Abstract

Resistência à quimioterapia continua a ser um grande obstáculo na terapia do cancro. Este estudo teve como objetivo avaliar o mecanismo molecular e eficácia de honokiol na indução de apoptose e melhorando paclitaxel quimioterapia em resistentes modelos (MDR) de câncer de multi-drogas pré-clínicos, incluindo MDR humano derivado de linhagem (KB-8-5, KB-C1, KB-V1) e seus sensíveis KB-3-1 linhas celulares de cancro da droga parental.

In vitro

análises demonstraram que honokiol proliferação eficazmente inibida em células KB-3-1 e os derivados MDR (IC

50 variando 3,35 ± 0,13 ug /ml a 2,77 ± 0,22 ug /ml), apesar da sua diferenças significativas em resposta ao paclitaxel (IC

50 variando 1,66 ± 0,09 ng /ml a 6560,9 ± 439,52 ng /mL). Honokiol induzida mitocôndrias-dependente e morte apoptose mediada pelo receptor em células MDR, KB que foi associada à inibição de sinal do EGFR-STAT3 e regulação negativa de genes alvo STAT3. tratamento combinado com honokiol e paclitaxel sinergicamente aumentada citotoxicidade nas células MDR KB, em comparação com o tratamento com qualquer agente sozinho

in vitro

. É importante ressaltar que o tratamento combinado inibiu significativamente

in vivo

crescimento de KB-8-5 tumores em um modelo subcutâneo. Os tecidos tumorais do grupo combinação exibia uma significativa inibição da expressão de Ki-67 e um aumento das células positivas TUNEL em comparação com o grupo de controlo. Estes resultados sugerem que a segmentação multirresistência usando honokiol em combinação com drogas quimioterápicas podem fornecer novas oportunidades terapêuticas

Citation:. Wang X, Beitler JJ, Wang H, Lee MJ, Huang W, Koenig L, et al. (2014) Honokiol Melhora Paclitaxel Eficácia em multi-resistente Modelo Humano do Câncer através da indução de apoptose. PLoS ONE 9 (2): e86369. doi: 10.1371 /journal.pone.0086369

editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de outubro de 2013; Aceito: 08 de dezembro de 2013; Publicação: 25 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Cancer Institute (NCI), através de uma cabeça e de pescoço do cancro prêmio SPORE (P50CA128613), CA138292 P30, e AR47901. D.M.S., J.J.B., e Z.G.C. também gostaria de reconhecer a Geórgia Cancer Coalition para o apoio. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. A.R.M. Ruhul Amin atualmente é membro PLOS ONE Editorial Board. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Hyung Ju C. Shin atualmente é empregado por uma empresa comercial Quest Diagnostics, Atlanta. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A quimioterapia continua sendo uma das principais opções de tratamento para muitos tipos de câncer, no entanto, uma significativa percentagem de pacientes desenvolvem resistência à droga, durante o decurso da quimioterapia, e inevitavelmente progredir sem cura [1], [2]. Apesar do progresso notável no desenvolvimento de medicamentos, o paclitaxel com o seu largo espectro anticancerígeno solidificou a perturbação de dinâmica dos microtúbulos como uma das estratégias anti-cancro mais eficazes em uso hoje em dia. No entanto, o aparecimento de células cancerosas resistentes a drogas tem limitado grandemente a sua eficácia clínica. Portanto, é imperativo para desenvolver novas estratégias para reduzir ou superar chemoresistance no câncer. Várias abordagens para melhorar chemoresponse em modelos de cancro quimiorresistentes foram explorados, incluindo as que combinam os produtos naturais ou os compostos com paclitaxel ou com outros reagentes de quimioterapia convencionais.

Honokiol é um componente natural isolado a partir da casca da árvore magnólia [2], [3], que tem sido tradicionalmente usada para tratar distúrbios relacionados com a ansiedade e distúrbios digestivos [2], [4]. Curiosamente, honokiol também exibiu actividade anti-cancro potentes [5], [6], [7] e quimioterapias convencionais reforçada em uma variedade de modelos pré-clínicos de cancro humano, incluindo leucemia linfocítica crónica [3], o cancro da próstata [8] e mieloma múltiplo [9]. Esses recursos anticancerígenos relativamente ampla e perfil de segurança favorável fazer honokiol uma terapia auxiliar atraente para melhorar a quimioterapia convencional em ambientes clínicos.

