Abstract

O câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo. instabilidade cromossômica (CIN) é uma importante força motriz da estabilidade de microssatélites (MSS) CRC esporádica. CIN tumores são caracterizados por um grande número de aberrações cromossómicas somáticas no número de cópias (SCNA) que afectam frequentemente oncogenes e genes supressores de tumor. O principal objetivo deste trabalho foi identificar novos candidatos genes CRC motorista afetadas pela recorrente e SCNA focal. comparativa hibridação genoma (CGH) matrizes genome-wide de alta resolução foram usados ​​para comparar tumor e DNA normal para 53 casos CRC esporádicos. Contexto corrigido aberração comum (COCA) análise e personalizados algoritmos identificados 64 supressões e 32 ganhos das regiões focais mínimas comuns (FMCR) em alta freqüência ( 10%). A comparação desses FMCR com perfis genômicos publicados a partir CRC revelou sobreposição comum (42,2% de eliminações e 34,4% de cópia ganhos). análise de caminho mostrou que a apoptose e sinalização p53 caminhos eram comumente afetada por FMCR excluído e MAPK e as vias de canais de potássio por ganhos de FMCR. genes supressores de tumor candidato em FMCR excluído incluiu

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2 e NFKBIA Comprar e candidatos oncogenes em FMCR ganhou incluídos

PRDM16

,

TNS1, RPA3 e KCNMA1

. Em conclusão, este estudo confirma algumas aberrações previamente identificadas nos MSS CRC e fornece

in silico

provas para alguns genes motorista candidato novos

Citation:. Burghel GJ, Lin WY, Whitehouse H, Brock I , Hammond D, Bury J, et al. (2013) identificação de genes candidatos motorista em comum Focal aberrações cromossômicas de microssatélites Estável câncer colorretal. PLoS ONE 8 (12): e83859. doi: 10.1371 /journal.pone.0083859

editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de julho de 2013; Aceito: 08 de novembro de 2013; Publicação: 18 de dezembro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma Universidade de Sheffield (Faculdade de Medicina Dentária e Saúde) bolsa de doutorado, e Pesquisa e prêmio Inovação, e uma Yorkshire Cancer Research PhD bolsa de estudo (S003PHD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum em homens ea segunda em mulheres [1]. Mais de 1 milhão de novos casos de CRC são diagnosticados anualmente e ~ 600.000 mortes relacionadas foram estimados em todo o mundo no ano de 2008, fazendo CRC a 3

rd maior causa de câncer morte relacionada em ambos os sexos [1,2]. instabilidade cromossômica (CIN) é a forma mais comum de instabilidade genômica no CRC e está associada com 65-85% dos casos esporádicos CRC [3-6]. Os tumores que se desenvolvem através da via CIN são caracterizados por numérica frequente e /ou ganhos e perdas estruturais de segmentos cromossómicos ou cromossomas inteiros, a uma taxa significativamente aumentada em comparação com as células normais [7]. CIN tumores são conhecidos por estarem associados com

TP53

mutações e baixos níveis de instabilidade microssatélite (MSI) [8,9]. CIN é pensado para impulsionar o desenvolvimento CRC através do número de cópias do ganho de oncogenes, tais como

MYC

ea supressão dos genes supressores de tumor, tais como

SMAD4

e

TP53

[3,9 -13]. Esta visão é apoiada pela associação observada entre as alterações no número de cópias de genes relacionados ao câncer, e seus níveis de expressão em amostras de CRC [14-16].

