Abstract

Fundo

Intra-tumoral esteroidogênese e receptor de andrógeno constitutiva (AR) atividade têm sido associadas com o cancro da próstata resistente à castração (CRPC). Este estudo teve como objetivo analisar se metástases ósseas CRPC expressaram níveis mais elevados de enzimas conversoras de esteróides do que metástases ósseas não tratados. níveis de enzimas esteroidogênicas também foram analisados ​​em relação à expressão de variantes AR constitutivamente ativos (AR-Vs) e variáveis ​​clínicas e patológicas.

Metodologia /Principais Achados

Se não for tratada, a hormona-naïve (HN , n = 9) e CRPC amostras de metástases ósseas (n = 45) foram obtidas de 54 pacientes de cirurgia metástase. amostras da próstata não-malignas e malignas foram adquiridos a partir de 13 espécimes de prostatectomia. níveis de transcrição e de proteína foram analisados ​​por em tempo real de RT-PCR, imuno-histoquímica e immunoblotting. Não houve diferenças nos níveis de enzimas esteroidogênicas foram detectadas entre CRPC e metástases ósseas HN. níveis significativamente mais elevados de SRD5A1, AKR1C2, AKR1C3 e mRNA HSD17B10 entretanto foram encontrados em metástases ósseas do que em não-malignas e /ou tecido da próstata maligno, enquanto o CYP11A1, CYP17A1, HSD3B2, SRD5A2, e os níveis de mRNA HSD17B6 em metástases foram significativamente menores . Um sub-grupo de metástases expressa níveis muito elevados de AKR1C3, que não era devida a amplificação do gene como examinado pelo ensaio de variação do número de cópias. Não foi encontrada associação entre a expressão AKR1C3 e coloração AR nuclear, proliferação de células tumorais ou o resultado do paciente após a cirurgia metástases. Com apenas uma exceção, os níveis de proteína de alta AR-V foram encontrados em metástases ósseas com baixos níveis de AKR1C3, enquanto metástases com altos níveis de AKR1C3 continha principalmente baixos níveis de AR-V, indicando mecanismos distintos atrás castração resistência em metástases ósseas individuais.

Conclusões /Significado

a capacidade de converter esteróides adrenal glândula derivados em andrógenos mais potentes foi indicada em um sub-grupo de metástases PC óssea induzida. Este não foi associada com CRPC, mas apenas com o estágio avançado de metástase. Subgrupos de metástases ósseas podem ser identificados de acordo com seus níveis de expressão de AKR1C3 e AR-Vs, que podem ser de relevância para a resposta do paciente a 2

nd linha terapêutica de privação de androgênio

Citation:. Jernberg E, E Thysell, Bovinder Ylitalo E, Rudolfsson S, S Crnalic, Widmark A, et al. (2013) Caracterização de cancro da próstata metástases ósseas De acordo com os níveis de expressão de Steroidogenic enzimas e receptor andrógeno Splice variantes. PLoS ONE 8 (11): e77407. doi: 10.1371 /journal.pone.0077407

editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 14 de maio de 2013; Aceito: 02 de setembro de 2013; Publicação: 07 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jernberg et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Conselho Sueco de Pesquisa, Cancer Society sueco, a Fundação do Câncer Research no norte da Suécia, Cancer Research Foundation de Leão, e da Universidade de Umeå. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O tratamento de primeira linha para pacientes com câncer de próstata avançado (PC) é a terapia da privação do andrógeno (ADT). Esta terapia é eficaz na maioria dos pacientes, mas depois de um período de remissão de tumores iniciais geralmente recaída, predominantemente dentro do osso, e, em seguida, são denominados PC resistente à castração (CRPC).