A superexpressão de proteínas anti-apoptóticos é um mecanismo subjacente que contribui para a aquisição de resistência terapêutica, recorrência e metástase. Um crescente corpo de evidências sugere que três proteínas anti-apoptóticos, isto é, survivin, Mcl-1 e Bcl-2, pode estar diretamente relacionado à resistência aos medicamentos em câncer [10], [11]. A inibição destes factores de sobrevivência cruciais foi mostrado para desencadear a apoptose e sensibilizar as células cancerosas para o tratamento de droga [5] -. [11], assim, esta abordagem pode ser promissora em superar quimiorresistência e melhorar a quimioterapia no cancro

Usando uma série de linhas humanas KB derivado da linhagem de células escamosas cancro que apresentam sensibilidades distintas para o tratamento com paclitaxel, foi demonstrado que o honokiol poderia efectivamente induzir a apoptose em células cancerosas resistentes a múltiplas drogas (MDR). Estudos mecanísticos honokiol mostrou que inibe a EGFR-STAT3 via de sinalização, e suprime a expressão de survivina e outros factores de sobrevivência. Demonstramos ainda mais o

in vivo

eficácia de honokiol no tratamento do câncer MDR e melhorar a eficácia paclitaxel.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

O KB- 3-1 e os seus derivado de linhas celulares MDR foram generosamente fornecidos pelo Dr. Michael M. Gottesman (NCI, NIH, Bethesda, MD) e têm sido caracterizados anteriormente [12]. As células KB-3-1 foram mantidas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%. As células KB-8-5 e KB-C1 foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 0,01 e 1 ug /mL de colchicina, respectivamente. As células KB-V1 foram mantidas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% e 1 ug /ml de vinblastina. Para eliminar o impacto de colchicina ou vinblastina em resultado experiência, as células resistentes foram cultivados em meio isento de drogas durante uma semana antes de qualquer experiência.

Crescimento celular Ensaio

As células foram semeadas a uma densidade de 5 × 10

3 células por poço em placas de 96 poços em quádruplo. Vinte e quatro horas mais tarde, as drogas foram adicionadas em vários intervalos de concentração como agentes isolados ou em combinações de duas drogas e, em seguida, incubadas durante 72 h. O intervalo para o honokiol foi de 0,625 a 20 ug /ml para todas as quatro linhas celulares. Para o paclitaxel, o intervalo de concentração de 0.19 a 97,5 ng /ml, 3,02 ng /ml a 3,12 ug /ml, 12,1 ng /ml e 25,0 ug /ml e 97,5 ng /ml a 100 ug /ml para KB-3-1 , KB-8-5, KB-C1, e KB-V1 células, respectivamente. inibição do crescimento celular foi medida por determinação da densidade celular com o ensaio de sulforrodamina B. A percentagem de inibição foi determinada por comparação da densidade celular nas células tratadas com droga com a das células de controlo não tratadas. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

Análise de Apoptose

A apoptose foi analisada em todas as quatro linhas celulares. As células foram tratadas com honokiol, paclitaxel, ou sua combinação, tal como indicado nas legendas das figuras, tripsinizadas e lavadas em PBS frio 1 ×. As células foram ressuspensas em tampão de ligação 1 × Anexina (BD PharMingen), e depois coradas com anexina V-ficoeritrina (PE-Anexina V; BD Pharmingen) e 7-AAD (BD PharMingen) durante 15 min à temperatura ambiente. As amostras manchadas foram medidas utilizando uma célula activado por fluorescência (FACS) calibre de bancada de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). software FlowJo (ár, Ashland, OR) foi usada para análise de apoptose. As experiências foram repetidas 3 vezes de forma independente.

imunotransferência

Trinta microgramas de proteína a partir de extractos de células completas ou fracções citoplasmática e mitocondrial foram quantificados, separados em géis de SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. Depois de ter sido bloqueada com 5% de leite em pó magro em tampão de TBS-T, as membranas foram incubadas com anticorpos específicos durante a noite a 4 ° C. De murganho anti-actina-β anticorpo (Trevigen, Gaithersburg, MD) foi utilizada como um controlo de carregamento de amostra. bandas de proteínas imunomarcadas foram detectadas com um kit de quimioluminescência aumentada (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Os experimentos foram repetidos 3 vezes.

