentro do CGIs foram investigados, descobrimos que os CBCs retidos 21,179 DMRs, enquanto o BMs manteve apenas 1.945; isto representa uma diferença de dez vezes. Quando os DMRs que ocorreram dentro do CGIs do refGene foram estudados, os CBCs e BMs continha 4.256 e 201 DMRs para cada biblioteca, respectivamente. Por último, quando o envolvimento promotor foi calculado, 1.627 e 66 DMRs foram associados na região nos CBCs e BMS, respectivamente (Tabela S3, a Figura 1 C). Tomados em conjunto, hipermetilação aberrante ocorreram com maior frequência no CGIs e as regiões promotoras dos CBCs. Os seguintes estudos da seleção metilação marcador focada em promotores BCC.

Validação do perfil de metilação BCC distinta usando bisulfite sequenciamento

Para confirmar que a biblioteca refletido com precisão a real situação metilação do material estudado , foram selecionados 24 alvos diferentes hypermethylated para verificação seqüenciamento bissulfito. Destes, 22 alvos foram espalhados dentro dos 1.627 DMRs relacionados com o promotor na CBCs, incluindo 17 das 100 maiores alvos e 5 do 100 a 1.627 gama; os outros 2 alvos eram a partir das 66 DMRs no BMs. Encorajadoramente, entre os 24 alvos a ser verificado, os resultados BSP de 23 genes foram altamente consistente com a informação de metilação adquirido na biblioteca (um resultado representativo é mostrado na Figura 2, Tabela S4), o que sugere que as bibliotecas de BCC e BM foram altamente fiável para obter informações metilação. Para avaliar o potencial da biblioteca para propor objectivos de diagnóstico clínico, buscamos as informações metilação dos alvos identificados no nosso trabalho anterior nestas duas bibliotecas [17]. Um total de 90% (19/21) dos alvos foram hipermetilado na biblioteca BCC (dados não mostrados). Além disso, também investigamos os marcadores específicos do BC relatados por outros [19], [26]. Oito dos 9 alvos estavam localizados em nossa biblioteca BCC como loci hipermetilação. Tomados em conjunto, os presentes bibliotecas BCC e BM forneceu informações hipermetilação som com respeito ao status BC.

triagem MSP em um pequeno grupo de amostras de urina para os potenciais biomarcadores gerado 8 genes alvos

Apresentado com a grande informação metilação aberrante fornecida por methyCap-seq, precisávamos de um método para filtrar os resultados de metilação BCC para identificar marcadores BC viáveis. Nós adoptada a estratégia de iniciar o processo de triagem com um grande número de alvos em algumas amostras e reduzindo, gradualmente, os alvos com um aumento em amostras (Figura 3). Quando submetido às limitações MSP, apenas a parte superior 104 dos 1.627 promotores hypermethylated dos CBCs foram selecionados nas amostras de DNA de urina de 8 controles normais (BNS); as mesmas amostras de BCC e BM utilizados na porção MethylCap-seguintes do estudo foram incluídos como controlos. Nestas condições, apenas os alvos que mostraram metilação em pelo menos uma das duas CBCs mas não em mais do que 2 dos 8 BN procedeu-se à próxima rastreio (MSP resultado representativo é mostrado na Figura S1). Porque eles não atender a esses critérios, 55 alvos foram retirados da primeira rodada de triagem. Quarenta e nove alvos procedeu-se à segunda rodada de triagem DNA urina de um adicional de 8 RBs e 18 pacientes BC. Nós selecionamos os alvos que mostraram metilação em pelo menos 3 das amostras BC 18, mas 0 ou 1 dos 8 BN amostras. Nesta etapa, 8 genes (vax1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20 e LMX) reuniu-se as condições e foram selecionados por seu potencial para discriminar BC da BN (Figura 3).

Avaliação do valor de diagnóstico das 8 metas em uma grande coorte

Para garantir que o potencial dos alvos candidatos BC foi avaliado de forma fiável, nós analisamos os 8 candidatos em uma coorte de teste independente com um grande tamanho da amostra. Obtivemos amostras de urina de uma grande coorte (n = 402), que incluiu 212 pacientes BC, 149 controles normais e 41 pacientes com lesões urinário não cancerosos.

A frequência de metilação dos 8 novos genes no DNA da urina pacientes BC (212 casos) variou de 9,43% a 42,45%, enquanto que a frequência de metilação em controles normais (149 casos) variou de 1,34% para 6,04%. Todos os 8 alvos mostrou uma diferença significativa entre os tumores e controles normais (

P Art 0,0001)., Que favoravelmente defendeu seu uso potencial como marcadores de diagnóstico (Tabela 2)

Para diferenciar tumor metilação espec�ico de possíveis metilação associada à doença benigna, 41 lesões urinário não cancerosos foram incluídos em nosso estudo (Tabelas 1 e 2). A frequência de metilação dos 8 genes neste grupo de doentes variaram de 0,00% a 12,19%, apoiando a noção de que a origem da hipermetilação foi mais intimamente ligados a tumores do que a doença benigna (

P

0,04; Tabela 2). Portanto, estes 8 alvos podem potencialmente servir como marcadores para a detecção clínica de BC e distinguir BC dos controles normais e lesões benignas urinário.