Apesar dos baixos níveis circulantes de androgénios em homens castrados a maioria dos tumores CRPC mostram actividade de receptor de androgénio (AR) e da expressão de genes regulados AR [1]. Possíveis mecanismos subjacentes a actividade de AR em CRPC incluem AR amplificação do gene e mutações, síntese intra-tumoral de androgénios, e expressão de variantes de splicing AR constitutivamente activas [2], [3]. Em particular alguns tumores CRPC, e células tumorais individuais na maioria dos pacientes, mostram muito baixa ou ausência de imunocoloração AR nuclear e factores a jusante da AR não são, necessariamente, sobre-regulado nos casos [4], [5], [6] [7]. Temos caracterizado recentemente uma série de hormona não tratados (HN) e metástases ósseas CRPC em doentes de acordo com a activação de AR e expressão de variantes de splicing de AR (AR-Vs) [5], [8]. Níveis de AR-V7 (também denominado AR3) [9], [10] e AR-V567es [11] variantes foram aumentados em CRPC comparação com metástases HN e, além disso, verificou-se ser altamente expressa em um sub-grupo de CRPC pacientes com prognóstico particularmente ruim [8]. O AR-V7 e AR-V567es falta de domínio de ligação ao ligando (LBD) e possuir actividade constitutiva [9], e os pacientes que expressam os AR-Vs provavelmente respondem mal à ADT e anti-AR drogas que alvejam o LBD. Alguns pacientes CRPC no entanto responder a 2

nd linha ADT e isso pode ser devido a intra-tumoral esteroidogênese e produção de testosterona, a dihidrotestosterona (DHT), ou outros andrógenos em níveis elevados o suficiente para a ativação do AR, conforme relatado por outros [13 ], [14], [15], [16]. É, no entanto, não se sabe quando essas enzimas esteroidogênicas são up-regulada. São já aumentada em metástases HN não previamente tratados, ou como o AR-Vs [8] aumentada como resultado de tratamento de castração? Um dos objectivos deste estudo era, por conseguinte, para analisar a expressão de enzimas conversoras de esteróides potencialmente envolvidas na síntese de testosterona e DHT em um conjunto de HN e metástases ósseas CRPC obtidos a partir de pacientes no momento da cirurgia metástases. Além disso, os níveis de expressão da enzima foram analisados ​​em relação à expressão de AR-Vs, a fim de identificar potenciais mecanismos diferentes por trás CRPC em metástases ósseas individuais.

Materiais e Métodos

Ética declaração

o estudo foi aprovado pelo conselho local de ética de avaliação da Universidade de Umeå e os participantes leram e assinaram ou consentimento verbal. Devido à situação aguda quando a cirurgia metástase óssea é realizada, a fim de sintomas da coluna de socorro e paresia, logística nem sempre permitem consentimento por escrito ea revisão ética junta local, portanto, especificamente aprovado também o consentimento verbal. consentimento verbal documentado pelo médico na revista paciente.

Os pacientes

tecido metástase óssea foi obtida a partir de séries de biópsias fresco congelado e fixados em formol coletadas de pacientes com PC operados por espinhal metastático compressão da medula ou fraturas patológicas no Hospital Universitário Umeå (2003-2011). As características clínicas e terapêuticas encontram-se resumidos na Tabela 1, e esta série paciente foi previamente descrito em Crnalic et ai [5], [17], [18]. O estudo também inclui 13 pacientes que foram tratados com prostatectomia radical no Hospital da Universidade Umeå, entre fevereiro 2005 e setembro de 2006. A idade média dos pacientes era de 60 anos (intervalo 48-68 anos) e PSA médio foram 6,6 ng /ml (variação de 3,5 -24 ng /mL). Onze dos pacientes tinham tumores classificados como escore de Gleason (GS) 7 e dois como GS 8. Quatro dos tumores estavam em T2 palco e nove em fase T3. Informações adicionais sobre a manipulação de tecidos foi previamente descrito em Hornberg et al [8].