Embora a maioria das aberrações cromossómicas surgem de forma aleatória, alguns são recorrentes e são comumente encontrados em outros tipos de câncer, além de CRC [13,16,17]. O aumento da frequência de alguns somáticas aberrações no número de cópias (SCNA) é provavelmente um resultado da selecção clonal durante o desenvolvimento do tumor. Recorrente SCNA fornecer o tumor com um caminho de direccionamento genes supressores de tumor e oncogenes para adquirir uma ou mais das características de cancro e conduzir a tumorigénese [13]. Várias anomalias cromossómicas comuns têm sido identificadas através de técnicas citogenéticas convencionais, tais como hibridação metáfase genoma comparativa (CGH) e a hibridização in situ fluorescente (FISH) [18-20]. Estes defeitos cromossômicos incluem ganhos de 8q, 13q e 20q e perdas de 18q, 5q, 8p, 17q [18,20]. No entanto, devido ao seu grande tamanho, a identificação de genes específicos dentro do controlador estas regiões é problemática [16,17,21].

O uso de CGH-array com base permite a aquisição de informações de todo o genoma, com alta resolução (para baixo a algumas quilobases) e a identificação de regiões focais e mínimas comuns (FMCR) [16,17]. FMCR são geralmente menores que 3MB em tamanho e, portanto, conter um número relativamente pequeno de genes, por conseguinte, simplificar a identificação de genes de driver [16,17]. Recentemente, FMCR levaram à identificação de genes motorista câncer novos com potencial valor terapêutico e prognóstico em vários tipos de câncer, incluindo CRC [16,17,22-27]. O principal objetivo deste trabalho foi aplicar uma série de abordagens analíticas baseadas em dados de CGH com base na matriz de alta resolução para um conjunto de esporádica microsatélites estáveis ​​tumores (MSS) CRC tanto para replicar observações de aberrações identificadas em estudos anteriores e identificar novos candidatos genes motorista CRC.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

sujeitos deram consentimento informado por escrito para dados e coleta de amostras e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa South Yorkshire (Reino Unido) (09 /H1310 /54).

Os sujeitos do estudo e amostras de DNA

As amostras de tecido foram disponível a partir de 53 pacientes com tumores colorretais MSS. Trinta e oito destes foram submetidos a cirurgia para um tumor colorretal primário no Sheffield Real Hallamshire e os hospitais Sheffield Northern gerais (março de 2001 – junho de 2005). Quinze das amostras de tecidos de casos eram de banco de tecidos Sheffield Real Hallamshire Hospital (HTA License 12182). Antes de inclusão no estudo, o estado do tumor de todas as amostras foi confirmada por um patologista (JB). Todas as amostras de tecido de tumor foram micro-dissecadas antes da extracção do ADN, de tal modo que o material extraído continha pelo menos 80% de células cancerosas. As amostras de ADN a partir de sangue periférico ou tecidos normais do cólon também estavam disponíveis a partir de todos os pacientes recrutados. Dados adicionais, incluindo: sexo, localização do tumor, grau de diferenciação, palco e idade do diagnóstico estavam disponíveis a partir dos registros de patologia (materiais e métodos S1). O DNA genômico foi extraído do tumor, o tecido normal e amostras de sangue periférico usando o QIAamp DNA Minikit, (Quiagen, Hilden, Alemanha).

Estado da MSI

O status MSI de todo o DNA do tumor amostras foi determinada utilizando o kit de MSI Analysis System, v1.2 (Promega, Madison, EUA), com base nos marcadores microssatélites mononucleótido de MTD-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e MONO-27. Os produtos de PCR foram separados por electroforese em capilar utilizando um ABI Prism

TM 3730 Analisador de ADN e analisadas usando software de GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems, Warrington, UK). As amostras sem quaisquer marcadores instáveis ​​foram classificados como MSS [28]. O kit de análise MSI também inclui 2 marcadores penta-nucleotide altamente polimórficos que foram usados ​​para verificar a identidade da amostra.

