Abstract

Nuclear factor eritróide 2 p45 relacionadas com o fator 2 (Nrf2) é um fator de transcrição que regula a expressão de muitos genes citoprotetores. No presente estudo, verificou-se que a expressão de Nrf2 foi suprimida em tumor de próstata do Transgenic Adenocarcinoma of Mouse próstata (TRAMP) camundongos. Do mesmo modo, a expressão de Nrf2 e a indução de NQO1 foram também substancialmente suprimida em células C1 TRAMP tumorigénico, mas não em células TRAMP C3 não tumorigénicas. Exame da região do promotor do gene do rato Nrf2 identificada uma ilha CpG, o qual foi metilado em sítios CpG específicos no tumor da próstata e TRAMP em células TRAMP C1, mas não na próstata normal ou células TRAMP C3, como mostrado pela sequenciação genómica bissulfito. Os ensaios de repórter indicado que a metilação desses locais CpG inibiu drasticamente a actividade de transcrição do promotor de Nrf2. Immunopreceipitation cromatina (ChIP) ensaios revelou aumento da ligação da proteína de metil-CpG de ligação 2 (MBD2) e proteínas H3 trimetil-histona (Lys9) a estes locais de CpG em células TRAMP C1, em comparação com células TRAMP C3. Em contraste, a histona de ligação de ARN Pol II e H3 acetilada ao promotor Nrf2 foi diminuída. Além disso, o tratamento de células TRAMP C1 com DNA metiltransferase (DNMT) inibidor da 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza) e histona-desacetilase (HDAC) inibidor tricostatina A (TSA) restaurou a expressão de Nrf2, bem como a indução de de NQO1 em células TRAMP C1. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a expressão de Nrf2 é suprimida epigeneticamente por metilação do promotor associado com MBD2 e modificações de histonas no tumor da próstata de ratinhos TRAMP. Nossos achados revelam um novo mecanismo pelo qual a expressão Nrf2 é suprimida em tumor de próstata TRAMP, lançar uma nova luz sobre o papel do Nrf2 na carcinogênese e fornecer potenciais novos rumos para a detecção e prevenção do câncer de próstata

Citation.: Yu S, PARA Khor, Cheung KL, Li W, Wu TY, Huang Y, et al. (2010) Nrf2 expressão é regulada por epigenéticas Mecanismos em Câncer de próstata de ratinhos TRAMP. PLoS ONE 5 (1): e8579. doi: 10.1371 /journal.pone.0008579

editor: Andy T. Y. Lau, da Universidade de Minnesota, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Setembro, 2009; Aceito: 06 de dezembro de 2009; Publicação: 05 de janeiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01-CA118947 e R01-094828 para A.-N. T. Kong. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de próstata, bem como muitos outros cancros relacionados com a idade, é caracterizada por aumento do estresse oxidativo intracelular [1], [2]. o stress oxidativo crónico e as suas respectivas condições patológicas, incluindo desordens inflamatórias e metabólicas foram postulados para dirigir as mutações somáticas e transformação neoplásica, assim, podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata [3]. Aumento do estresse oxidativo ou espécies reactivas de oxigénio (ROS) níveis poderia ser uma consequência do aumento da produção de espécies reativas e /ou diminuição da capacidade antioxidante e ou ROS desintoxicação. Recentemente, o sistema de defesa antioxidante prejudicada na carcinogénese do cancro da próstata tem vindo a aumentar atenções.

O sistema de defesa antioxidante celular compreende uma bateria de antioxidante /desintoxicar enzimas e proteínas, tais como superóxido dismutase (SOD), catalase, hemeoxgenase ( HO), UDP-glucuronosiltransferases (UGT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-transferases (GST), e NAD (P) H: quinona oxidorredutase (NQO) [4]. A sub-regulação de GST por metilação de ADN parece ser bastante comum no cancro da próstata humana que tem sido desenvolvido como um marcador de diagnóstico [5]. A expressão e a actividade de SOD, catalase e GPx têm sido relatados para ser diminuída em tecidos de carcinoma da próstata, bem como no plasma e nos eritrócitos [6] – [8]. Estudos recentes do nosso laboratório e outros descobriram que os níveis de SOD, UGT1A1, de NQO1 e vários genes da família de GST de expressão foram significativamente suprimida em tumores da próstata em Transgénicos Adenocarcinoma da próstata de rato (TRAMP) ratos [9] – [11]. Embora a sub-regulação de enzimas GST no cancro da próstata humana têm sido associados a hipermetilação do promotor de genes GST [5], [12]; a hipermetilação do ADN do promotor não parecem causar a repressão do gene GST em tumores TRAMP [9]. Em vez disso, a sub-regulação de factor nuclear-eritróide 2p45 (NF-E2) Factor -relacionados 2 (Nrf2), um regulador chave das enzimas antioxidantes celulares, pode ser responsável pela supressão transcricional de GSTs e outra fase II genes de enzimas desintoxicantes [11 ].