In vivo

Anti-tumor Eficácia Ensaio

O experimento animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade de Emory. As células KB-8-5 (5 × 10

5) s.c. foram injetados em 4-5 ratinhos nus femininos semanas de idade (atímicos

nu /nu

, Taconic NY). Quando os tumores tinham desenvolvido até cerca de 100 milímetros

3, os ratinhos foram divididos em quatro grupos (n = 7 ou 8) de modo a minimizar as diferenças de peso e tamanho do tumor entre os grupos: grupo de controlo tratado com 20% Intralipid ( Baxter Healthcare), grupo honokiol (1,0 mg /rato ou 50 mg /kg), grupo de paclitaxel (20 mg /kg), e honokiol (1,0 mg /rato ou 50 mg /kg) mais paclitaxel (20 mg /kg) grupo de combinação . Honokiol foi dissolvido em 100% de etanol e misturou-se com 20% Intralipid num (v /v) relação de 01:14. Honokiol foi administrada aos murganhos 3 vezes por semana a 1,0 mg /ratinho (ou 50 mg /kg) via injecção intraperitoneal. O paclitaxel foi administrado aos ratinhos, uma vez por semana a 20 mg /kg através de uma injecção na veia da cauda. A terapia foi continuada durante 4 semanas. O peso corporal e o tamanho do tumor foram medidos três vezes por semana. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula:

V

=

//6 × diâmetro maior x (diâmetro menor) [13]. Os ratinhos foram sacrificados 4 semanas após o início do tratamento. tecidos tumorais e de órgãos (fígado, coração, pulmão, baço e rins) foram coletadas para a H . E coloração e imuno analisa

A imuno-histoquímica e TUNEL Ensaio

A análise imunohistoquímica para Ki-67 coloração em tecidos de xenoenxerto de ratinho embebidos em parafina foi realizada como previamente descrito [13]. Células coradas positivamente para o Ki-67 foram contados e a percentagem de células positivas foi calculada. Uma média das leituras 8 foi utilizado para a análise estatística.

ensaio TUNEL foi realizado por imunofluorescência usando as mesmas amostras como anteriormente, seguindo o procedimento fornecido pelo fabricante (Promega, Madison, WI). Para a análise dos resultados do ensaio, o número de células total e o número de células positivas na mesma área foram contadas por cinco áreas aleatórias; o resultado foi apresentado como uma proporção média do número de células positivas em relação ao número total de células.

Análise Estatística

A significância estatística do tratamento de células no

in vitro

ensaio de citotoxicidade foi avaliada por meio de Student

t

-teste. Para

In vivo

antitumoral ensaio de eficácia, um modelo misto de log-linear com intercepção aleatório foi utilizada para comparar o significado dos volumes do tumor significativo entre cada grupo. A significância estatística do efeito do tratamento no microtúbulos, apoptose e proliferação celular em tecidos tumorais de xenoenxertos foi avaliada através do teste de Kruskal-Wallis (ANOVA one-way).

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todas as análises

Resultados

Honokiol Reduz Viabilidade e induz a apoptose em células cancerosas humanas MDR

O MDR linhas celulares de cancro da KB-8-5, KB-C1 e KB-V1 foram derivados a partir de sua contraparte sensível a drogas KB-3-1 células, e têm sido amplamente utilizados como um modelo clinicamente relevante no estudo da resistência a drogas [14] , [15]. Estas células exibiram sensibilidades distintas para o tratamento com paclitaxel. Como mostrado na Fig. 1A, 1B, IC

50 valores em linhas de células de MDR (KB-8-5:26.73 ± 1,01 ng /mL, KB-C1:195.0 ± 11,11 ng /ml, e KB-V1:6560.0 ± 439,52 ng /ml) foram aumentadas em 16-, 117- e 4000 vezes, respectivamente, quando comparado com a linha de células KB-3-1 parental (1,66 ± 0,09 ng /ml). Consistente com seu fenótipo resistente, linhas celulares MDR expressar substancialmente a clássica MDR marcador P-glycoprotien (Fig. 1b). Curiosamente, um 72-h de tratamento com honokiol eficazmente reduzida a viabilidade das células de MDR (KB-8-5:3.22 ± 0,14 ug /mL, KB-C1:3.04 ± 0,30 ug /ml, KB-V1:2.77 ± 0,22 ug /ml), com IC