Sequenciamento e análise de mutação

Para a análise de mutação do

BRAF

exão 15 ,

KRAS

exão 2,

APC região dos cluster de mutação (MCR),

TP53

exons 4-9 e

PIK3CA

exons 9 e 12, a exões respectivos foram amplificados por PCR (As sequências dos iniciadores enumerados em Materiais e Métodos S1), e sequenciado utilizando Prism

TM Big Dye Terminator v3.1 prototcol padrão (Applied Biosystems). dados da sequência foram analisados ​​utilizando o software STADEN [29] e as mutações foram confirmadas por comparação com a sequência de referência NCBI. números de acesso são fornecidos em Materiais e Métodos S1.

aCGH profiling

Agilent Whole Genome CGH matrizes 4x44K (projeto ID 014.950) e 4x180K (projeto ID 022.060) foram aplicadas em 6 e 47 amostras, respectivamente (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). As matrizes continham sondas de oligonucleotídeos 60 mer para 42.494 (44K) e 170.334 (180K) localizações cromossômicas distintas com espaçamento médio sonda de 43kb (44K) e 13kb (180K). As análises foram realizadas de acordo com a base de matriz-oligonucleótido Agilent CGH protocolo v6.0. avaliação da qualidade das matrizes foi baseado na relação entre log derivado spread (DLRS), intensidade do sinal e reprodutibilidade, o ruído de fundo, a colocação da grade da matriz e sondas outlier apresentados pelo software de extração de características Agilent (v 10.5.1.1) como 11 métricas QC bem definidas ( microarray informações de acesso a dados:. GSE 418.413)

array CGH análise de dados

a análise aCGH foi realizada utilizando o software bancada genômica Agilent (v 5.0.14). SCNA foram detectadas utilizando o algoritmo de pontuação intervalo qualidade ponderada, também chamado de método de detecção aberração 2 (ADM2) algoritmo (Threshold: 6,0) com a centralização padrão e distorcido correção de zero. Filtros de recurso padrão e aberrações foram aplicados e réplicas de sondas intra-matriz foram combinados. As amostras de tumor foram considerados cromossomicamente instáveis ​​se foram [8] identificou uma ou mais aberrações significativas. Recurrent SCNA foram identificados usando o contexto corrigido aberração comum algoritmo (COCA) com um alcance cromossômico, um valor p de 0,05 e limite de sobreposição de 9,0.

FMCR foram definidas como regiões que são menos de 3Mb em tamanho e definida por pelo menos dois de contacto independente ou SCNA sobreposição (considerados como eventos de tamanho de determinação (SDE)). A frequência mínima de 10% dos casos e uma pontuação COCA de ~ também foram obrigados 2.0 (valor-p = 0,01).

Técnico validação

A fim de validar os resultados aCGH, foram realizados 2 experimentos duplicados usando 44K e 180K matrizes. Além disso, três FMCR (2 deletada e uma amplificada) foram confirmados usando o número de cópia de PCR quantitativa.

Análise TP53

LOH com base nos resultados de sequenciamento foi usado para confirmar as exclusões 17p.

Resultados

CIN, MSI e estado de mutação

As 53 amostras selecionadas para este estudo foram MSS. A análise do

APC, TP53

,

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

mutações indicam que a frequência e padrão destas mutações de acordo com publicado anteriormente dados sobre MSS esporádica CRC [30-33] e (https://www-p53.iarc.fr/index.html). Dos 53 casos de CRC analisados ​​com sucesso através de array CGH, 5 não tinha aberrações significativas e foram considerados cromossomicamente estável. O algoritmo ADM2 não conseguiu chamar aberrações para 2 amostras e mais uma amostra falhou em 4 métricas QC. Um resumo das características moleculares das 53 amostras é apresentada na Tabela S1 S1 Arquivo.