A preparação da amostra

áreas representativas de metástases ósseas, PC primário e tecido da próstata não maligno foram crio -sectioned em tubos de extracção e o ARN foi isolado utilizando o protocolo de Trizol (Invitrogen, Estocolmo, Suécia) ou de ADN AllPrep /ARN /proteína Mini Kit (Qiagen, Sollentuna, Suécia). Para os casos foram de DNA e de proteína foram analisados ​​em paralelo com o RNA, ácidos nucleicos e proteínas foram isolados a partir das mesmas secções de tecido utilizando o método AllPrep. As percentagens de células tumorais nas amostras estavam acima de 50% na maioria dos casos. As concentrações de ADN e de ARN foram quantificados por medições de absorvância, utilizando um espectrofotómetro (espectrofotómetro ND-1000; NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio BCA Protein (Pierce Chemical Co., IL, EUA). A qualidade RNA foi analisado com o 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e verificada a ter um número de integridade do RNA ≥6.

em tempo real RT-PCR

RNA foi invertida transcrito com transcriptase inversa Superscript II (Invitrogen) num volume total de 10 ul. A amplificação por PCR subsequente foi realizada utilizando o Biorad IQ5 iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ou o ABI PRISM 7900HT Instrumento (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) num volume total de 20 ul usando o SYBR QI (laboratórios Bio-Rad) Supermix verdes ou a expressão do gene mastermix TaqMan (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Estocolmo, Suécia) de acordo com os protocolos dos fabricantes. As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela S1. Cada amostra foi executado em duplicatas e ajustado para os correspondentes níveis de mRNA RPL13A. Derreter análise da curva confirmados os produtos de amplificação, os quais também foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 1% para confirmar o tamanho esperado (dados não mostrados).

A imuno-histoquímica

As amostras foram fixadas em formalina tamponada, descalcificadas em ácido fórmico, e embebido em parafina [5]. Cinco uM secções de parafina foram desparafinadas de acordo com procedimentos padrão, fervidos em tampão de citrato 0,01 M, pH 6,0, e imunocoradas para AKR1C3 (NP6-G6.A6, diluída 1:1000, Sigma, St. Louis, Missouri, EUA), AR (PG -21, diluiu-se 1:25, Upstate, Lake Placid, Nova Iorque, EUA), PSA (A0562, diluída 1:2000, DAKO, Glostrup, Dinamarca) e Ki67 (MIB1, diluídas a 1:50, DAKO) com Ultraview Universal Detecção DAB kit (Ventana Medical Systems). AR nuclear e citoplasmática e coloração AKR1C3 PSA em células epiteliais tumorais foram pontuados de acordo com a intensidade (0 = nenhuma coloração, 1 = fraco 2 = moderado, 3 = intensa coloração) e a fracção de células coradas (1 = 1-25%, dois = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = 76-100%). A pontuação total (variando de 0-12) foi obtida multiplicando as pontuações de intensidade de coloração e de fração. Ki67 foram marcados por avaliação de células epiteliais tumorais 300-1000 por paciente, conforme descrito anteriormente [5].

Copiar número análise

O número de cópias do gene AKR1C3 em metástases ósseas de PC foi examinada usando o Hs03060693_cn e os ensaios de número de cópias Hs02574521_cn TaqMan (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Estocolmo, Suécia), visando AKR1C3 exão 2 e o exão 7, respectivamente. Os ensaios foram executados de acordo com a descrição do fabricante, com RNaseP como gene de referência, e analisados ​​usando o software de cópia de chamadas (Applied Biosystems).

Immunoblotting

22Rv1 células foram mantidas de acordo com as instruções do fabricante ( ATCC) e a proteína foi extraído como acima. As amostras (10 ug de proteína) foram separados por 7,5% SDS-PAGE sob condições redutoras e subsequentemente transferidos para membranas de PVDF (Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA). As membranas foram bloqueadas em leite 5%, seguido por incubação do anticorpo primário em 4 ° C durante a noite (N-20 anticorpo, diluída 1:500 em 1% de leite /PBST, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), a fim de detectar a cheio comprimento AR e aproximadamente 80 kDa truncada AR-Vs com N-terminais intactos. Aplicou-se o IgG anti-coelho secundário (Dako, Glostrup, Dinamarca) anticorpo (diluído 1:20 000 em leite 2,5%) após a lavagem em PBST e incubados durante 1 h em TA. A expressão proteica foi visualizado após lavagem exaustiva utilizando o kit de detecção ECL Avançada (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Os filtros foram então retirados, de acordo com procedimentos padrão, e analisadas para os níveis de proteína actina, utilizando o anticorpo de coelho anti-actina a partir de Sigma (Saint Louis. Missouri), diluída 1:8000, a fim de assegurar o carregamento igual de amostra. sinais de ECL foram quantificados usando um scanner ChemiDoc e o software Quantity One 4 (Bio-Rad Laboratories). A intensidade da banda de 80 kDa em cada amostra de doente foi analisado e expresso em relação à intensidade da banda AR comprimento completo correspondente. O extrato celular 22Rv1 foi executado como uma amostra de controlo positivo em cada gel.

