Sumário

ARN polimerase II transcreve as extremidades de cromossomas eucarióticos físicas lineares em uma variedade de moléculas de RNA longos não codificantes, incluindo telomérica contendo repetição de ARN (TERRA). Desde a descoberta TERRA, avanços foram feitos na caracterização de TERRA biogênese e regulação; pelo contrário suas funções associadas são ainda imperceptíveis. A maioria dos papéis biológicos até agora propostos para TERRA estão de fato baseado em

in vitro

experiências realizadas utilizando oligonucleotídeos de RNA TERRA-como curtas. Em particular, tem sido sugerido que a Terra inibe a actividade da telomerase. Nós exploramos dois sistemas celulares alternativos para testar se TERRA e /ou influência dos telômeros transcrição mediada por telomerase alongamento dos telômeros em células cancerosas humanas. Em células sem os dois DNA metiltransferases DNMT1 e DNMT3B, os níveis de transcrição e de estado estacionário do Terra são muito maior, enquanto telomerase é capaz de alongar telômeros normalmente. Da mesma forma, a telomerase pode alongar eficientemente telómeros indutíveis transgénicos cuja transcrição foi experimentalmente aumentada. Nossos dados desafiar a hipótese atual que TERRA funciona como um inibidor geral da telomerase e sugerem que o comprimento dos telômeros homeostase é mantida independentemente da TERRA e transcrição dos telômeros

Citation:. Farnung BO, Brun CM, Arora R, Lorenzi LE, Azzalin CM (2012) telomerase eficiente alonga Altamente Transcribing telômeros em células cancerosas humanas. PLoS ONE 7 (4): e35714. doi: 10.1371 /journal.pone.0035714

editor: Arthur J. Lustig, Tulane University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de fevereiro de 2012; Aceito: 20 de março de 2012; Publicação: 27 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Farnung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Europeu de Investigação (BFTERRA), o Swiss National Science Foundation (3100A0-120090 e PP00P3-123356) e Fundação Cariplo (2008-2507). CMB recebeu uma bolsa da Boehringer Ingelheim Fonds. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as extremidades de cromossomas eucarióticos físicas lineares são transcritos para uma variedade de espécies de ARN não codificante (ncRNA) que constitui o “transcriptoma telomérica ‘. Entre estas espécies, a longo ncRNA TERRA (repetição telomérica contendo RNA) foi descoberto pela primeira vez em células de mamíferos e sucessivamente descrita em eucariotos não mamíferos, incluindo peixe-zebra,

Arabidopsis thaliana

, a levedura de brotamento

ea levedura

Schizosaccharomyces pombe

[1] – [7]. TERRA moléculas são transcritos a partir das regiões imediatamente precedendo os telómeros -o subtelomeres- para a extremidade dos cromossomas, principalmente, pela RNA dependente de DNA polimerase II (RNAPII), que utiliza a cadeia telomérica rica em C, como um modelo. Assim, as moléculas TERRA individuais compreendem um tracto subtelomérica e rico em G repetições teloméricas (5′-UUAGGG-3 ‘em mamíferos). TERRA permanece associado a telómeros pós-transcricionalmente TERRA sugerindo que é um componente constituinte da heterocromatina telomérica [1], [3], [4], [6]. Outras espécies de RNA transcrito a partir extremidades dos cromossomas compreendem ARIA, um RNA telomérico rica em C, até agora identificado apenas em leveduras e plantas fissão, e dois transcritos subteloméricos complementares desprovido de repetições teloméricas detectáveis ​​nomeados ARRET, identificadas em brotamento e fissão leveduras e αARRET, identificado apenas na levedura de fissão [1], [4], [5], [7].