Distribuição de Common SCNA

Um total de 3097 SCNA foram identificados nos 45 casos cromossomicamente instáveis. O número de SCNA por amostra variou de 1-411, com mediana de 43 por amostra. SCNA variaram em tamanho de 0.014Mb-147.48Mb (mediana: 2.29Mb). Uma visão geral do padrão e as frequências destes SCNA é apresentado na Figura 1. Os ganhos mais comuns eram nas regiões do cromossoma 20q (73,3%, n = 33), 13 (57,8%, n = 26), 8q (53,3%, n = 24), 7 (51,1%, n = 23) e X (51,1%, n = 23) e as deleções mais comuns foram realizadas em regiões do cromossoma 18 (55,6%, n = 25), 8p (51,1%, n = 23) e 17p (51,1%, n = 23). Algumas destas regiões contêm genes motorista CRC-chave, tais como

MYC Restaurant at 8q,

SMAD4 Restaurant at 18q e

TP53 Restaurant at 17p. Um resumo do SCNA para cada amostra são apresentadas na Tabela S1 no ficheiro S1 e Figura 2.

de dados a partir do formato de matriz 180K são mostrados. O vermelho representa ganhos e verde representa as eliminações. O eixo Y reflecte frequência.

Representação de toda a CNA identificou em 40 casos cromossomicamente instáveis ​​analisados ​​utilizando a plataforma de 180K. O vermelho representa ganho e verde representa a eliminação. As linhas pontilhadas marcar centrômeros. características moleculares e clínicos em ordem de cima;

PIK3CA

,

APC

, TP53, KRAS e BRAF estado de mutação (azul e branco representa mutante e WT respectivamente), CIMP (vermelho, laranja e verde representam CIMP-H, CIMP-L e CIMP-N, respectivamente), sexo do paciente (rosa e cinza representam feminino e masculino, respectivamente) e localização do tumor (amarelo e ciano representam proximal e distal, respectivamente).

análise de aberração comum e FMCR

out of the 3097 SCNA identificados nas 45 amostras cromossomicamente instáveis, 1689 aberrações foram focal ( 3.0MB) variando em tamanho de 0.014Mb até 3.00Mb (mediana: 0.71Mb). As aberrações focais consistiu de 746 ganhos cópia com uma gama de tamanhos de 0.014Mb-2.99Mb (mediana: 0.92Mb) e 943 eliminações, com uma gama de tamanhos de 0.025Mb-3.00 Mb (mediana: 0.58Mb). Para identificar análise FMCR, coca combinada com as definições descrito nos métodos foram aplicados sobre a saída de ADM-2 e esta análise resultou na identificação de 64 e 32 deleções ganhos que satisfazem os critérios FMCR. A 64 excluído FMCR variaram de tamanho entre 0.03-2.64Mb (mediana: 0.42Mb) e continha um total de 714 genes conhecidos com uma gama de 0-69 genes suprimidos por região (mediana de 4 genes) (Tabela S2 em S1 Arquivo) . A 32 ganharam FMCR variou entre 0.03-1.96Mb em tamanho (mediana: 0.83Mb) e continha um total de 288 genes conhecidos com uma gama de 0-34 genes ganhou por região (mediana: 3 genes) (Tabela S3 em S1 Arquivo) .

Identificação de genes de câncer conhecidos na FMCR

Para identificar genes de câncer conhecidos dentro do excluído e ganhou FMCR, as listas de genes FMCR foram comparados com ambos lista gene completo do projeto censo gene do cancro ( https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census/~~number=plural, acessado em junho de 2013), eo CRC e de cancro da mama genes driver identificado em um estudo de alto rendimento re-seqüenciamento recente [34]. Esta análise indicou a presença de 27 “genes do câncer”, localizado dentro do FMCR excluído (~ 3,8% do número total de genes suprimidos; Tabela S2 no arquivo S1) e 11 “genes do câncer” dentro do FMCR ganhou (~ 3,8% do número total de genes adquirida;. Tabela S3 em S1 Arquivo)

A ocorrência de um gene do cancro dentro de um FMCR não implica necessariamente que ele está atuando como um gene motorista. Para alguns “genes do câncer”, o tipo de FMCR (apagados ou amplificados) não era compatível com a função de um gene conhecido, sendo um exemplo a eliminação do oncogene conhecido