Nrf2 é um factor de transcrição de fecho de leucina de base hélice-laço-hélice que regula a expressão de muitos fase II desintoxicante e enzimas antioxidantes através da sua ligação ao elemento de resposta antioxidante-(ARE) na região promotora [ ,,,0],4]. Knockout de Nrf2 em camundongos revogada substancialmente a expressão indutível de desintoxicação ARE-mediada e enzimas antioxidantes, e rendido estes ratos altamente suscetíveis a agentes cancerígenos e /ou danos oxidativos [13], [14]. Nestes contexto, anteriormente, descobrimos que os níveis de Nrf2 e o gene Nrf2-alvo da heme-oxigenase-1 (HO-1) de expressão de proteínas foram atenuadas nos tumores da pele de um modelo de carcinogénese da pele do rato [15]. Do mesmo modo, a expressão de Nrf2, bem como os seus genes alvo a jusante, tais como UGT1A1, GSTM1 e NQO1 foram encontrados para ser gradualmente regulada para baixo em tumores da próstata com a progressão da tumorigénese da próstata em ratinhos TRAMP [10]. Frohlich et ai. informou recentemente a expressão de Nrf2 e os genes da família GST mu foram significativamente menores no tumor de próstata TRAMP, e ligados este fenómeno ao estresse oxidativo aumentado e danos no DNA de câncer de próstata. Meta-análise de expressão tecidual de perfis de dados do banco de dados Oncomine (www.oncomine.org) sugeriu que as expressões de Nrf2 e vários genes GST mu também são gradualmente regulada em cancros da próstata humana [11].

A transcrição de Nrf2 foi recentemente mostrado para ser regulada pelo receptor de hidrocarboneto de arilo (AHR) e Nrf2-se [16], [17]. No entanto, o paradigma atualmente aceito de regulação Nrf2 parece ser alcançada principalmente através de mecanismos pós-traducionais. Como tal, é funcionalmente Nrf2 suprimida pela proteína Kelch-como-derivado de célula eritróide com CNC homologia (ECH) Proteína -Associated 1 (Keap1), que se liga a e sequestra Nrf2 no ​​citoplasma levando à degradação de Nrf2, e assim impede a translocação nuclear Nrf2 e transativação de seus genes-alvo [18]. Após a desafios por oxidativo ou tensões electrofílicos que poderia envolver potenciais de modificação de resíduos de cisteína críticos em Keap1 e ou a própria Nrf2 acoplado com a fosforilação por quinases, Nrf2 é libertado a partir Keap-1, transloca-se para o núcleo, dimeriza com pequenas proteínas Maf, liga-se a ARE e transcricionalmente ativa Nrf2-SÃO genes-alvo [4]. Até o momento, não está claro sobre a forma como a expressão de Nrf2 no ​​câncer de próstata humano ou no tumor do mouse TRAMP é suprimida.