promotores subteloméricos dirigir a transcrição da TERRA foram identificados em células humanas e compreendem ilhas CpG rico em compostos de dinucleótido de trechos de 29 e 37 repetições em tandem pb (29-37 repetições). 29-37 repetições são precedidos por unidades de 61 pb em tandem repetidas que são dispensáveis ​​para a atividade do promotor e da função até agora não caracterizada [8], [9]. dinucleótidos CpG dentro promotores do Terra são pesadamente metilado no cancro diferente e células primárias [9]. Em células HCT116 carcinoma colorectal humanos bateu para fora para a metiltransferase dois DNA enzimas DNMT1 e (células NSO) DNMT3B, TERRA metilação do promotor é completamente abolida e RNAPII ligação aos promotores TERRA e níveis de estado estacionário do Terra são marcadamente aumentada [9]. Assim, a actividade concertada de DNMT1 e 3b restringe a actividade de transcrição do promotor TERRA, pelo menos em células HCT116. De modo semelhante, diminuída subtelomérica metilação CpG é acompanhado por um aumento dos níveis celulares TERRA em células derivadas de pacientes humanos afectados por imunodeficiência, instabilidade região centromérico, anomalias faciais (ICF), uma síndrome recessiva derivar de mutações da linha germinativa no gene DNMT3B [10]. Estranhamente, TERRA abundância é reduzida em células de camundongos deficientes para DNMT1 e DNMT3a /b, apesar de metilação global subtelomeres está comprometida, sugerindo mecanismos específicos da espécie de regulação TERRA mediadas por DNMTs [6], [11]. De fato, os promotores TERRA ainda estão a ser caracterizados em células de ratinho e continua a ser possível que os promotores TERRA murino não são regulados através de CpG metilação.

Enquanto TERRA biogênese e regulação têm sido amplamente estudados, a falta de ferramentas experimentais reprodutíveis de alterar TERRA contas níveis celulares para o conhecimento escasso de funções TERRA-associados. A maioria dos papéis putativos até agora atribuídas a TERRA foram deduzidas a partir

in vitro

experimentos onde foram utilizados oligonucleotídeos de RNA TERRA-como curtas. Tal

in vitro

experimentos têm sugerido que TERRA pode regular dos telômeros de comprimento homeostase, a replicação dos telômeros e condensação DNA telomérico [6], [12] – [14]. Em particular, os oligonucleótidos-TERRA como inibiu fortemente a actividade da telomerase em telomérica protocolo de amplificação de repetição (TRAP) e telomerase ensaios directos [6], [14]. Portanto, é geralmente assumido que TERRA age como um inibidor geral de alongamento dos telómeros mediada por telomerase e algumas indiretas

in vivo

evidências aparentemente apoiar esta suposição. Um dos telómeros levedura de germinação artificialmente forçado para transcrever encurtamento submetidos, enquanto que o comprimento dos telómeros remanescentes não foi afectada [15]. leveduras mutantes com actividade exonuclease Rat1p RNA comprometida suportar maiores quantidades de moléculas de Terra e de telômeros mais curtos em comparação com contrapartes de tipo selvagem [16]. Finalmente, os telómeros são mais curtos em células estabelecidas a partir de pacientes ICF do que em células de dadores saudáveis ​​[10]. No entanto, não foi testado directamente se o encurtamento dos telómeros observada nestes diferentes sistemas celulares verdadeiramente deriva da inibição da telomerase. Assim, a relevância biológica real da capacidade de oligonucleotídeos TERRA-como para inibir a atividade da telomerase

in vitro

ainda precisa ser avaliada.

A fim de determinar se TERRA e transcrição dos telômeros afetar a atividade da telomerase

in vivo

, temos explorado dois sistemas celulares humanos alternativos onde TERRA transcrição é aumentada. Demonstramos que as células NSO infectadas com retrovírus que expressam a subunidade catalítica da telomerase alongada seus telómeros de forma tão eficiente como as células parentais com actividades DNMT intactas. Consistentemente, atividade bioquímica telomerase parece não ser afectada nas mesmas células. Apresentamos também o desenvolvimento de um sistema celular em que a transcrição de exclusivas dos telômeros transcrição induzíveis ‘(tiTELs) pode ser controlado à vontade. indução de transcrição de tiTELs não afeta seu comprimento homeostático, nem impede mediada por telomerase re-alongamento após a redução induzida por inibidores de telomerase. No total, nossos resultados desafiam a noção comumente aceita de que TERRA é um inibidor celular da telomerase e implorar para explorar funções alternativas exercidas por TERRA e transcrição dos telômeros. Além disso, nossos resultados implicam que o encurtamento dos telómeros observado em sistemas onde TERRA foi aberrante elevado [10], [15], [16] provavelmente deriva da integridade dos telômeros comprometida em vez de inibição da telomerase.