50 valores semelhantes aos de células KB-3-1 (3,35 ± 0,13 ug /ml) (Fig. 1c, 1d). A apoptose análise mostrou também que a apoptose induzida por honokiol de forma tempo e dose-dependente (Fig. 1E). 24 h após o tratamento honokiol, a percentagem de células apoptóticas KB-3-1 foi de 11,9 ± 3,9% (5 ug /ml de honokiol), 32,9 ± 0,9% (10 ug /ml), e 47,1 ± 2,7% (15 ug /ml); a percentagem de células apoptóticas aumentou para 18,4 ± 2,1%, 51,5 ± 0,6% e 65,3 ± 1,6%, respectivamente, na sequência de um tratamento de 48 h-, que foi ainda aumentada às 72 horas. Honokiol também induziu um grau semelhante de apoptose de outras células MDR, KB-8-5, incluindo, KB-C1 e KB-V1 (Fig. 1E). Por exemplo, um 48-h de tratamento com 10 ug /ml de honokiol resultou em apoptose em 51,5% de células KB-3-1, 52,7% de células KB-8-5, 52,9% de células KB-C1 e 67,6% de As células KB-V1, respectivamente. Estes dados são consistentes com o ensaio de viabilidade (Fig. 1C, 1D), e sugerem que o honokiol é um agente citotóxico potente em células KB independentemente das suas sensibilidades diferentes de paclitaxel.

(a, b) efeito de inibição do crescimento de paclitaxel e de expressão de p-gp no KB-3-1, KB-8-5, células KB-C1 e KB-V1. A IC

50 valores de paclitaxel em drogas KB-8-5 resistentes, células KB-C1 e KB-V1 foram aumentadas em 16-, 117- e 4000 vezes, respectivamente, quando comparadas com as células KB-3-1 parentais . (C, d) Crescimento efeito de inibição de honokiol no KB-3-1, KB-8-5, células KB-C1 e KB-V1. O IC

50 valores de honokiol em células KB-V1 drogas KB-8-5 resistente, KB-C1 e foram semelhantes às que, em células KB-3-1 parentais. (E) Honokiol induz a apoptose em células KB. KB-3-1 e células KB-8-5 foram tratados com 5, 10, 15 ug /ml de honokiol para 24, 48 e 72 h. As células KB-C1 e KB-V1 foram tratados com honokiol durante 48 h. A apoptose foi medida por coloração de anexina V-ficoeritrina. * Indica valores estatisticamente significativos p (*, em relação ao controlo, p 0,05; **, contra 5 mg /ml, p 0,05).

Honokiol Induz Mitochondria- and Death Receptor (DR) – a apoptose em Humano do Câncer células dependentes

Nós investigamos o mecanismo de apoptose induzida por honokiol em células KB. Como mostrado na Fig. 2a-c, honokiol tratamento induziu a clivagem de PARP e da caspase-3 em uma dose e modo dependente do tempo em todas as células KB testados, indicando que a activação de sinais apoptóticos. As análises Western blot verificou que honokiol induzida não só a libertação de citocromo

C

no citoplasma de uma forma dependente da dose (Fig. 2D), mas também aumentou a expressão de DR5 (Fig. 2d), uma superfície ligandos do receptor de pró-apoptóticos de Apo2L /TRAIL. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que o honokiol poderia activar simultaneamente mitocôndrias-dependente apoptose (intrínseco) e DR-dependente (extrínseca) a apoptose em células KB.

(a), KB-3-1 células e (b) KB -8-5 células foram tratadas com 5, 10, 15 ug /ml de honokiol para 24, 48 h. Full-length e PARP clivada, caspase-3 clivada e β-actina como um controlo de carga foram detectados por imunotransf erência utilizando lisados ​​de células inteiras. (C) C1-KB e células KB-V1 foram tratados com 5, 10, 15 ug /ml de honokiol durante 48 h. PARP clivada foi detectado por imunotransf erência utilizando lisados ​​de células inteiras. (D) do painel superior, as células KB-8-5 foram tratados com 5, 10, 15 ug /ml de honokiol durante 48 h. Citoplasmática e frações mitocondriais foram separadas e coradas imunologicamente com o anticorpo do citocromo c (Cyto C). COX4 (uma proteína mitocondrial) foi usado para mostrar eficiência de fraccionamento celular. painel inferior, as células KB-8-5 foram tratados com 5, 10, 15 ug /ml de honokiol para 24 e 48 h. DR5 foi detectado por imunotransf erência utilizando lisados ​​de células inteiras. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes, e dados representativos são apresentados.