epigenética ou mecanismos epigenômicos, particularmente a metilação do DNA, têm sido frequentemente implicados nas alterações do gene expressão em cancro da próstata [19], [20]. hipermetilação Coordenado de APC e de GSTP1 em carcinogénese precoce tem sido utilizada como potenciais marcadores de diagnóstico para detectar o cancro da próstata [21]. Além disso, a alteração dos perfis de metilação de ADN tem sido associada com a progressão do cancro [20]. metilação do DNA, juntamente com modificações de histonas, afetaria as interações dos promotores de genes críticos com co-repressores de transcrição e coactivators levando a mudanças na expressão dos genes, que poderia ser uma das forças motrizes para a carcinogênese de próstata. O silenciamento de genes múltiplos por metilação do DNA tem sido relatada em tumores da próstata TRAMP e linhas celulares derivadas de tumores de próstata TRAMP [22] – [24]. A inibição da actividade da metiltransferase de ADN por 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza) foi mostrado para prevenir a tumorigénese da próstata em ratinhos TRAMP [25]. Além disso, a expressão de Keap1 foi reportado ser regulada por metilação de ADN no cancro do pulmão [26]. No presente estudo, nós primeiro identificada uma ilha de CpG na região a montante 5′-flanqueadora do gene de murino Nrf2 seguido de interrogação do estado de metilação de ADN de toda a ilha de CpG através de sequenciação genómica bissulfito. Descobrimos que certos locais de CpG da região distai da ilha CpG foram hipermetilado nos tecidos tumorais TRAMP, bem como em tumorigénico TRAMP-C1-C2 e células, mas não em tecido prostático e não tumorigénicas células TRAMP-C3 normal. Utilizando ensaio de repórter metilado, imunoprecipitação da cromatina de ensaio e tratamentos (CHIP) com tricostatina A (TSA) /5-aza, fornecemos evidências convincentes de que a expressão de Nrf2 é epigenetically regulada durante o desenvolvimento de tumores de próstata em ratos TRAMP. Nrf2 expressão foi suprimida por metilação de certos locais de CpG e esta foi acompanhada pelo recrutamento de MBD2 e H3 trimetil-histona (Lys9) para o promotor do gene Nrf2 no ​​tumor da próstata de ratinhos TRAMP.

Resultados

hipermetilação de Sites CpG específicos na ilha CpG em murino gene Nrf2

a sequência genômica do gene Nrf2 (NC_000068.6: 75.544.698-75.513.576 Mus musculus cromossoma 2, montagem de referência (C57BL /6J), incluindo 2 kb da sua sequência 5′-upstream) foi analisado para ilha CpG usando CpG ilha Finder (https://people.usd.edu/~sye/cpgisland/CpGIF.htm). Uma vez que vários ARNm de variantes com diferentes locais de início da transcrição (TSS) têm sido relatados na literatura [16], [27], [28], por conseguinte, no presente estudo, nós definimos o local de iniciação da tradução (TIS) como a posição 1 para evitar qualquer possível confusão. Uma ilha CpG foi identificado entre -1175 e 1240, com um teor de GC de 61,53%, CpG observado /proporção esperada de 0,66 e um total de 150 CpGs. A ilha CpG inclui o promotor Nrf2 murino, o primeiro exão e parte do primeiro intrão (Figura 1A). Foram obtidos resultados semelhantes quando se utiliza outros critérios e algoritmo (https://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx, dados não mostrados). 10 conjuntos de sequenciação genómica iniciadores (BGS) bissulfito foram projetados usando o servidor web BiSearch (https://bisearch.enzim.hu/, [29]) para cobrir a região flanqueante 5 ‘abrangendo -1.226-844 do Nrf2 gene murino (Tabela S1). DNA genômico convertido pelo bissulfito derivada a partir de 12 tumores de próstata palpáveis ​​de 24 semanas de idade ratos TRAMP e 10 tecidos de aparência normal da próstata de camundongos C57BL /6J foi usada como modelos. Como mostrado na Figura 1B, embora a maioria da ilha de CpG metilada é mal, os primeiros 5 locais CpG foram encontrados para ser hipermetilado (96%) em tumores da próstata em comparação com os tecidos da próstata, de aparência normal (4%). cromatógrafos de sequenciação representativa mostrando os primeiros 5 CpG no tumor da próstata e pela próstata normal são apresentados na Figura S1. Os 10 CpGs seguintes que são separadas por duas lacunas-CpG livre (-1.131 a -1.060 e -886 a -798) também exibido estado de metilação diferencial em tumores (34%) em comparação com tecidos normais (2%). Além disso, uma outra região localizada no primeiro intrão parece ser fraca densidade CpG-metilado no tumor da próstata (4,5%).