Resultados e Discussão

níveis de estado estacionário do Terra são mantidas independentemente de o comprimento dos telômeros em células cancerosas humanas

O papel proposto para TERRA na inibição da atividade da telomerase sugeriu um modelo onde as longas telômeros se acumulem ou produzir mais TERRA, impedindo assim telomerase para alargar ainda mais deles [6], [14], [17]. provas correlativa usando não-isogênicos linhagens de células de mamíferos de diferentes origens parece apoiar esta hipótese [6]. Pelo contrário, o trabalho recente na brotação levedura mostrou que induzida experimentalmente excesso de alongamento ou encurtamento dos telômeros não altera os níveis de Terra e de ocupação RNAPII em extremidades dos cromossomas [18]. Por isso, criou para testar se existe uma correlação entre os níveis de TERRA e comprimento dos telômeros em células humanas isogênicas com telomeres de comprimentos diferentes.

Nós estavelmente infectadas células do câncer do colo do útero HeLa com retrovírus que expressam a subunidade catalítica da telomerase humana (hTERT ). Como um controlo, que as mesmas células infectadas com o vector vazio (EV) ou retrovírus com retrovírus que expressam hTERT C-terminalmente fundido com uma etiqueta de epitopo de hemaglutinina da gripe (HA-hTERT). hTERT-HA exibe atividade catalítica normal de

in vitro

mas não consegue alongar telômeros

in vivo

, provavelmente devido a um recrutamento deficiente aos telômeros [19]. Estavelmente populações infectadas foram seleccionadas e mantidas em cultura durante várias duplicações da população (PDS). fragmento de restrição dos telómeros (TRF) análise de ADN genómico indicou que no momento em que as experiências foram infecção hTERT realizada levou a um alongamento substancial dos telómeros granel: TRFs foram compreendida entre 2 e 5 kb em células infectadas com EV e entre 5 e mais de 15 kb em células infectadas com hTERT (Figura 1A). Como antecipado, a expressão da hTERT-HA não alterou o comprimento dos telómeros, apesar de ter sido expressa em níveis comparáveis ​​aos da hTERT (Figura 1A e E). Em seguida, ADN genómico digerido com

Msp

I ou com a sua isoesquisômero sensível CpG metilação

Hpa

II e hibridizadas para sondas radiomarcadas correspondentes aos 29-37 repetições encontradas dentro promotores TERRA. Coerente com o que temos relatado anteriormente [9], descobrimos que 29-37 repetições são em grande parte metilado em células HeLa. O padrão de restrição detectados com sondas de repetição 29-37 não foi alterada em células de expressão de hTERT, em comparação com células de controlo da hTERT-HA e EV, o que indica que o alongamento dos telómeros não afecta o estado de metilação de promotores Terra (Figura 1B). análise de transferência de Northern de RNA total utilizando sondas teloméricas não revelou quaisquer alterações substanciais em níveis totais de celulares TERRA em células infectadas com hTERT, em comparação com EV ou controles hTERT-HA-infectados (Figura 1C). Uma mudança de tamanho das moléculas em direcção TERRA pesos moleculares mais elevados era evidente em células alongadas com telómeros, o que sugere que, pelo menos, nestas linhas celulares do comprimento de telómeros podem influenciar o comprimento das moléculas Terra (Figura 1C). Consistente com a análise de Northern blot, quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) medições de moléculas transcritas de 10q TERRA braços de cromossomas, 15q e XpYp não revelaram qualquer alteração estatisticamente significativa em Terra níveis de estado estacionário mediante o alongamento dos telómeros (Figura 1D). Nós também realizou experiências análogas em fibroblastos pulmonares humanas primárias (HLF) e, como para as células HeLa, telômero alongamento não alterou significativamente o estado de metilação de promotores TERRA e níveis TERRA celulares (Figura S1).