Honokiol Inibe EGFR-STAT3 sinalização em células cancerosas humanas

A via de sinalização de EGFR-STAT3 desempenha um papel importante na regulação do crescimento e sobrevivência em células cancerosas. Foram investigados os efeitos de honokiol em vários componentes-chave da via de sinalização EGFR-STAT3. KB-3-1 e KB-8-5 células foram tratadas com honokiol (5 ug /ml) durante 0,5, 1, e 2 h. análise de mancha de Western utilizando lisados ​​de células totais revelou uma fosforilação do EGFR marcadamente reduzida em Try1173, um indicador de EGFR activados (Fig. 3A). Examinamos ainda mais o estado de fosforilação da STAT3 (Tyr705), Akt (Ser473) e ERK (Thr202 /Tyr204), três EGFR conhecida a jusante sinalizando componentes. Curiosamente, o tratamento honokiol rapidamente phosphorlylation inibida da STAT3 e AKT, mas não teve efeito sobre a fosforilação de ERK (fig. 3AB). Para analisar se o nível de EGFR e as suas proteínas alvo a jusante de expressão também são inibidas por tratamento honokiol (5 ug /ml), que trataram células durante 24, 48, e 72 h. Como mostrado na Fig. 3CD, tratamento honokiol inibiu a expressão da proteína de EGFR, STAT3, ERK, Akt e de uma forma dependente do tempo da KB-3-1 e células KB-8-5. Do mesmo modo, a fosforilação das proteínas foi reduzida após tratamento honokiol (Fig. 3CD). Consistentemente, os níveis de três genes alvo STAT3 conhecidos, ou seja, a survivina, Bcl-2 e de Mcl-1 de expressão, foram diminuiu drasticamente após o tratamento honokiol (fig. 3e).

KB-3-1 e KB- 8-5 células foram tratadas com 5 ug /ml de honokiol de tempo curto (0,5, 1, ou 2 h), ou tempo (24, 48, ou 72 h). Os lisados ​​celulares totais foram imunotransferidas para as proteínas indicadas. O efeito de honokiol em pontos de tempo iniciais: (a) a fosforilação do EGFR e STAT3; (B) Honokiol diminui a fosforilação de AKT e ERK. O efeito de honokiol em pontos de tempo final: (c) a fosforilação e expressão do EGFR e STAT3; (D) a fosforilação e expressão de AKT e ERK; (E) a expressão de survivina, Bcl-2, Mcl-1. (F) Honokiol inibe a via de sinalização de EGFR e regula negativamente genes alvo STAT3 de uma forma dependente da dose. KB-3-1 e células KB-8-5 foram tratados com 5, 10, 15 ug /ml de honokiol durante 48 h. Os lisados ​​celulares totais foram imunotransferidas para as proteínas indicadas. (G) Honokiol inibe a via EGFR-STAT3 em células KB-V1 e KB-C1. As células KB-C1 e KB-V1 foram tratados com 5, 10, 15 ug /ml de honokiol durante 48 h. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes, e os dados representativos são apresentados.

próxima examinaram a resposta dependente da dose de EGFR-STAT3 sinalização para o tratamento honokiol em KB-3-1 e KB-8 células -5. Como mostrado na Fig. 3f, a expressão e a fosforilação do EGFR (Try1173) foram reduzidos na presença de 5 ou 10 ug /ml de honokiol (48 h), e foram ainda mais reduzida a uma dose de 15 ug /ml de honokiol (Fig. 3f). Consistentemente, a expressão e /ou a fosforilação de componentes de sinalização a jusante de EGFR, incluindo ERK, Akt, STAT3, survivina, Bcl-2 e de Mcl-1, foram também dramaticamente inibido de uma forma dependente da dose (fig. 3f). Um efeito semelhante de honokiol sobre a sinalização do EGFR-STAT3 também foi observado em ambas as células KB-V1 (fig. 3g) e KB-C1. De particular interesse, uma análise de RT-PCR, indicam que a inibição da expressão honokiol survivina pode envolver a supressão da transcrição survivina ao nível do ARNm (Figura S1).