(A) Uma ilha CpG foi identificado na região flanqueante 5 ‘do gene do rato Nrf2 , que vão desde a posição -1.175-1240 com o local de iniciação da tradução definido como a posição 1. as sequências cobertos por sequenciamento genômico bissulfito (-1.226-844) e contêm metilados CpGs estão esquematicamente apresentados com locais CpG indicadas por linhas verticais. (B) Os padrões de metilação e extensões dos locais de CpG no promotor do gene Nrf2 no ​​tumor da próstata e na próstata TRAMP aparentemente normais foram determinados por sequenciação genómica de bissulfito, tal como descrito em Materiais Métodos. Os pontos pretos indicam CpGs metilados e os círculos abertos indicam CpG não metilado. (C) foram determinados os padrões de metilação e extensões dos locais de CpG no promotor do gene Nrf2 em C1 e TRAMP células C3. Os CpGs na seqüência entre 296-594 não são exibidos porque a metilação é insignificante.

TRAMP C1, linhas de células C2 e C3 foram originados a partir de um tumor heterogêneo de rato TRAMP 32 semanas [30 ]. Enquanto as células TRAMP C1 e C2 são tumorigénicas quando enxertados em singénicos da estirpe C57BL /6J hospedeiros, células TRAMP C3 não são. O ADN genómico a partir de células C1 e C3 foi de bissulfito-sequenciados tal como acima, para detectar o estado de metilação da ilha CpG no gene Nrf2. Surpreendentemente, os metilados CpG “pontos quentes” como encontradas acima no tumor TRAMP próstata também foram metilado em células C1 tumorigênicos mas não em TRAMP não tumorigénica células C3 (Figura 1C).

A metilação dos 5 primeiros CpGs suprimiu significativamente a actividade de transcrição do promotor do rato Nrf2

Para investigar o papel funcional de metilação de CpG locais específicos, particularmente os primeiros 5 CpGs na ilha CpG, repórteres de luciferase conduzida pelo promotor Nrf2 com ou sem o primeiro 5 CpG (como designado -1367 e -1065, respectivamente) foram construídos como descrito em Materiais e Métodos (Figura 2A). Os plasmídeos foram metilado utilizando M. SSSI CpG metiltransferase

in vitro

eo estado de metilação foi confirmada por Hpa /Hhall digestão (Figura S2). Como mostrado na Fig. 2B, o promotor -1065 Nrf2, que tinha sido relatado anteriormente [17], [28], aumentou substancialmente a actividade de luciferase a cerca de 200 pregas. Em contraste, o promotor -1367 Nrf2 mostrou uma actividade de transcrição menos potente (~67 dobras). Importante,

In vitro

CpG-metilação da construção repórter resultou numa diminuição dramática da actividade de transcrição do promotor -1367 Nrf2 (84% de redução); enquanto que, a actividade do promotor -1065 foi diminuiu apenas 23,4% por CpG-metilação. Resultados semelhantes foram obtidos em células Hep G2 de hepatoma e de rim embrionário humano HEK 293 (Figura S3).

(a) A construção de repórteres de luciferase é esquematicamente apresentada. promotores Nrf2 com (-1.367-1) ou sem (-1.065-1) a sequência adicional contendo os primeiros 5 CpGs foram amplificadas a partir de DNA genómico de ratinho e inserido no vector pGL 4,15. Os repórteres resultantes foram designados como PGL-1367 e PGL-1065, respectivamente. (B) PGL-1367 ou repórteres PGL-1065, seja metilada por CpG metiltransferase ou não, foram co-transfectadas com pGL 4,75 vector que contém um Renilla reniformis gene de luciferase dirigido por promotor de CMV em células TRAMP C1, e as actividades de luciferase foram medidas após 24 horas. As actividades de transcrição de cada construções foram calculados através da normalização da actividade de luciferase de pirilampo com as actividades da luciferase Renilla correspondente, e são representadas como dobras de indução, em comparação com a actividade de vazio pGL 4,15 vector. Os valores são SD ± média de quatro amostras separadas.