A análise estatística

As correlações entre variáveis ​​foram analisadas por meio do teste de Spearman. Os grupos foram comparados utilizando o teste U Mann-Whitney para variáveis ​​contínuas eo teste do qui-quadrado para as variáveis ​​categóricas. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada com a morte do PC como um evento e tempo de acompanhamento como o tempo entre a cirurgia metástases e o mais recente exame de acompanhamento (Dezembro de 2012). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o Statistical Package for the Social Sciences, software SPSS 20.0 (SPSS, Inc, Chicago, EUA). A P-valor menor ou igual a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Sem indução geral de enzimas esteroidogênicas em resistente à castração em comparação com metástases ósseas de hormônio-naïve

níveis de enzimas-chave envolvidas na formação de testosterona e DHT a partir do colesterol (Figura 1) expressão dos genes foram avaliados por análise de RT-PCR de HN (n = 9) e metástases ósseas CRPC (n = 45) em comparação com o da próstata primário zona periférica tumor (n = 13) e o tecido da próstata não maligno (n = 13).

Enzimas com os níveis de ARNm significativamente mais elevados observados em metástases ósseas do que nos não-maligna e /ou tecido prostático maligno são mostradas em negrito e enzimas com níveis significativamente mais baixos observados em metástases ósseas são mostrados em

itálico

. Esteróides secretados pela glândula adrenal são destacadas em cinza.

Nenhuma das enzimas analisadas na via esteroidogênese (Figura 1 e 2) mostraram significativamente diferentes níveis de expressão de mRNA entre HN e metástases ósseas CRPC (para comparação entre metástases e tecido da próstata veja abaixo). A variabilidade entre diferentes metástases CRPC foi no entanto grande e indivíduos com especialmente elevada expressão de enzimas esteroidogénicas específicos foram observados no grupo CRPC (Figura 2).

Todos os níveis de mRNA foram corrigidas para os níveis de ARNm do gene de manutenção e RPL13A normalizada para o valor mediano das amostras de tumor primário. * P 0,05. ** P 0,01, *** P 0,001. círculos abertos indicam outliers e extremos. X indica níveis extremos fora da escala.

metástases ósseas de câncer de próstata pode converter fracos andrógenos circulantes em outras mais potentes, mas provavelmente tem baixa capacidade geral para de-novo steroidogenesis

níveis de transcrição de enzimas nas etapas iniciais da esteroidogénese foram reduzidos em metástases ósseas HN e CRPC, em comparação com o tecido da próstata não maligna (Figura 2); CYP11A1 média, os níveis de CYP17A1, e HSD3B2 ARNm foram de 0,15, 0,29, e 0,32 vezes em HN e 0,14, 0,32, e 0,31 vezes em metástases ósseas CRPC, em comparação com os níveis no tecido da próstata não maligno (P = 0,004, 0,025 e 0,071, e P = 0,00004, 0,019 e 0,01, respectivamente). O nível de ARNm de CYP11A1 mediana nas metástases CRPC foi de 0,41 vezes em comparação com o nível no tecido do tumor primário (P = 0,011, Figura 2), enquanto os níveis de ARNm HSD3B2 CYP17A1 e em metástases ósseas CRPC não foram significativamente diferentes dos níveis no primário tecido tumoral. No entanto, os níveis de ARNm de CYP11A1 foram correlacionados com a CYP17A1 correspondente, níveis HSD3B2, SRD5A1 e ARNm SRD5A2 nas metástases CRPC (Rs = 0,80, P 0,000001, R = 0,740, P 0,000001, Rs = 0,53, P 0,0002, e rs = 0,70, P . 0,000001), indicando que os primeiros passos de esteroidogênese pode estar ativo nas metástases individuais