(A) análise TRF de células HeLa infectadas com o vector vazio (ev), hTERT ou retrovírus hTERT-HA. DNA foi digerido com

Rsa

I e

Hinf

enzimas de restrição I e hibridados com sondas teloméricas. (B) O mesmo DNA como em A foi digerida com

Hpa

II (metilação sensível) ou

Msp

Eu nucleases (metilação insensitive) de restrição e hibridado com uma sonda de detecção do bp 29-37 repetições de promotores TERRA. (C) RNA Nuclear foi hibridizada utilizando sondas teloméricas para detectar total de TERRA e sucessivamente com sondas 18S rRNA para controlar para o carregamento. Números no fundo são as relações entre a Terra e 18S sinal expresso como vezes de aumento sobre as amostras infectadas com EV. pesos moleculares estão à esquerda em quilobases. (D) Análise de qRT-PCR dos níveis de estado estacionário de transcrições TERRA provenientes de 10q, 15q e extremidades dos cromossomas Xp /Yp. Bares são médias de três experiências independentes expressos como vezes de aumento sobre as amostras infectadas com EV. bares e números de erro são desvios-padrão e valores P, respectivamente. (E) Análise de transferência de Western de células infectadas utilizando anticorpos anti-hTERT (para detectar todas as moléculas de hTERT), anti-HA (para detectar hTERT-HA) e anticorpos anti-PCNA (controlo de carga).

em uma abordagem complementar, que cultivaram células HeLa na presença do inibidor de telomerase BIBR1532 [20] durante cerca de 19 semanas. BIBR1532 tratamento conduziu a uma redução substancial dos telómeros granel: comprimento dos telómeros foi principalmente compreendido entre 2 e 5 kb em células de controlo não tratadas e entre 1 e 3 kb em células tratadas com BIBR1532 (Figura 2A). As células tratadas de modo semelhante dividido com células não tratadas, indicando que os telómeros eram tempo suficiente para sustentar o crescimento de células normais (dados não mostrados). Encurtamento do telômero não induziu qualquer alteração substancial do seu estado de metilação de 29-37 repetições nem em totais ou cromossómicas níveis específicos de estado estacionário Terra (Figura 2B-D). No seu conjunto, estas experiências indicam que, como foi recentemente mostrado para quem gosta de levedura [18], as alterações de comprimento dos telómeros não afectam TERRA metilação do promotor ou os níveis celulares TERRA em células humanas. Conclui-se que a Terra de transcrição não é regulada pelo comprimento dos telómeros, pelo menos, nos tipos de células que foram analisadas.

(A-D) Células HeLa foram tratadas com o inibidor de telomerase BIBR1532 (+ BIBR) durante 19 semanas ou deixada sem tratamento (-BIBR). comprimento dos telómeros, TERRA metilação do promotor e os níveis totais específicos de cromossomas ou em estado estacionário TERRA foram analisadas tal como na Figura 1. O ARN total foi usada para todas as experiências. Para a análise de transferência de Northern do total TERRA (C) da beta-actina (TCA) foi utilizada como um controlo de normalização. pesos moleculares estão à esquerda em kilobases.

células metiltransferase com deficiência de DNA têm a atividade da telomerase normais

Os níveis elevados TERRA presentes em células NSO torná-los um sistema celular adequado para testar a efeitos exercidos pela TERRA sobre a actividade da telomerase. Nós estavelmente infectadas DKO e HCT116 células parentais (PAR) com hTERT ou ev retrovírus e populações estáveis ​​selecionados. Possivelmente devido à diferente estado transcricional das duas linhas de células, que repetidamente encontrado que sobre-expressa níveis de proteína hTERT foram mais do que duas vezes mais elevada do que no par em células NSO (Figura 3A). Como demonstrado por qRT-PCR e Northern blot, os níveis de estado estacionário de moléculas TERRA transcrita a partir de 61-29-37 repetição contendo 10q e 15q extremidades dos cromossomas foram aumentou dramaticamente em células NSO (Figuras 3B e S2A) e, de forma consistente com o resultados acima descrito para as células HeLa e HLF, hTERT expressão estável não alterou quantidades TERRA em qualquer uma das linhas de células (Figura 3B). Preparamos extractos de proteína e a actividade da telomerase analisadas utilizando ensaios TRAP quantitativo. Não houve diferença significativa na actividade de telomerase foi medida no par infectadas com EV e as células NSO, enquanto hTERT infecção conduziu a um aumento substancial na actividade de telomerase em ambas as linhas celulares (Figura 3C e D). actividade de TRAP era ligeiramente maior em células infectadas par-hTERT do que em células infectadas DKO-hTERT e atribuir esta diferença para os valores mais baixos de proteína total hTERT expressas na linha celular deficiente em DNMT (Figura 3A, C e D). ARN isolado a partir de extractos de TRAP continha 10q e 15q moléculas TERRA, embora uma grande parte deles (aproximadamente 90 e 80% para o par e as células NSO, respectivamente) permaneceu nos sedimentos celulares restantes depois da extracção (Figura 3E), provavelmente porque a maioria dos TERRA é cromatina associada [1], [3], [6]. Ainda assim, considerando que 10q e 15q moléculas do Terra são -300 vezes mais abundante no DKO do que em células par (Figura 3B), estima-se que extratos TRAP NSO contido ~600 vezes mais moléculas TERRA do que extratos par. Em conclusão, relatamos que a atividade TRAP é similar em células com drasticamente diferentes níveis TERRA. Isso está em contraste com os resultados obtidos