ARN

. No entanto, a função dos genes e do tipo do FMCR muitas vezes eram consistentes com expectativa, exemplos incluindo deleções de

MAP2K4

e

CDKN2C

(Tabela S2 no arquivo S1) eo ganho de

FGFR1

(Tabela S3 no arquivo S1). Talvez, o mais importante, o clássico

SMAD4

supressão supressor de tumor e oncogênico

MYC

ganho de ambos observados dentro excluído e ganhou FMCR respectivamente. A frequência de ambos

SMAD4

supressões e

MYC

ganhos nos 45 casos cromossomicamente instáveis ​​foi alta em ~ 53% (Tabelas S2 S3 no arquivo S1).

comparação com os dados publicados SCNA

a fim de cross-validar os nossos resultados com os dados publicados, comparou-se a FMCR a aberrações cromossómicas comuns de menos de 3Mb identificada em quatro estudos recentes CRC [13,16,22,35] . O total de aberrações prioritários identificados nesses estudos foi de 187 ganhos e 189 exclusões. Entre os 4 estudos publicados, havia apenas 10 deleções sobrepostas focais (5,3%) e 29 ganhos focais sobrepostas (15,5%). A maior proporção do FMCR em nosso estudo se sobrepunham as regiões publicados. No total, 27 dos nossos 64 excluído FMCR (42,2%) e 11 dos nossos 32 ganhou FMCR (34,4%) sobreposto eliminações focais e ganhos nos 4 estudos publicados.

Um grande estudo SCNA foi recentemente realizado em 26 diferentes tipos de câncer, incluindo CRC [17]. O estudo identificou uma lista dos 20 eliminações somáticas mais comuns e ganhos através dos tipos de câncer analisados. Além disso, um gene candidato condutor também foi seleccionado para cada uma das SCNA comum. Uma comparação entre a FMCR e as regiões mais comuns no estudo Beroukhim et ai revelaram uma sobreposição com cinco das áreas de deleção (25% do total) e três áreas de ganho (15% do total). Todos os genes candidatos identificados pelo Beroukhim e colegas em seu estudo foram contidos dentro das áreas de sobreposição do nosso FMCR.

Pathway análise

A fim de procurar algum padrão ou caminhos específicos afetados pelos genes dentro do excluído ou adquirida FMCR, o banco de dados para anotação, visualização, e Discovery integrado foi utilizado (DAVID) v6.7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [36]. DAVID realiza análise de enriquecimento (baseado em anotações biológica dos genes-alvo) para identificar quaisquer vias biológicas que são estatisticamente significativamente sobre-representados na lista gene analisado [36]. Para o FMCR excluído, a via relacionada com o cancro mais enriquecido foi apoptose (P = 0,014) (Figura S1) com 10 genes apoptóticos que ocorre dentro do FMCR excluído. Sete destes genes (

CASP3

,

CASP8

,

CASP10

,

NFKBIA

,

CAPN1

,

BAD

,

TNF

e

TNFRSF1A

) têm um papel pró-apoptóticos e 3 (

PIK3R5, PIK3R2 e CFLAR

) são anti-apoptótica. Também, a via de sinalização de p53 foi enriquecida nas regiões deletadas (P = 0,079) com 5 genes afectados (Figura S2);

CCNB1

,

GADD45G

,

SERPINE1

,

SESN2

e

SFN

, todos os quais têm relatado funções anti-sobrevivência.

Por outro lado, a via de sinalização MAPK oncogênico foi o mais pathway sobre-representados na FMCR ganhou (P = 0,032) com 9 genes afetados (Figura S3). Sete destes genes (

CACNA1H

,

FGF23

,

FGF6

,

FGFR1

,

MAPKAPK2

,

ELK4

e

MYC

) são conhecidos por terem promover o crescimento e sobrevivência funções, enquanto os outros 2 (

DUSP8 e DUSP2

) têm funções anti-sobrevivência.