hypermethylated CpG Ilha foi associada com Metil-CpG-Binding Domain (MBD2) e histona Modificações, que é reversível por 5-aza /TSA Tratamento

a repressão da expressão génica por metilação de CpG é geralmente conseguida por proteínas MBD que se ligam a ADN metilado conduzindo ao recrutamento de remodelação da cromatina e complexos repressores da transcrição [31]. No estudo corrente, os ensaios de ChIP foram empregues para examinar as proteínas que poderiam ser potencialmente associados com Nrf2 promotor em células TRAMP C1 e C3. Com base no estado de metilação do promotor de Nrf2, conjuntos de iniciadores foram concebidos para abranger os primeiros 5 CpG e o TSS para detectar a associação de proteínas de ligação de ADN especificadas, bem como ARN polimerase II (pol II). A especificidade dos ensaios ChIP foram verificadas por IgG não específica que não puxar para baixo qualquer coisa. Como um controlo positivo, β-actina promotor está igualmente relacionado com Pol II em C1 e C3 (Figura 3A). A ligação de pol II para o gene Nrf2 SST foi significativamente diminuída em células C1, em comparação com as células em C3, indicando uma transcrição reprimida de Nrf2 em células C1 (Figura 3A B). De acordo com esta observação, a ligação de MBD2 e metilado-tri histona 3-Lys9, (H3K9me3) para os CpGs metilados no promotor Nrf2 foi maior em células de C1 do que em células C3, enquanto que a associação de histona acetilada 3 (H3Ac) exibido um padrão invertido (Figura 3A B). proteína de ligação 2 metil CpG (MeCP2) e sin3a de mamífero (mSin3A) também foram testados quanto à sua ligação com este promotor Nrf2; No entanto, nenhuma ligação detectável foi observada (dados não mostrados). ensaio

(A) chip foi realizada para detectar a ligação de proteínas indicadas a regiões específicas do gene Nrf2 reticulado e imunoprecipitada a partir de células TRAMP C1 e C3. Os resultados a partir de 3 experiências independentes foram quantificadas por densitometria como mostrado em (B). células (C) C1 TRAMP foram tratados com veículo, ou 5-aza-aza 5 + TSA, tal como descrito, em seguida, as células foram submetidas a ensaio de chip. Os resultados de 2 experiências independentes foram quantificadas por densitometria como mostrado em (D). ChIP ensaios foram realizados como descrito em Materiais Métodos que utilizam anticorpos contra Pol II, MBD2, H3K9m3 e AcH3. 3 conjuntos de primers fichas era utilizado (Tabela S2), com Nrf2P1 abrange os primeiros 5 CpGs (-1190 a -1092) na ilha CpG e Nrf2P2 cobre uma região perto de TSS (-62 a +20). IgG não específica foi utilizado como um controlo negativo e a ligação de pol II de p-actina promotor foi usada para verificar a eficiência do ensaio de chip. As experiências foram repetidas pelo menos duas vezes com resultados semelhantes.

O estado de metilação do ADN é regulada por ADN metil-transferase (DNMTs) e 5-aza é um inibidor DNMT, é muitas vezes usado para examinar o efeitos de metilação de ADN [32]. Como mostrado na Figura 3C D, o tratamento com 5-aza das células C1 diminui a ligação de MBD2 e H3K9me3 ao promotor Nrf2, enquanto o H3Ac apresenta nenhum efeito observável. No entanto, o tratamento combinado de células com C1 5-aza e de um inibidor de histona deactylase (HDAC), TSA, aumenta substancialmente a ligação de H3Ac ao promotor Nrf2, e diminui ainda mais as ligações de MBD2 e H3K9me3 ao promotor Nrf2. Consistente com os resultados anteriores, o recrutamento de pol II para o promotor Nrf2 também aumenta de forma correspondente, enquanto que a ligação promotor de p-actina de Pol II não foi alterado (Figura 3C).

A transcricional Indução de Nrf2 e NQO- 1 em linhas celulares TRAMP foi correlacionada com as Ilhas CpG metilação Estado e poderia ser restaurada por 5-aza /TSA Tratamento