Dada a natureza heterogénea de metilação do tumor, um único marcador metilado não pode fornecer SN adequada e SP para o diagnóstico do tumor [27]. Portanto, a combinação de um grupo de genes como um painel era uma opção alternativa [28]. Tomando a área sob a curva (AUC) na forma de um julgamento de capacidade de diagnóstico, uma combinação de 4 genes (vax1, KCNV1, TAL1, PROX1) foi seleccionado para formar um painel de diagnóstico, o que mostrou um SN de 76,89% e SP de 88,59% (Tabela S5).

para melhorar ainda mais o potencial diagnóstico deste painel, nós adicionamos CFTR e SALL3, os dois alvos BC topo do nosso trabalho anterior [17], que também foram localizados dentro dos 1.627 promotores relacionadas com DMRs nos CBCs. O CFTR exibiu potencial decente para diagnosticar BC, com uma SN e SP de 52,36% e 96,64%, respectivamente (Tabela 2). No entanto, SALL3 não apresentou uma boa SP numa coorte de avaliação em grande e, por conseguinte, foi removido (dados não apresentados). Finalmente, um painel de 5-gene (vax1, KCNV1, TAL1, PROX1 e CFTR), foi adoptada, que revelou a eficiência de diagnóstico, com SN, SP, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) de 88,68%, 87,25% , 90,82% e 84,42%, respectivamente (Tabela 2). Os resultados semelhantes também foi obtaind numa análise de validação pequena coorte independente consistia de 24 aC e 22 controlos (dados não mostrados).

A capacidade de diagnóstico do painel de cinco gene é comparável à cistoscopia

o desempenho dos cinco objectivos na avaliação de pacientes suspeitos clínicos é crítica. Portanto, utilizou-se MSP para avaliar a urina de pacientes suspeitos que tinham doenças malignas uroepiteliais. Dos 48 pacientes, 32 pacientes foram eventualmente BC confirmada por cistoscopia, e 25 destes eram MSP-positivos para pelo menos um dos cinco genes. Dos 16 pacientes que não apresentaram doença maligna por cistoscopia, 14 foram negativas para MSP. Portanto, a meta de 5 gene mostrou boa conformidade com a cistoscopia (81,25%; 25 positivas e 14 negativas em um total de 48 pacientes por ambos os procedimentos).

O painel de cinco gene também poderia prever a eficácia da cirurgia ressecção

Todos os 21 (100,0%) dos pacientes BC foram MSP-positivos para pelo menos um dos 5 genes antes da cirurgia, enquanto que apenas 2 dos 21 pacientes BC (9,5%) manteve loci genéticos MSP-positiva após a cirurgia (

P Art 0,0001). Estes resultados adicionar suporte adicional para nossa descoberta anterior e hipótese [17] e corroboram a ideia de que existe uma relação estreita entre a metilação do observado em sedimentos de urina eo tumor da bexiga correspondente.

A hipermetilação do vax1 e LMX1A é importante para prever a recorrência do câncer

Além da relação entre o estado de metilação dos genes e do fenótipo maligno do tumor em si, nós também estudaram a associação entre alvos metilados e diferentes parâmetros clínicos.

o múltiplo análise logística regressão univariada de 9 genes alvos (vax1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, Tal1, PROX1, SLC6A20, LMX1A e CFTR) mostrou que vax1 e metilação LMX1A foi mais comum em amostras de urina de casos recorrentes do que em amostras de casos primários em a análise inicial de 212 pacientes BC (preliminar: 157; recorrência: 55), com HR = 2,37 (95% CI, 1,27-4,44, P 0,05) e HR = 2,59 (95% CI, 1,01-6,65, P 0,05 ), respectivamente (Figura 4). modelos logístico-de regressão multivariada revelou que o RH da vax1 e LMX1A foram 2,27 (95% CI, 1,20-4,32;

P

= 0,047) e 2,63 (IC 95%, 1,01-6,85;

P

= 0,012), respectivamente (Tabela 3). E a associação foi mais evidente quando estes dois genes foram analisados ​​em combinação com HR de 4,73 (IC 95%, 1,39-16,08;

P

= 0,013). A estreita associação destes dois genes com recorrência foi evidente nos dados de acompanhamento com base em 145 casos (sem recorrência: 108; recorrência: 37) com informações intactas de acompanhamento. Multivariada modelo proporcional de Cox revelou que o RH da vax1 e LMX1A foram 2,11 (95% CI, 1,08-4,11;

P

= 0,029) e 3,31 (IC 95%, 1,27-8,59;