Relações Gene Entre análise Implicado Loci (GRAIL) também foi realizada (https://www.broadinstitute.org/mpg/grail/) [37] para procurar relações funcionais entre as regiões genômicas. A apoptose termos, apoptóticos e caspase estavam entre os mais significativamente enriquecida entre os FMCR excluído. Para os ganhos, os canais de condutância de potássio e os caminhos hedgehog estavam entre os termos mais significativamente enriquecidos.

Identificação de genes motorista candidato dentro candidato FMCR

A fim de identificar novos candidatos genes CRC motorista, os critérios FMCR foram tornadas mais rigorosas. Candidato FMCR foram seleccionados que tenham sido definidas por quatro SDE, ocorrem em ≥20% dos casos e têm um máximo de 12 genes dentro 3.0MB de tamanho. Estas definições FMCR mais rigorosas identificou 11 deleções (Tabela 1) e os ganhos 8 (Tabela 2). Dos 28 genes dentro das áreas excluídas, 10 (35,7%) foram identificadas como genes motorista candidato com funções supressoras de tumor conhecidos ou potenciais e fora dos 31 genes dentro das regiões ganharam, 6 (19,4%) eram candidatos com conhecidos ou potenciais função oncogênico (Tabelas 1 e 2, ver Discussão). genes supressores de tumor candidato em FMCR excluído incluiu

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2 e NFKBIA

e candidatos oncogenes em FMCR ganhou incluídos

PRDM16, TNS1, RPA3

e

KCNMA1

. É importante ressaltar que o estado do número de cópias de 2 destes genes romance motorista candidato,

NFKBIA

e

KCNMA1

, foi confirmada por ensaios quantitativos específicos de RT-PCR.

Localização cromossómica

Iniciar

End

Tamanho (MB)

recorrência (%)

SDE

Genes

candidatos genes

*

3p14.357521404576526910.1324.44433p14.260078018611958231.1231.1171

FHIT

4q22.191340468926745441.3333.3382

TMSL3

6q261623571251630498540.6922.2271

PARK2

11p15.4917244993636100.1922.225312q14.263277389633681090.0920.0041

RASSF3

14q13.234108596349503390.8428.8959

NFKBIA

16p13.3-p13.2613253670182750.8924.4471

A2PB1

17p13.1-p1210957541124009681.4448.8953

MAP2K4

20p12.114376202160711351.6937.78101

MACROD2

21q22.1133554005336512050.1028.8973

IFNAR1, IFNAR2

Tabela 1. genes motorista Candidato em FMCR eliminados.

* genes candidatos definidos com base em funções do cancro relevantes. CSV Baixar CSV cromossômica localização

Comece

End

Tamanho (MB)

recorrência (%)

SDE

Genes

candidatos genes

*

1p36.32241214436300361.2226.67711

PRDM16

1p34.336881028375358910.6520.00512q352183542272185560810.2020.0051

TNS1

7p22.1-p21.3703316278298870.8048.8954

RPA3

8q23.31138277911145474540.7251.1140NA10q22.378238542790846560.8520.0041

KCNMA1

12p13.32-p13.31428242953649991.0840.00412

FGF23, FGF6

22q11.2118517833186863130.1720.0041Table 2. genes motorista candidatos nos ganhou FMCR.

* genes candidatos definidos com base em funções do cancro relevantes. CSV Baixar CSV