Nós e outros autores relataram anteriormente que a expressão de Nrf2 e os seus genes-alvo é suprimida em tumores de próstata TRAMP [10], [11]. Marvis et al., Relatou que a expressão da família de genes de GST foi suprimida em células TRAMP C2 e 5-aza e tratamento de TSA pode restaurar a expressão [9]. Aqui examinámos a expressão de Nrf2 e um dos seus genes alvo a jusante em NQO1 em células TRAMP C1 e C3. Como mostrado na Figura 4A, o nível de ARNm de Nrf2 é significativamente mais baixa em células de C1 do que em células C3. A expressão de NQO1 foi prontamente induzida por tBHQ, um agonista Nrf2 clássico, em células C3, enquanto tal indução foi tornado rombo nas células C1 (Figura 4A C). O tratamento de células com C1 5-aza e TSA modestamente restaurado Nrf2 expressão e aumentou significativamente a indução de NQO1 por tBHQ. No entanto, o tratamento de células C3 sob as mesmas condições não exibiu qualquer efeito sobre a expressão de Nrf2 ou NQO1 (Figura 4A, B C). Western blotting foi realizado para examinar os níveis de Nrf2, NQO1, MBD2, H3Ac e H3K9me3 (Figura 4D) de expressão de proteínas. Os níveis de proteína de Nrf2 e NQO1 foram mais baixos em células do que em células C1 C3, e 5-aza e tratamento TSA aumentou a indução de proteínas de NQO1 por tBHQ. Embora o 5-aza e tratamento TSA não aumentou o nível basal da proteína Nrf2 o tratamento Nrf2 induzida a expressão da proteína-tBHQ significativamente aumentada. tratamento TSA aumentou fortemente acetilada histona 3 enquanto a proteína não teve efeito sobre histona 3 estado de metilação. Curiosamente, embora o nível de proteína de MBD2 não foi afectada pela 5-aza e tratamento TSA, que era muito mais elevado nas células do que em células C1 C3 (Figura 4D).

células TRAMP C1 e C3 foram tratadas com dois ? M de 5-aza, 200 nM TSA, ou 1? M de 5-aza mais 100 nM TSA durante 60 horas ou 48 horas, seguido por incubação na presença de 5 uM tBHQ por mais 12 horas. Após os tratamentos, as células foram colhidas para o total de extracções de proteínas ou RNA. (A) os níveis de ARNm de Nrf2 e NQO1 foram determinados por RT-PCR, com GAPDH que serve como controlo interno, e os resultados a partir de 3 experiências independentes foram quantificadas por densitometria e os resultados são apresentados em B e C. (D) a proteína níveis de Nrf2, NQO1, MBD2, H3K9me3 e H3Ac foram determinados por Western blotting, com actina como um controlo de carga. Cada experimento foi repetido pelo menos duas vezes com resultados semelhantes.

Discussão

descobertas anteriores de vários laboratórios, incluindo nosso laboratório demonstraram que Nrf2 desempenha um papel essencial no desenvolvimento de vários tipos de câncer [ ,,,0],33]. Nrf2 regula a expressão de enzimas desintoxicantes antioxidantes e a fase II, incluindo NQO1, HO-1 e GST [33]. Por conseguinte, o controlo de activação da transcrição de genes Nrf2 e Nrf2-alvo parece ser um importante mecanismo homeostático que proteger as lesões celulares ou de danos resultantes de stress oxidativo [33]. Nrf2 deficiência poderia conduzir a defeitos no sistema de defesa celular contra o estresse oxidativo, potencialmente resultando na iniciação do cancro, promoção e progressão [34]. A expressão reprimida de enzimas antioxidantes e desintoxicação tais como GSTP1 no cancro da próstata tem sido extensivamente estudada [2], [5]. No entanto, o papel do Nrf2 no ​​cancro da próstata não receberam atenção suficiente até recentemente [10], [11].

Frohlich et al. relataram que a sub-regulação de Nrf2 parece ser responsável pela redução da expressão de GST, o stress oxidativo elevado e dano do ADN na tumorigénese da próstata em ratinhos TRAMP [11]. Encontraram-se recentemente que a expressão de Nrf2, bem como genes-alvo Nrf2 é gradualmente sub-regulada durante a progressão do cancro da próstata em ratinhos TRAMP [10]. A análise anterior dos conjuntos de dados em linha humanas de expressão do gene da próstata demonstraram que a expressão de Nrf2 e GST [11], bem como de NQO1 foi gradualmente diminua durante a carcinogénese da próstata humana (Figura S4). Além disso, tem sido relatado que vários genes de GST são regulados negativamente em primária, mas não em tumores metastáticos TRAMP [9]. No estudo actual, verificou-se que a expressão de Nrf2 e a indução de NQO1 foi comprometida em células C1 TRAMP tumorigénico, mas não em células TRAMP C3 não tumorigénicas (Figura 4A). Esta supressão da expressão de Nrf2 e NQO1 gene Nrf2-alvo em ambas as linhas de células TRAMP iria excluir a possibilidade que a expressão de Nrf2 seria afectada pelo transgene SV40, uma vez que estas linhas de células TRAMP não expressam o transgene SV40 [30].