níveis de transcrição de muitas enzimas envolvidas nas etapas posteriores da síntese de andrógenos foram aumentados em metástases em comparação com não-malignas próstata e no tecido do tumor primário (Figura 2). O AKR1C3 mediana e os níveis de ARNm AKR1C2 foram de 5,5 e 5,4 vezes superior em HN (P = 0,03, P = 0,007) e 3,7 e 5,8 vezes mais elevados em metástases ósseas CRPC (P = 0,0006, P = 0,00008), respectivamente, em comparação com primário tumores da próstata. Observou-se uma mudança a partir de SRD5A2 a expressão de ARNm de SRD5A1 com a progressão da próstata não maligno para PC e PC metástases (Figura 2), que está de acordo com resultados em estudos anteriores [14], [15], [19]. Um deslocamento similar de expressão HSD17B6 principalmente em tecido de tumor da próstata não maligno primário e se principalmente a expressão HSD17B10 metástases em PC foi além disso observado (Figura 2). Os níveis de mRNA AKR1C3 foram significativamente correlacionada com a AKR1C2 e níveis de mRNA UGT2B15 (Rs = 0,39, p = 0,008 e rs = 0,49, P = 0,001).

Em conjunto estes resultados indicam que a metástases ósseas de PC em pacientes pode tem capacidade induzida para converter andrógenos com baixa afinidade AR em andrógenos mais potentes, enquanto

de novo

síntese de andrógenos a partir do colesterol é menos provável.

Algumas metástases ósseas expressam níveis muito elevados de AKR1C3

Embora nenhuma das enzimas esteroidogénicas examinados mostraram um aumento significativamente os níveis de expressão em comparação com CRPC metástases ósseas HN, metástases CRPC individuais foram anotados para expressar a níveis muito elevados de transcrição (Figura 2). Uma enzima mostrando níveis particularmente elevados de mRNA em um subgrupo de metástases CRPC foi AKR1C3. Uma vez que esta enzima tem a capacidade de converter de circulação de DHEA e androstenediona (sintetizado nas supra-renais) em 5-androstenodiol e testosterona, considerou-se ser de particular interesse.

Para determinar se os níveis de mRNA AKR1C3 nas metástases se reflectiu nos níveis de proteína correspondentes, avaliamos a expressão da proteína AKR1C3 por imuno-histoquímica e por meio de um sistema de pontuação que levou tanto a intensidade e distribuição de coloração em conta (Figura 3). Citoplasmática imunocoloração AKR1C3 foi demonstrado na maioria das células epiteliais do tumor, enquanto a coloração nuclear foi heterogênea observada e não marcou. Todas as metástases apresentou forte coloração positiva nas células endoteliais, enquanto que a coloração variável foi observada em fibroblastos e células hematopoiéticas na medula óssea. A imunocoloração AKR1C3 pontuação total foi altamente correlacionada com os níveis de ARNm AKR1C3 nas metástases correspondentes (R = 0,73, P 0,000001, n = 51). expressão alta AKR1C3 não foi devido à amplificação do gene AKR1C3, de acordo com AKR1C3 análise do gene número de cópias de 6 amostras metástases (3 amostras com níveis de mRNA AKR1C3 extremas e escores totais de positividade de 12 e 3 amostras com baixa expressão AKR1C3) em relação à 2 não amostras de próstata maligna (dados não mostrados).