Discussão

Identificação de FMCR e afectadas vias

A frequência e padrão de mutações no

APC, TP53

,

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

eram típicos de tumores MSS /CIN, sugerindo que a amostra analisada aqui é representativo deste tipo de tumor. FMCR foram inicialmente definidas como regiões aberrantes menor que 3MB em tamanho, ocorrendo em mais de 10% dos casos, com, pelo menos, dois SDE e uma pontuação COCA ≥2 ~ (p-valor = 0,01). No geral, 64 excluídos e 32 ganhou FMCR foram identificados de acordo com estes critérios. Os estudos publicados anteriormente mostraram um nível bastante baixo de sobreposição de aberrações entre eles (de 5,3% para exclusões focais e 15,5% para ganhos focais) [13,16,22,35]. Este não é, talvez, surpreendente uma vez que a utilização de diferentes plataformas, métodos analíticos e conjuntos de amostras resultará na identificação de diferentes pontos de acesso de aberrações. Nosso estudo mostrou um maior grau de sobreposição com os dados publicados anteriormente (42,2% do FMCR eliminado e 34,4% do FMCR ganhou), sugerindo a ausência de quaisquer níveis significativos de viés em nossa amostragem e métodos.

análise Pathway mostrou que as vias relacionadas com o cancro mais significativamente enriquecida entre FMCR excluídos foram apoptose e p53 vias de sinalização. Dez genes apoptóticos foram comumente excluídos em nossas amostras, 7 dos quais têm conhecido funções pró-apoptóticos e 3 (

PIK3R2

,

PIK3R5

e

CFLAR

) tem anti-apoptótica papéis. No entanto,

CFLAR

ocorre dentro da mesma FMCR como os genes pró-apoptóticos

CASP8

e

CASP10

. Da mesma forma,

PIK3R5

está localizado 1.2Mb jusante da

TP53

, e 81% (n = 17) das eliminações são comuns entre os 2 genes. Portanto, parece provável que a deleção de genes pró-apoptóticos FMCR dentro do qual está a actuar como um evento condutor, com os genes anti-apoptóticos que são passageiros co-eliminado. Para a via de sinalização de p53, todos os genes suprimidos (n = 5) são conhecidos por terem actividades anti-tumorigénicos. É notável que

TP53

em si também foi eliminado em 37,8% (n = 17) dos casos, mas não foi identificado dentro de um FMCR. Estes resultados sugerem que o FMCR suprimido pode desempenhar um papel importante na sobrevivência de células tumorais através incapacitante a apoptose e /ou a via de sinalização de p53. Além disso, o enriquecimento de genes apoptóticos no FMCR excluída suporta a correlação conhecida entre instabilidade genômica e apoptose defeituosa [38].

A via mais significativamente enriquecido para os genes FMCR adquirida foi a via MAPK oncogênico, com 9 genes sendo comumente afetadas. Sete destes genes são conhecidos ou previsto para ter actividades oncogénicos por promover o crescimento e sobrevivência do tumor. Embora, 2 genes têm um papel anti-sobrevivência, uma delas (

DUSP8

), ocorreu dentro do mesmo FMCR como o gene de promoção do crescimento oncogênico

IGF2

. Em geral estes resultados confirmam que as supressões focais e copiar o número de genes-alvo ganhos dentro de supressor de tumor e as vias oncogênicas, respectivamente.

genes motorista câncer Candidato

No total, o FMCR identificado continha ~ 1000 genes. A fim de identificar um conjunto de genes do controlador candidato, o FMCR foram ainda priorizados por utilização de uma definição mais rigorosa FMCR. O candidato pré-seleccionados FMCR foram 11 eliminações e 8 ganhos, contendo um total de 59 genes afetados.

Dez dos 28 genes (35,7%) do 11 candidato excluído FMCR estão com supressor de tumor conhecido ou potencial relacionada ao câncer função. Seis desses genes (

FHIT

,

TMSL3

,

PARK2

,

A2BP1

,

MACROD2

e

MAP2K4

) foram consistentemente relatados como excluído no CRC e outros tipos de câncer [17,22,26,35]. Por outro lado,

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2

e

NFKBIA

não foram relatados anteriormente de serem afectados em CRC.