P

= 0,014; Tabela 4), respectivamente. A combinação dos dois genes revelou uma elevada RH mais de 7,25 (IC de 95%, 2,41-21,79;

P

= 0,014). Além disso, gráficos de Kaplan-Meier revelou que o risco cumulativo de recorrência em vax1 metilado e não metilado e LMX1A diferiram significativamente (

P = 0,034

e

P

= 0,013, respectivamente). Mais sigficance foi obtida quando vax1 e LMX1A analisados ​​em conjunto (

P Art 0,0001, Figura 5). A validação em um pequeno grupo independente consistiu em 24 aC e 22 controles revelou a mesma tendência com HR 9,11 (IC 95%, 0,89 a 93,7,

P

= 0,063) para a combinação de dois genes com significância marginal possuir a o pequeno tamanho da amostra talvez (dados não mostrados). Essas observações ressaltam a importância para a determinação do estado de metilação de vax1 e LMX1A para o prognóstico da recorrência da doença.

Em additioin para LMX1 /vax1, Nós também tentou avaliar o envolvimento dos outros 7 genes em formato de dois combinação de pares gene-. O estado hipermetilação em alguns destes genes mostraram alta coincidência com BC recidiva, no entanto, esta associação não pode ser sustentado na análise dos dados de follow-up. Portanto, a metilação aberrante nesses genes poderiam ser os resultados, em vez de o gatilho do BC recorrência.

O estado de metilação de ECEL1 e TMEM26 foi significativamente relacionado com um elevado grau de diferenciação do tumor, com HR = 2,43 (95% CI, 1,19-4,97; P = 0,01) e 2,32 (95% CI, 1,11-4,85;.

P

= 0,03), respectivamente (Figura 4), o que sugere que eles estão envolvidos em progressão BC malignidade e

Discussão

neste estudo, nós relatamos os detalhes do estabelecimento de biomarcadores relacionados ao BC metilação, que são os seguintes: (i) o perfil de metilação global de ambas CBCs e BMs por MBD methylCap-seq ; (Ii) aberrantes de metilação do DNA BC mapas através da comparação do perfil de metilação dos CBCs com SC; (Iii) um painel de prometer metas de metilação específicas para BC; (Iv) dois alvos de genes informativos informativos para BC recorrência; e (v) dois genes de metilação associados com BC diferenciação histológica.

linhas celulares de cancro estabelecidas são geralmente esperado para compartilhar muitos (se não todos) os recursos genéticos e epigenéticos com tumores

in vivo

e linhas celulares de cancro são largamente usados ​​para estudos tumorigénese. Um estudo do cancro colorectal humano verificou que as linhas celulares de cancro 6 teve padrões de metilação que eram muito semelhantes aos do tumor primário em relação aos 60 genes alvos metilação [29]. Por isso, começamos o nosso perfil de metilação do genoma com CBCs e usou o rastreio amostra clínica para reunir informações específicas do BC metilação.

As estimativas de Kaplan-Meier de sobrevida livre de recidiva na coorte de acompanhamento de 145 pacientes de acordo com a presença de vax1 metilado e LMX1A (a e B). Vax1 ou metilação LMX1A foi significativamente associada com mau prognóstico para pacientes BC (P = 0,034 e P = 0,013, respectivamente). Análise de dois genes combinados mostra mais poder de estática (P 0,0001).

Muitos genes foram relatados para ser hipermetilado no BC. Recentemente, estudos com novas abordagens de triagem, como matrizes de metilação, identificaram marcadores de metilação com alta SN e SP [30], [31], [32]. Esta abordagem de rastreio genómico proporciona um método eficaz e fiável para o estabelecimento de um perfil de metilação aberrante associada com a doença. Adotamos a técnica methylCap-seq MBD em nossos estudos porque é uma plataforma aberta para a novela loci metilação sem o conhecimento sequência local antes. Portanto, nós analisamos CBCs e comparou-os a BMS para tentar descobrir informações BC metilação aberrante.

Além do estado do gene promotor metilação, obtivemos as informações do perfil de metilação do genoma global, que inclui diferentes contextos genômicas , como potenciadores, reguladores a jusante, a 5’UTR, exons, introns e microRNAs. A validade dos status de metilação comparativos foi confirmada pela BSP e MSP. Isto representa mais informações de metilação do DNA de diferentes características contexto genômico do que a metodologia matriz, que é limitada por sequências de sonda.

Um método diagnóstico com alta SN e SP é importante para qualquer teste clínico relacionado. Houve vários relatos sobre o perfil de metilação de sedimentos de urina para detecção BC [17], [19], [26], [33], [34], [35], [36]. As técnicas utilizadas nestes estudos incluem convencional MSP, qPCR, aninhado-MSP, e MethyLight. Os painéis marcador de diagnóstico são geralmente compostas de 3 a 11 genes alvos que variam em SN de 77% a 94% e SP de 67% a 100% (Tabela S6).