Uma pontuação total (variando entre 0-12) foi obtida multiplicando a pontuação da intensidade da coloração (0-3) em que o tumor células epiteliais com o resultado positivo (fracção 1 -4). (A) Histograma de acordo com a pontuação total coloração AKR1C3 na hormona-naïve (cinza) e resistente à castração metástases (preto) ósseas. (B) seção Representante da metástase óssea com AKR1C3 total de 0. pontuação secção Representante da metástase óssea com AKR1C3 pontuação total (c) 12. Bar indica 100? M.

Nos metástases ósseas CRPC, o AKR1C3 pontuação total de coloração foi correlacionada com os níveis de ARNm UGT2B15 (Rs = 0,39, P = 0,009, N = 43), o que pode indicar a produção de DHT em metástases com a expressão da proteína de alta AKR1C3. Foi no entanto óbvio que a expressão da proteína de alta AKR1C3 não estava diretamente ligada à alta atividade de AR nas metástases CRPC; 14 dos 18 (78%) amostras com graus de marcação alta AKR1C3, definida como uma AKR1C3 imunocoloração pontuação acima de mediana (6), e 15/25 (60%) amostras com graus de marcação de baixo AKR1C3 (≤6) mostraram alta coloração AR nuclear pontos (≥8, acima de mediana, conforme definido em [5], P = 0,22). De acordo com os resultados anteriores [5], de alta imunocoloração AR nas metástases foi associado à sobrevida específica para o câncer mais curto após a cirurgia metástases (log-rank = 8,1, P = 0,004, n = 45). Em contraste com isto, não houve correlação entre a imunocoloração encontrado AKR1C3 sobrevivência e específica do cancro de pacientes depois da cirurgia CRPC metástase (dados não mostrados). Também não houve associação observada entre a imunocoloração pontuação AKR1C3 e a marcação com PSA (dados não mostrados) ou o índice de proliferação de células tumorais (Ki67 pontuação coloração, dados não mostrados).

A expressão de enzimas esteroidogénicas em relação aos níveis de emenda receptor de andrógeno variantes

O AR níveis de proteína foram estudados por análise de imunotransferência de 29 metástases ósseas CRPC selecionados com base em resultados AR imunohistoquímica para incluir AR baixo para AR metástases pontuação elevada, e onde o tecido adequado permaneceu para permitir immunoblot análise. O AR de comprimento total de aproximadamente 110 kDa, foi detectada na maioria dos casos, enquanto truncada AR-Vs de aproximadamente 80 kDa, a hipótese de representar AR variantes de processamento a que falta o domínio LBD C-terminal, foram detectados em alguns casos (Figura 4). A intensidade da banda de 80 kDa foi fortemente correlacionado com o nível de AR-V7 ARNm correspondente (R = 0,76, P 0,000002, dados não mostrados), de acordo com os resultados anteriores próprios [8]. Em HORNBERG et ai [8] pacientes com níveis elevados de metástase de AR-V7 ARNm, definido para ter os níveis de mRNA no quartil superior, foram encontrados a ter extremamente mau prognóstico. Com base nesse conhecimento, e usando uma abordagem semelhante, 7 amostras analisadas por immunoblotting foram definidos para expressar altos níveis de AR-Vs como a relação entre as intensidades de 80 e 110 kDa foram encontrados dentro do 75

percentil dos dados (≥0.5).

a análise foi realizada utilizando um anticorpo como alvo o domínio N-terminal de AR. O extrato celular 22Rv1 foi incluído como um controlo positivo.

Curiosamente, apenas um em cada 13 (7,8%) metástases CRPC com alta expressão AKR1C3 (imunocoloração pontuação acima de mediana) também mostrou proteína de alta AR-V níveis. Esta era uma fracção significativamente mais baixa do que a encontrada entre os níveis com metástases AKR1C3 baixa (6/15, 40%, P = 0,049). Nós ainda mais a hipótese de que a expressão de células tumorais de AKR1C3 e variantes AR constitutivamente ativos poderia ser de relevância para a resposta tumor individual para 2

nd ADT line e progressão clínica [8], e os 28 metástases ósseas avaliadas tanto para AKR1C3 e AR-V expressão foram, portanto, divididos de acordo com os seus níveis de expressão de proteína AKR1C3 AR-V e, como mostrado na Figura 5, a fim de demonstrar o sub-grupos de possível relevância clínica.

altos níveis AKR1C3 foram basicamente encontrados nas metástases com baixo níveis de AR-Vs e vice-versa (P = 0,049, de acordo com o teste do qui-quadrado).