RASSF3

foi mostrado previamente para inibir a proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama [39]. Os níveis de proteína de genes receptores de interferão (

IFNAR1 e 2

) mostraram-se regulada no cancro da bexiga, e associado com estágio avançado e resistência à quimioterapia [40]. Mutações inativadoras de

NFKBIA

foram encontrados em linfoma Hodgkin, e heterozigoto

NFKBIA

eliminações foram relatados em ~ 25% dos casos de GBM [23,41] .. Com base nas suas funções, a literatura e sua ocorrência dentro do candidato excluído FMCR, propomos

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2 Comprar e

NFKBIA

como novos genes supressores de tumor candidato CRC.

Seis dos 31 genes (19,4%) no 8 candidato ganhou FMCR são câncer relacionados com as funções oncogênicos previstas (

PRDM16

,

TNS1

,

RPA3

,

KCNMA1, FGF23

e

FGF6

).

FGF23

e

FGF6

têm sido relatados como adquirida no CRC e outros tipos de câncer [15,17]. No entanto,

PRDM16

,

TNS1

,

RPA3

e

KCNMA1

não tenham sido previamente relatada na CRC. RP-16 contendo domínio gene (

PRDM16

) é um oncogene conhecido implicadas na leucemia mielóide aguda (LMA) e de osteossarcoma [42,43] Tensin um gene (

TNS1

) é o único gene presente na FMCR relevante, e

TNS1

superexpressão

in vitro

foi mostrado anteriormente para promover significativamente a migração celular em fibroblastos [44]. A3 gene de proteína de replicação (

RPA3

) foi recentemente mostrado para ser adquirida com melanoma metastático (dentro de uma FMCR) e desempenhar um papel essencial na invasão tumoral [45]. Grande gene da subunidade alfa do canal de potássio activado com cálcio condutância (

KCNMA1

), o único gene na sua FMCR, tem sido mostrado para ser adquirida em casos de cancro da próstata e sobre-expresso em cancro da mama metastático [46,47]. Com base nas suas funções, a literatura ea ocorrência dentro do candidato ganhou FMCR, propomos

PRDM16

,

TNS1

,

RPA3

e

KCNMA1

como novel candidatos oncogenes CRC.

Em resumo, os nossos resultados, com base na análise das regiões comuns mínimas focais, confirme previamente relatado CRC loci e apoiar a hipótese de que as aberrações focais recorrentes alvo genes e vias relacionadas ao câncer. Além disso, deleções focais e amplificações foram mostrados para afetar genes supressores de tumor conhecidos e oncogenes respectivamente. Propomos aqui vários genes novos motorista candidato CRC. Além disso validação e estudos funcionais são necessários para determinar seu papel potencial na CRC tumorigénese.

Informações de Apoio

Figura S1. genes

apoptóticos no (saída de David) FMCR eliminados. saída DAVID mostrando a via de sinalização de apoptose com genes suprimidos marcados por uma estrela vermelha

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083859.s001

(TIF)

Figura S2.

via de sinalização P53 na (saída de David) FMCR excluído. saída DAVID mostrando a via de sinalização P53, com genes suprimidos marcados por uma estrela vermelha

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083859.s002

(TIF)

Figura S3.

MAPK via no (saída de David) FMCR adquirida. saída DAVID mostrando a via de sinalização MAPK com genes amplificados marcados por uma estrela vermelha

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083859.s003

(TIF)

Materiais e Métodos S1.

Resumo dos pacientes e características do tumor, sequências de primers e temperaturas de recozimento e números de acesso de genes NCBI.

doi: 10.1371 /journal.pone.0083859.s004

(DOC)

Arquivo S1.

Tabelas S1-S3. Tabela S1: Resumo das características moleculares das amostras tumorais 53. Tabela S2: Resumo dos 64 excluídos FMCR. Tabela S3: Resumo da 32 ganhou FMCR.

doi: 10.1371 /journal.pone.0083859.s005

(XLS)

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer a todos os participantes do estudo, Helen cãibras e Dan Connley para o paciente recrutamento e gerenciamento de dados, Paul Heath pela ajuda com o aCGH eo serviço de sequenciação do núcleo da Universidade de Sheffield para a realização de sequenciamento de DNA.