metilação do DNA tem sido implicado no silenciamento do gene de GSTP1 no cancro da próstata humana, e da mesma forma o silenciamento de ADN-metilação de vários outros genes também estão implicados no tumor TRAMP próstata [5], [23], [24]. Contudo, a análise quantitativa MassARRAY curiosamente análises de metilação de ADN (MAQMA) da região de 5 ‘de vários genes de GST exibida não há diferenças significativas entre as células epiteliais prostáticas normais e de tumor da próstata a partir dos ratinhos TRAMP [9]. Recentemente, vários relatos demonstram que, em ambos TRAMP e Rb – /- tumores da próstata, um aumento RB /E2F-dependente da expressão e actividade DNMT1 metilação [25], [35]. hipermetilação do promotor Nrf2 foi excluída usando MSP e que o tratamento com 5-aza não teve nenhum efeito sobre a expressão de Nrf2 (com dados não mostrados) [11]. Analisou-se a região flanqueante 5 ‘do gene Nrf2 e identificada uma ilha de CpG que se estende para a posição -1175 (Figura 1A). Usando seqüenciamento bissulfito, o que seria mais específico na identificação de CpG metilação e iria revelar mais detalhes sobre a metilação do DNA do que o MSP, descobrimos que os primeiros 5 CpGs na ilha CpG são hipermetilado em tumores TRAMP próstata e na TRAMP tumorigênico células C1 não, mas em tecidos da próstata normais e células TRAMP C3 não tumorigénicas (Figura 1B). Notavelmente, estas 5 CpG estão localizados adjacentes ao promotor de Nrf2 previamente relatada [17]. Assim, o estado de metilação de CpG estes específicos parece estar correlacionado com a tumorigenicidade, bem como expressão Nrf2 e indução de NQO1 (Figuras 1 e 4). Notavelmente, padrão semelhante de metilação específico da ilha CpG distai também foi observado no gene Keap1 em células de cancro do pulmão [26]. É importante notar que alguns dos nossos dados actuais, parece ser um tanto contraditória com os resultados relatados anteriormente [11], os resultados no entanto anteriores de grande infra-regulação de Nrf2 e GST durante a progressão do tumor da próstata em ratinhos TRAMP [11], são consistentes com os nossos resultados actuais.

Para determinar o papel funcional de metilação de CpG em 5 destes a supressão de Nrf2 Expession, repórteres de luciferase do promotor de Nrf2 com ou sem estes 5 CpGs foram construídos (Figura 2A). O promotor Nrf2 possui muito promotor não canónicas rico em GC que não contém nem caixa TATÁ nem uma caixa CCAAT [28], no entanto, este Nrf2-promotor activado potentemente a transcrição do gene repórter da luciferase (Figura 2B). Interessantemente, a adição de sequências -1.065–1.367 parece ser repressivo para a actividade de transcrição do promotor de Nrf2 (Figura 2B). Tal sequência repressivo poderia funcionar através do recrutamento de fatores repressoras específicas [36], mas o mecanismo exato responsável por esta função repressiva desta sequência, mesmo na ausência de metilação exigiria uma investigação mais aprofundada. No entanto, quando os repórteres foram metilado

in vitro

por CpG metiltransferase, a atividade de repórter luciferase do promotor Nrf2 com a sequência adicional contendo as 5 CpGs (PGL-1367) foi reduzido em cerca de 84%. Em contraste, a metilação do repórter sem a sequência adicional resultou em cerca de 23% de redução (Figura 2B). Isto é provavelmente devido à metilação pesada de toda a construção incluindo o gene da luciferase (mas um estudo mais aprofundado seria necessário para provar isto). No seu conjunto, estes resultados sugerem que os extra 5 CpG (-1065 a -1367) podem desempenhar um papel crítico na supressão dependente da metilação do promotor de actividade Nrf2.