in vitro

usando oligonucleotídeos TERRA-como curtas [6], [14]. Acreditamos que os oligonucleotídeos de RNA curto empregada

in vitro

não se comportam, moléculas TERRA longas como naturais, possivelmente devido à sua utilização em altas concentrações, não fisiológicas.

(A) Western blot análise da hTERT-expressão em HCT116 parental (par) ou DNMT1 e 3B células infectadas duplas KO (NSO). Números no fundo são as relações entre hTERT e PCNA (controle de carga) sinais, expresso pelo aumento vezes sobre células parentais infectados com hTERT. (B) Análise de qRT-PCR dos níveis de estado estacionário de transcrições TERRA provenientes de 10q e 15q as extremidades do cromossoma expressa como aumento vezes sobre células infectadas par-EV. Bares e barras de erro são médias e desvios-padrão de três experiências independentes. (C) A análise dos produtos de amplificação TRAP partir das linhas de células indicadas. Três diferentes quantidades de proteínas totais foram usadas para cada linha de células e para controlar a especificidade de uma amostra foi pré-tratada com RNase A. iniciadores de amplificação de controlo de um controlo interno (IC) foram incluídos em todas as reacções. (D) A quantificação da actividade da telomerase em amostras indicadas utilizando ensaios TRAP baseados em qRT-PCR. Bares e barras de erro são médias e desvios-padrão de três experimentos independentes, após a normalização através de amostras de células parental infectado-EV. Os números indicam valores de P (*: P 0,01). quantificação de 10q e 15q transcrições TERRA em extractos de TRAP (EXT) ou em pellets de células restantes depois de extração (PLT) (E) qRT-PCR-based. quantidades relativas TERRA são expressos como frações do total de moléculas de TERRA de pellet além de extrato. Bares e barras de erro são médias e desvios-padrão de três experiências independentes.