Honokiol Melhora a citotoxicidade in vitro de Paclitaxel em células cancerosas MDR

investigou-se se a inibição da survivina, Bcl-2 e de Mcl-1 por honokiol poderia sensibilizar as células cancerosas MDR à quimioterapia convencional tal como palictaxel. Como mostrado na Fig. 4, 24 h de tratamento com quer honokiol (5 ug /ml) ou o paclitaxel (450 ng /mL) resultou em ≤20% de apoptose em células KB-C1, ao passo que o tratamento combinado com ambos honokiol e paclitaxel resultou em aproximadamente 30% de apoptose . apoptose Além disso, as 48 h e 72 h pontos de tempo, o tratamento combinado induzida de forma mais eficaz (76% e 86%, respectivamente) em células KB-C1 do que qualquer agente único (≤25%) ou o controlo de veículo. Consistentemente, o tratamento combinado, foi mais eficaz na indução da apoptose do que qualquer agente isolado em células MDR KB-8-5 e KB-V1 (Fig. 4). Usando o ensaio de células KB-8-5 como um exemplo, um índice de combinação (IC) confirmou o efeito sinérgico do tratamento combinado com honokiol e paclitaxel na redução da viabilidade das células cancerosas MDR (Tabela S1).

(um ) KB-8-5, (b), KB-C1, e (c) as células KB-V1 foram tratados com 5 ug /ml de honokiol, paclitaxel (15 ng /ml para KB-8-5, 450 ng /ml durante KB-C1, e 6? g /ml para KB-V1), ou a combinação das duas drogas nas concentrações indicadas por 24, 48, e 72 h. A apoptose foi medida. * Indica valores estatisticamente significativos p (*, associação versus honokiol, p 0,05; **, associação versus paclitaxel, p 0,05). Todas as experiências foram repetidas três vezes.

análise de Western blot ainda verificado que o tratamento combinado com honokiol e paclitaxel foi mais eficaz do que apenas na indução da clivagem de caspase-3, a PARP qualquer um dos agentes, e a liberação do citocromo

c

das mitocôndrias nas células KB-8-5 (Fig. 5a, 5b). Um tratamento de 48 h com honokiol isoladamente ou a combinação de honokiol e paclitaxel diminuiu a expressão e a fosforilação do EGFR, bem como outros componentes de sinalização de EGFR-STAT3 chave, incluindo a STAT3, p-STAT3 (Tyr705), ERK, p-ERK ( Thr202 /Tyr204), Akt e P-Akt (Ser473). A expressão da proteína de survivina, Bcl-2 e de Mcl-1 também foi acentuadamente reduzido mediante o tratamento com honokiol ou a combinação de honokiol e paclitaxel. É interessante notar, no entanto, o tratamento com paclitaxel por si só não tem efeito significativo sobre estes componentes de sinalização ou genes alvo da via EGFR-STAT3 (Fig. 5c).

(a) paclitaxel aumenta Honokiol induzida PARP e caspase 3 clivagem em células KB-8-5. As células foram tratadas com 5 ug /ml de honokiol, 15 ng /ml de paclitaxel, ou a combinação das duas drogas, durante 24, 48 e 72 h. Full-length e PARP clivada, caspase-3 clivada e β-actina como um controlo de carga foram detectados por imunotransf erência utilizando lisados ​​de células inteiras. (B) Honokiol aumenta paclitaxel induzida liberação de citocromo

c

no citoplasma em células KB-8-5. As células foram tratadas com 5 ug /ml de honokiol, 15 ng /ml de paclitaxel, ou a combinação durante 48 h. Citoplasmática e frações mitocondriais foram separadas e coradas imunologicamente com o anticorpo do citocromo c (Cyto C). COX4 (uma proteína mitocondrial) foi usado para mostrar eficiência de fraccionamento celular. (C) Honokiol inibe a via de sinalização de EGFR-STAT3 e regula negativamente a expressão do gene alvo STAT3 em células KB-8-5. As células foram tratadas com 5 ug /ml de honokiol, 15 ng /ml de paclitaxel, ou a combinação durante 48 h. Os lisados ​​celulares totais foram imunotransferidas para as proteínas indicadas. (D) o paclitaxel induz a polimerização de microtúbulos em células KB-8-5. estabilização induzida pelo fármaco dos microtúbulos, como evidenciado por um aumento da massa de polímero resultante de microtúbulos no agrupamento foi observada após tratamento com ambos o paclitaxel e a combinação; no entanto, honokiol por si só não foi eficaz na estabilização dos microtúbulos (aumento de 400x). As células foram tratadas com 5 ug /ml de honokiol, 15 ng /ml de paclitaxel, ou a combinação durante 24 h. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes, e os dados representativos são apresentados.