O papel da metilação do CpG na supressão da expressão do Nrf2 e activação era testado por tratamento com 5-aza em células TRAMP. 5-Aza foi anteriormente mostrado para ser capaz de impedir a progressão da doença no início, atrasar a doença independente de androgénios e melhorar a sobrevivência de ratinhos TRAMP [25], [37]. Além disso, a fase de metilação de CpG e ilha e DNA metiltransferase expressão específica de fenótipo têm sido bem documentados durante a progressão do cancro da próstata em ratinhos TRAMP [38], [39]. Estes resultados publicados sugerem a relevância da utilização deste sistema TRAMP para interrogar o possível papel de alterações epigenéticas na carcinogênese de próstata. o tratamento com 5-aza de células TRAMP C1 moderadamente aumentado o nível de ARNm de Nrf2, enquanto que os tratamentos combinados de 5-aza TSA e induziu um aumento mais proeminente de Nrf2 (Figura 4A). Este resultado é consistente com o relatório por Luna et ai., Na qual combinados 5-aza e tratamentos TSA aumentou significativamente a expressão de genes GST [9]. O nível de proteína de Nrf2 em células TRAMP C1 permaneceram inalterados por qualquer das 5-aza ou 5-aza tratamentos /TSA, no entanto, a adição de um potente activador tBHQ Nrf2-se melhorar a acumulação de proteína Nrf2 (Figura 4B). Como esperado, a indução de ARNm de NQO1 e os níveis de proteína exibida uma tendência semelhante com o da proteína Nrf2. É altamente provável que uma vez que a sinalização do Nrf2 é regulado principalmente através de mecanismos de pós-tradução, sem desafios com Nrf2-activadores, tais como tBHQ, proteína Nrf2 seria rapidamente virou por degradação dependente de proteossoma [18]. A razão precisa por que motivo tBHQ é necessária para a indução NQO1 exigiria um estudo mais aprofundado.

Para delinear ainda mais o mecanismo molecular pelo qual o específica CpG-metilação suprime a expressão Nrf2, foram realizados ensaios de chip. O resultado revela que a ligação de MBD2 e H3K9m3 para os CpGs específicos foi substancialmente mais elevada em células TRAMP C1 do que em células TRAMP C3 correlacionando com o facto de que os CpGs foram minimamente metilado em células TRAMP C3 (Figura 3A). Em contraste, AcH3 apresentado um padrão de ligação de frente para a sequência mesmos CpG em células TRAMP C1, em comparação com células TRAMP C3, e da mesma forma a ligação de pol II para o local de início da transcrição, apresentaram um padrão semelhante de AcH3 (Figura 3A). Estas associações à metilação dependentes da co-repressores poderia ser modulado por 5-aza e TSA tratamentos e os nossos resultados (Figura 3B) correlacionam-se bem com o nível de transcrição de Nrf2 (nível de ARNm) nestas duas linhas celulares (Figura 4A). MBD2 foi reportado para mediar silenciamento de epigenética 14-3-3σ em células TRAMP C1 e células de próstata LNCaP humanos [24], e tem sido mostrado para ser envolvida na repressão da transcrição de GSTP1 em células MCF-7 células cancerosas da mama [40] . MBD2 e outras proteínas se ligarem a MBD CpGs metilados e recrutar complexos de co-repressor, que contêm proteínas HDAC, remodelação da cromatina, assim como outras proteínas que levam à repressão da expressão de genes hipermetilado [31]. Curiosamente, o nível de proteína de MBD2 foi muito mais elevado nas células TRAMP C1 do que em células TRAMP C3 (Figura 4A), sugerindo uma possível supressão epigenética MBD2 mediada comum de Nrf2 em células TRAMP C1. Em contraste, o nível de proteína de AcH3 era aparentemente mais baixa em células TRAMP C1 do que em células TRAMP C3 mas aumentou tremendamente por tratamento TSA (Figura 4D). Uma vez que a expressão de MBD2 seria dependente da actividade de HDAC, os nossos resultados acima seria potencialmente explicar a necessidade de inibidores de HDAC, a fim de modular eficazmente co-repressores de ligação e restaurar maximamente a re-expressão de Nrf2, bem como a indução de NQO1 em células TRAMP C1. Além disso, quando essa sequência supressora contendo extra 5 CpG foi ainda analisada usando o Sistema de Pesquisa transcricional Elementos (TESS, https://www.cbil.upenn.edu/tess) com base na base de dados TRANSFAC V6.0, vários factor de transcrição locais de ligação foram identificados, incluindo os locais de ligação de E2F1-P107 e NF-E2 (dados não mostrados).