Eficiente alongamento dos telómeros mediada por telomerase em células NSO

Para monitorar como telomerase alonga os telômeros em células par e NSO nós preparado ADN genómico a partir de células infectadas 2, 5 e 9 dias após a infecção. Em seguida, realizaram análise TRF utilizando sondas específicos de detecção de sequências subteloméricos cromossomo 10q ou sondas de repetição teloméricas detecção telômeros em massa. Embora 10q e a granel TRFs eram substancialmente mais curto em NSO do que nas células parentais, ambos submetido ao alongamento progressivo ao longo do tempo-curso escolhido em células infectadas com hTERT, mas não em células de controlo de EV (Figura 4A). Assim, a telomerase é capaz de alongar os telómeros tanto em células NSO e par incluindo os telómeros 10q, que são fortemente transcritas em células NSO (Figuras 3B e S2a). Para obter dados mais quantitativos, fizemos uso da análise único comprimento dos telômeros (STELA), uma abordagem baseada em PCR, que permite medir com precisão o comprimento dos telômeros individuais [21]. Stela de 15q telómeros confirmou que o comprimento médio dos telómeros nas células NSO é menor do que nas células parentais (5,9 kb e 3,8 kb em par e células NSO, respectivamente; A Figura 4B e C). No entanto, como já foi sugerido por análise TRF, 15q telómeros foram eficientemente alongada em ambas as linhas celulares infectadas com retrovírus hTERT (Figura 4D). Por análise quantitativa de produtos STELA e normalização pela população tempo de duplicação (PD) calculado para as duas linhas celulares (17,7 h e 29,6 h para hTERT par e as células NSO hTERT, respectivamente) estimou que as taxas de telomerase alongamento foram de aproximadamente ~204 bp /PD em células par e ~186 bp /PD em células NSO (Figura 4C e D). Esta ligeira diferença nas taxas de alongamento de telomerase não se correlaciona com as enorme aumento dos níveis de 15q TERRA em células NSO (Figura 3B) e é susceptível de ser atribuída aos diferentes níveis de proteína hTERT detectados no par infectado e as células NSO (Figura 3A). Trypan análise de separação de células activadas por fluorescência (FACS) de células marcadas com iodeto de anexina V e propídio coloração azul e não revelou nenhuma grande diferença na fração de células mortas ou apoptóticos nas diferentes linhas de células nem se notam alterações substanciais na distribuição de células entre as diferentes fases do ciclo celular (Figura S2B). Isto indica que o tempo de DP mais elevados medidos para células NSO é provavelmente imputável a um tempo de ciclo mais longo destas células, uma noção ainda corroborada pelo atraso evidente na progressão do ciclo celular observada para células NSO sincronizados libertados a partir de um bloco de nocodazole (Figura S3A).

(A) análise TRF do par e as células NSO infectadas com o vector vazio (EV) ou retrovírus hTERT. O ADN genómico foi recolhido de 2, 5 e 9 dias (D) após a infecção, digerido com

Rsa I e transferido para uma membrana de nylon. A mesma membrana foi hibridada primeiro com uma sonda de detecção de 10q TRFs e, sucessivamente, com uma sonda de detecção de telómeros totais. (B) STELA de 15q comprimento dos telômeros usando o mesmo DNA como em pesos moleculares A. marcador estão à esquerda em quilobases. representação plot (C) Box of 15q comprimentos dos telômeros. Média de comprimentos telomere em quilobases e o número de telómeros total analisado (n) está indicado para cada amostra. (D) 15q taxas de alongamento dos telômeros expressa como comprimento médio dos telômeros em diferentes duplicações da população. Note-se que para as células par, foram utilizados apenas três pontos de tempo, porque não houve diferença estatisticamente significativa no comprimento médio dos telômeros foi medido entre o dia 5 e no dia 9.

normal alongamento dos telômeros em células infectadas hTERT NSO não suporta a noção de que a Terra funciona como um inibidor de telomerase

in vivo

. Ainda assim, considerou-se a possibilidade de que as transcrições TERRA em células NSO são incapazes de inibir a telomerase seja porque eles não adequadamente localizar aos telômeros ou porque são drasticamente sub-regulada durante a fase S, quando telomerase está agindo [17], [22] . Nós combinamos de imunofluorescência indireta com RNA de fluorescência

in situ

hibridação (IF /RNA-FISH) para detectar simultaneamente o TRF2 fator telomérica e moléculas TERRA. As células NSO continha mais e mais brilhante do que focos TERRA células parentais e infecções hTERT não alterou o padrão global de hibridação TERRA. Aproximadamente 20 e 30% de TRF2 focos co-localizada com TERRA focos em células NSO e par, respectivamente (Figura S2C e D), provavelmente reflectindo o facto de o aumento dos níveis de células NSO TERRA em facilitou a detecção de focos TERRA. Por outro lado, a fracção de TERRA focos de co-localizar com telómeros foi semelhante em ambos os fundos celulares, indicando que a capacidade intrínseca de TERRA a permanecer associado ao telomérica heterocromatina não requer actividades DNMT intactas (Figura S2C e D). Importante, a expressão da hTERT não alterou as taxas de co-localização de ambas as linhas de células. Daí, a fracção de TERRA associada a telómeros é semelhante em par e as células NSO, e alongamento dos telómeros não afecta sensivelmente TERRA localização. Em seguida, bloqueado células NSO par e na fase G2 /M e libertou-os de forma síncrona para o ciclo celular durante um tempo suficiente para progredir através da fase-S (Figura S3A). Nós preparado ARN total em momentos diferentes e dot-blot hibridizado para TERRA e sondas de actina. TERRA níveis permaneceram estáveis ​​ao longo de todo o curso de tempo em ambas as linhas celulares (Figura S3B e C). No total, estas observações revelam que mediada por telomerase alongamento dos telômeros não seja prejudicada substancialmente em células NSO, onde as taxas de transcrição TERRA e níveis de estado estacionário são aumentados dramaticamente [9]. Esta falta de inibição robusta não deriva de mislocalization da TERRA ou da sua infra-regulação durante a fase S. Isto é bem em linha com as nossas observações de que a atividade da telomerase não é afetado nas mesmas linhas celulares.