O paclitaxel exerce a sua actividade antitumoral por ligação a tubulina no interior do lúmen do microtúbulo, resultando em polimerização do microtúbulo, de estabilização e de rompimento de microtúbulos dinâmica, causando a paragem da mitose e a apoptose em células em proliferação. Para investigar se o honokiol pode melhorar o paclitaxel induzida a polimerização de microtúbulos e estabilização, examinámos o efeito de cada tratamento sobre microtúbulos em células KB-8-5 e KB-C1. estabilização de microtúbulos interfase as células tumorais ‘, como evidenciado por um aumento da massa de polímero resultante de microtúbulos em agregação, foi observado após tratamento com ambos o paclitaxel e a combinação droga-induzida; No entanto, honokiol por si só não era eficaz na formação de feixes de microtúbulos (Fig. 5d). Colectivamente, estes dados indicam que honokiol aumenta a

in vitro

citotoxicidade de paclitaxel em cancros MDR, pode ser através da inibição da sobrevivência EGFR-STAT3 sinalização.

Honokiol Melhora a eficácia in vivo de Paclitaxel em MDR cancer xenoenxerto tumores

Foram avaliadas a eficácia antitumoral de honokiol, paclitaxel, e sua combinação no tratamento de câncer de MDR no modelo de xenotransplante KB-8-5. O tratamento foi continuado durante 4 semanas. Como mostrado na Fig. 6a, a uma dose de 20 mg /kg uma vez por semana, uma injecção de 4 semanas de paclitaxel por si só não inibe significativamente o crescimento de KB-8-5 tumores subcutâneos, quando comparado com o controlo de veículo (p = 0,917). O tratamento com honokiol sozinho (50 mg /kg, 3 vezes por semana, através de injecção i.p.) ligeiramente suprimiu o crescimento do tumor, embora a diferença não era significativa (p = 0,194) (Fig. 6a). Em contraste, o tratamento de combinação inibiu dramaticamente o crescimento de tumores KB-8-5, quando comparado com todos os outros grupos (comparada com o controlo: p 0,0001; vs honokiol: p = 0,036; vs paclitaxel: p = 0,004). O volume médio de tumor em cada grupo de tratamento no ponto final foi 2585.4 ± 510,0 milímetros

3 (controle), 1810.2 ± 483,2 milímetros

3 (honokiol), 2591.3 ± 726,2 milímetros

3 (paclitaxel), e 573,9 ± 146.1mm3 (combinação). ratinhos representativos de cada grupo são apresentados na figura (Fig. 6c). Estes resultados indicam que o honokiol podem potenciar significativamente a actividade anti-tumoral de paclitaxel em MDR tumores de xenoenxerto de cancro.

(a) O crescimento do tumor de KB-8-5 xenoenxertos foi significativamente inibida no grupo tratado com a combinação em comparação com o controlo (p 0,0001), honokiol (p = 0,0356) e de paclitaxel (p = 0,004) grupos tratados. Os volumes tumorais no honokiol (p = 0,1942) grupo tratado e paclitaxel (p = 0,9165) grupo tratado não mostrou diferença significativa quando comparado com o controle. pesos (b) do corpo de ratos em todos os grupos. Os pesos corporais dos ratinhos em todos os quatro grupos foram semelhantes. (C) rato representante de cada grupo. (D) histopatológica dos principais órgãos (fígado, baço, rim, coração e pulmão) do grupo de controlo e tratamento de combinação. (e) Efeito do tratamento de combinação de honokiol e paclitaxel sobre a divisão celular, proliferação e apoptose in vivo. secções de tecido embebidas em parafina a partir de diferentes grupos de tratamento foram imunocoradas com anticorpo anti-Ki-67 para a proliferação celular, e TUNEL para a detecção de células apoptóticas. células em apoptose são mostrados em verde; DNA contrastadas com DAPI em azul (aumento de 200x).