Notavelmente, nenhuma das metástases com coloração homogênea AKR1C3, ou seja, fração de células marcadas positivamente acima de 75% , mostrou níveis elevados AR-V comparados com 7/15 metástases com 75% de células coradas positivamente (P = 0,004). Esta observação merece ser aprofundada, uma vez que pode indicar que altos níveis de AR-V são induzidas preferível em células tumorais sem steroidogenesis endógeno. Infelizmente, não fomos capazes de estudar esta hipótese de heterogeneidade entre as células tumorais como anticorpos para a avaliação imuno-histoquímica de AR-Vs não estavam disponíveis.

Discussão

síntese intra-tumoral de testosterona e DHT tem sido sugerido para contribuir para o crescimento CRPC. Neste estudo, compararam os níveis de enzimas esteroidogênicas em metástases ósseas CRPC com níveis de metástases obtidas de pacientes un-tratados e, expressão surpreendentemente, não encontrou nenhuma indução das enzimas examinados em CRPC comparação com metástases HN. Nós, entretanto, encontraram níveis elevados de expressão de certas enzimas esteroidogênicas; SRD5A1, AKR1C2, AKR1C3, e HSD17B10, em metástases ósseas quando comparado a próstata não maligno da próstata e no tecido do tumor primário. Além disso, fomos capazes de mostrar diferenças distintas nos níveis de expressão de AKR1C3 e níveis de variantes de splicing AR em casos individuais de metástases ósseas CRPC, que nossa hipótese poderia ser de relevância para a resposta do paciente a 2

nd terapias de linha.

androgénios de tecidos pode ser obtido por

de novo

síntese a partir do colesterol [20], [21], ou por conversão de precursores de esteróides supra-renais em mais potentes [22]. Nossos resultados mostram geralmente níveis elevados de AKR1C3 e SRD5A1 nas metástases estão em linha com os relatórios anteriores [14], [15], [16] e pode indicar a síntese de testosterona e DHT em uma e duas etapas, respectivamente, de androstenediona derivada-adrenal . Por a actividade de SRD5A1, DHT poderiam também ser sintetizados através de redução do efeito de 5α da androstenediona em androstanodiona e depois pela redução adicional de androstanodiona a DHT por AKR1C3. Esta via para a síntese de DHT, que contorna a testosterona, foi recentemente mostrado por Chang e colegas de trabalho para dominar em linhas celulares CRPC, bem como em amostras de pacientes metástases estimuladas com androstenodiona [23]. Além disso, os altos níveis de AKR1C2 e HSD17B10 fazer a síntese de DHT através androsterona e androstanediol possível em casos individuais, semelhante ao que tem sido observada em linhas de células PC, bem como em xenoenxertos CWR22R resistente à castração em ratos [24]. síntese intra-tumoral de androsterona e androstanediol poderia estimular o crescimento do tumor não só como esteróides intermediários na síntese de DHT, mas também ativadores AR como potentes em casos com ARs mutantes [25]. Da mesma forma poderia Androstenediol, presumindo produzido a partir de DHEA em metástases com atividade AKR1C3, ativar ARs com mutações específicas [26]. Em contraste com os relatórios iniciais [14], [15], mas em linha com Hofland e colegas de trabalho [16], encontramos níveis baixos de expressão de CYP11A1, CYP17A1 e HSD3B2 em ambas as metástases não tratadas e CRPC. Altos níveis de CYP11A1, CYP17A1 e de mRNA HSD3B2 foram em vez disso encontrou no tecido da próstata não maligno, provavelmente devido à elevada síntese dessas enzimas em células do estroma da próstata normais, e o mesmo era verdade para SRD5A2 e HSD17B6 [27], [28], [ ,,,0],29], [30]. A partir disso, gostaria de concluir que os andrógenos derivada-adrenal, provavelmente contribuem para o crescimento de metástases ósseas CRPC por sua conversão intra-metastático em andrógenos mais potentes, enquanto

de novo

síntese de andrógenos a partir do colesterol dentro de metástases é menos provável , excepto talvez em casos individuais com expressão correlacionada de CYP11A1, CYP17A1, e HSD3B2.