Geração de linhas de células cancerosas humanas que transportam telômeros transcrição induzíveis

DNMT1 /3b eliminação leva a mudanças globais de transcrição em DKO células [23]. Para obter um sistema celular no qual a transcrição dos telómeros originais poderiam ser alteradas, foram geradas linhas de células estáveis ​​que transportem telómeros transgénicas que podem ser transcritas de forma indutível ( ‘telómeros transcricionalmente indutíveis’; tiTELs). Nós combinada telómero semeando fenómeno com a expressão do gene induzível tecnologia Tet-EM [24] – [26] e desenvolvido num vector de sementeira de telómeros que compreende uma cassete de resistência à higromicina e um doxiciclina (DOX) promotor CMV mínimo -inducible colocado a montante de um (TTAGGG ) N matriz telomérica (Figura 5A). Um ~1.6 kb sequência única designada por «subtelomere transcricionalmente induzível ‘(tiSUBTEL) separa a sequência telomérica a partir do promotor induzível (Figura 5A). O plasmídeo foi linearizado por semeadura

Apa

A digestão, a fim de expor o tracto telomérico na sua extremidade 3 ‘e transfectado para uma linha de células que expressam o repressor Tet derivado a partir de células HeLa (T-Rex-HeLa). Os clones independentes resistentes a higromicina foram seleccionados e testados para a semeadura TÍTULO por análise de mancha de Southern. O ADN genómico foi digerido com

Xho I a fim de libertar TÍTULO TRFs e hibridados com sondas marcadas radioactivamente que correspondem a sequências tiSUBTEL (PAS na Figura 5A). Dois clones (CL12 e CL17) mostraram a padrão de hibridação esperado manchas típicas para tiTELs recentemente semeadas (Figura 5B) e foram escolhidos para posterior caracterização. Em ambos os clones, Titel TRFs foram principalmente compreendido entre 3 e 6 kb. Porque

Xho I

cortes de aproximadamente 2,4 kb a montante da primeira repetição telomérica no plasmídeo sementeira (Figura 5A), tiTELs teloméricas tractos foram estabilizados em cerca de 0,6 a 3,4 kb, um intervalo de tamanho comparável ao dos telómeros granel em parentais e nas células clonais (Figura S4A). Nós confirmou ainda Titel semeadura em clones 12 e 17 utilizando abordagens experimentais adicionais. Nós estavelmente infectadas ambas as linhas de células clonais com retrovírus que expressam hTERT e confirmou que ambos os tiTELs e telômeros naturais foram prontamente alongada sobre a infecção hTERT (Figuras 5B e S4A). STELA com os oligonucleótidos correspondentes a sequências tiSUBTEL produzidos produtos de amplificação hibridação a ambos SBP e sondas teloméricas somente quando usamos DNA genômico a partir de células CL12 e CL17, mas não a partir de células parentais (Figura S4B). PEIXES ADN de cromossomas em metafase preparados a partir de células de CL12 e CL17 usando plasmídeos semeando marcados fluorescentemente desprovido de repetições teloméricas revelaram que tiTELs recentemente semeadas foram integrados em uma e duas extremidades do cromossoma no clone 17 e clone 12 em células, respectivamente (Figura 5C). hibridação Finalmente, dot blot de ADN genómico digerido com a exonuclease BAL31 revelou um desaparecimento progressivo dos sinais de hibridação Titel ao longo do tempo (Figura S4C).