Foi avaliada a toxicidade sistémica de honokiol, paclitaxel e do tratamento de combinação no modelo de xenotransplante KB-8-5. Em comparação com o grupo de controlo, os pesos corporais dos ratinhos em todos os três grupos de tratamento foram semelhantes, indicando uma toxicidade desprezável sob as condições testadas (Fig. 6B). Consistentemente, histopatológica não encontrou qualquer dano tecidual considerável nos principais órgãos (incluindo fígado, baço, rim, coração e pulmão) coletados a partir de qualquer grupo de tratamento, incluindo o tratamento combinado (Fig. 6d).

ainda realizada a análise de IHQ para examinar o

in vivo

efeito de cada tratamento sobre a expressão de biomarcadores tumorais gerais. O tratamento combinado reduziu significativamente o nível do tecido de Ki-67 em KB-8-5 tumores (percentagem de células positivas Ki-67: 3,84 ± 1,10), quando comparada com a do grupo de controlo (11,96 ± 2,86; p 0,001) , grupo honokiol (7,18 ± 2,07; p = 0,027), ou o grupo de paclitaxel (11,68 ± 1,82; p 0,001) (Figura 6E.). Consistentemente, ensaio de TUNEL revelou um aumento significativo nas células tumorais apoptóticas nos tecidos de tumor do grupo de combinação (7.07 ± 2.11) quando comparados com os do grupo de controlo (1,64 ± 0,17; p 0,001), grupo honokiol (5,45 ± 1,19; P 0,05) e o grupo de paclitaxel (3,97 ± 3,58; P = 0,08) (Figura 6E).. Estes resultados indicam que honokiol poderia sensibilizar células cancerosas MDR a paclitaxel através da indução de apoptose.

Discussão

Apesar de algum sucesso no controle transitoriamente os sintomas clínicos de câncer com quimioterapia, uma percentagem significativa de pacientes desenvolver “resistência a múltiplas drogas”, ou MDR, e, inevitavelmente, progredir sem cura. É urgente desenvolver novas estratégias para superar MDR e melhorar a eficácia da quimioterapia. Neste estudo, investigou-se a utilidade potencial da honokiol composto natural no tratamento de cancro resistente à quimioterapia, usando modelos pré-clínicos. Nós demonstramos que o honokiol poderia efectivamente induzir a morte celular em células cancerosas, independentemente da sua resistência ao paclitaxel quimioterapia de droga. Significativamente, honokiol aumentou acentuadamente a

In vivo

eficácia de paclitaxel na inibição do crescimento de cancro MDR num modelo de xenoenxerto. Nós ainda proporcionada evidência molecular de suporte que honokiol apoptose induzida por quimioterapia e reforçada através da inibição de sinal do EGFR-STAT3 e regulação negativa de vários factores de sobrevivência, incluindo survivina, Bcl-2 e de Mcl-1. Estas observações indicam que honokiol poderia ser promissora na sensibilização de células cancerígenas à quimioterapia e melhorar a eficácia paclitaxel em ambientes clínicos.

EGFR superexpressão tem sido intimamente associado com a progressão do tumor, resistência à terapêutica e má evolução clínica em câncer de cabeça e pescoço e outros tipos de câncer [16], [17], [18], [19]. A via EGFR sinalização, incluindo as suas várias vias a jusante, tais como PI3K /AKT, ERK1 /2, de JAK /STAT3 e mTOR /NF-kB, desempenha um papel importante na regulação da proliferação, sobrevivência, migração e quimiorresistência em células de cancro. sinalização de EGFR, portanto, está sendo perseguido ativamente como um alvo promissor para desenvolver terapias para cabeça resistente e recorrente e câncer de pescoço e outro tipo de câncer o uso de inibidores de pequenas moléculas e anticorpos [20], [21]. Neste estudo, foi demonstrado que o honokiol diminuiu tanto a fosforilação e expressão do EGFR, o que sugere uma inibição de sinal do EGFR que é consistente com estudos anteriores [5]. Como esperado, a expressão e a actividade de vários componentes importantes de sinalização de EGFR, incluindo Akt, ERK e STAT3, foram também inibidas em células KB quimiorresistentes após tratamento honokiol. Um estudo recente relatou que honokiol regula negativamente a proteína de choque térmico (HSP) 90 em células de câncer de mama [22]. HSP90 e outras proteínas chaperonas como HSP70 e Hsp40 regular a degradação do EGFR. Interrupção do ciclo de HSP70 /HSP90-dobragem leva a ubiquitinação e degradação do EGFR [23] [24]. Portanto, é possível que honokiol promove a degradação do EGFR e inibe a sinalização do EGFR através de um mecanismo dependente de HSP90.

Vários genes alvo STAT3, como survivina, Bcl-2 e de Mcl-1, têm um papel central na regulação