Nós encontramos níveis de AKR1C3 alta expressão em um sub-grupo de metástases ósseas de PC, o que confirma resultados anteriormente relatados no ensino primário resistente à castração tumores de próstata [16], [31] e do tecido CRPC metastático de origem diferente [14], [15], [32]. Um aumento na actividade AKR1C3 poderia obviamente contribuir para a conversão de esteróides supra-renais em derivados de ligandos de AR mais potentes, como discutido acima, e para AR activação em CRPC. Da mesma forma, Hamid e colaboradores demonstraram AKR1C3 dependente da síntese da testosterona em células estimuladas com DHEA CRPC [31]. Os efeitos benéficos de níveis elevados AKR1C3 em metástases HN ou em metástases com baixa imunocoloração AR nuclear, como demonstrado por alguns casos neste estudo, são menos claros, mas pode depender de outras reações impulsionado por esta enzima. Além desidrogenase 17β-hidroxiesteróide (17β-HSD) AKR1C3 actividade também possui prostaglandina F sintase (PGF), o que levaria a proliferação em células PC independentes de androgénio e estado AR devido à formação de epímeros PGF e a activação do receptor FP e também pela prevenção da formação de PGJ2 e seus efeitos pró-diferenciação e anti-proliferativa [33].

em conclusão, queremos enfatizar que a expressão aumentada de tumor de enzimas esteroidogênicas em pacientes individuais não está claramente associada com CRPC mas meramente associada com tumor estádio avançado, como pode ver-se não só no tecido CRPC de origem diferente [14], [15], [16], [31], [32], mas também na não-tratados previamente, HN, metástases ósseas (neste estudo). Além disso, este estudo em conjunto com estudos prévios indicam que os tumores CRPC poderiam ser classificados de acordo com os padrões de expressão distintas de enzimas esteroidogénicas, e assim, provavelmente, diferentes mecanismos atrás castração-resistência (este estudo e [16], [32], [34]). Nós, adicionalmente, mostram que o sub-grupo de metástases ósseas CRPC que expressam níveis elevados de AKR1C3 é em grande parte distinta do sub-grupo que expressam elevados níveis de LBD-truncados, constitutivamente activa AR-Vs. A possível relevância clínica deste facto é que os pacientes com expressão alta AKR1C3 e baixa expressão AR-V pode ser pacientes que apresentam boa resposta ao tratamento com acetato de abiraterona (inibição CYP17, [35]) e /ou se beneficiariam de drogas segmentação AKR1C3 [36] , enquanto os pacientes com alta expressão de constitutivamente ativa AR-Vs provavelmente não irá responder ao acetato de abiraterona ou a qualquer terapia visando a síntese de andrógenos ou o LBD da AR.

Uma limitação a este trabalho é o número restrito de osso metástases, e, além disso, a amostra metástase única examinado a partir de cada paciente, o que, obviamente, fazer conclusões sobre esta doença heterogênea e estado geral do paciente incerto. Também estamos cientes de que os níveis de expressão não refletem, necessariamente, atividades biológicas e nossa hipótese de que padrão de AKR1C3 esteroidogênica e variantes AR constitutivamente ativos expressão tumor seria prever a resposta aos 2

nd terapias linha de CRPC precisa ser testado adiantado em estudos clínicos.

Informações de Apoio

Tabela S1.

sequências de iniciadores utilizados para a análise em tempo real RT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077407.s001

(DOC)

Reconhecimentos

hábil técnica a ajuda foi prestada pela Sra Pernilla Andersson, Elisabeth Dahlberg, Birgitta Ekblom e Inger Lindström.