(A) Esquema do vetor Titel semeadura. ICMV: promotor de CMV indutivel; SBF e SBR: oligonucleótidos utilizados em experiências de RT-PCR; PAS: sonda utilizada no TRF, STELA e experimentos de Northern blot. (B) Análise de Titel TRF de ADN genómico preparado a partir de clone 12 (CL12), clone 17 de células parentais (PAR) infectados com retrovírus que expressam hTERT ou retrovírus controle ev (CL17) e. O ADN foi hibridado com sondas de PAS. pesos moleculares dos marcadores estão à esquerda em quilobases. (C) metáfases parciais de CL12 e CL17 hybridized

in situ

para detectar tiTELs (setas). (D) Análise de transferência Northern de ARN total de CL12 e CL17 tratadas durante 24 h com combinações de doxiciclina (DOX) e a tricostatina A (TSA) ou deixada sem tratamento. sondas PAS foram usados ​​para detectar tiTERRA. As mesmas membranas foram retirados e re-sondados para detectar transcritos de beta-actina (ACT) para controlar o carregamento. Análise (E) qRT-PCR de tiTERRA estacionários níveis nas linhas celulares indicadas tratados com combinações diferentes de DOX e TSA ou deixada sem tratamento. Para cada linha celular, os valores são expressos como vezes de aumento sobre amostras não tratadas. Bares e barras de erro são médias e desvios-padrão dos 3 aos 7 experimentos. Os valores de P para amostras relevantes são indicadas por números ou por asteriscos (*: P 0,01; **: P 0,001)

indução da transcrição de tiTELs

Para testar se. tiTELs respondeu a indução de transcrição, foi realizada cultura células CL12 e CL17 em presença ou ausência de doxiciclina (DOX) durante 24 horas. Foram coletadas ARN total e submeteu a análise por Northern blot utilizando sondas de PAS (Figura 5A). tratamento DOX levou ao aparecimento das espécies de ARN, referido como «TERRA transcricionalmente induzível ‘(tiTERRA), compreendido no comprimento entre cerca de 0,5 e 6 kb (Figura 5D). Porque a sequência de promotor indutível é colocado aproximadamente 1,6 kb a montante da sequência telomérica, conclui-se que a transcrição TÍTULO pode prosseguir através da maior parte do tracto telomérica. Em seguida, realizada análise por qRT-PCR de ARN de transcrição inversa com hexâmeros aleatórios e de PCR, amplificando o cDNA obtido utilizando SBF e oligonucleótidos SBR (Figura 5A). Como esperado, não tiTERRA foi detectada em células parentais, confirmando a especificidade da abordagem de RT-PCR (Figura 5E). Embora em níveis baixos, já tiTERRA transcritos foram detectados em ambos os clones não induzidas, revelando uma actividade de transcrição basal a partir do promotor de CMV indutivel na ausência de indução (Figura 5E). quantificações absolutas de moléculas tiTERRA indicou que, em clones não induzidos, tiTERRA foi mantida em níveis comparáveis ​​aos de moléculas TERRA endógenos transcritas a partir 10q extremidades dos cromossomas (Figura S5A e B). Isto indica que tiTERRA é mantida em níveis fisiológicos em ambas as linhas de células clonais. Consistente com os resultados de Northern blot, o tratamento com DOX induziu um aumento de 10 a 20 vezes nos níveis de tiTERRA em ambos os clones (Figuras 5E e S5B). moléculas TiTERRA também foram detectados em experiências de PCR realizadas com ADNc transcrito reverso usando oligonucleotideos ricos em C (TELC) complementares para o estiramento telomérica dentro moléculas Terra (Figura S5A e C). Assim, como acontece com TERRA natural, transcrições tiTERRA individuais contêm tanto telomérica e sequências subteloméricos.

expressão TERRA é epigenetically regulado eo histona deacetilase inibidor tricostatina A (TSA) promove a acumulação de transcritos TERRA em células cancerosas humanas [27] . Foram tratados células CL12 e CL17 com TSA na presença ou ausência de DOX e quantificado tiTERRA por qRT-PCR.