Abstract

Estudos recentes têm mostrado que a sinalização Notch está envolvida em muitos tipos de cancro, incluindo carcinomas de células escamosas oral ( epidermóide estudados). No entanto, o papel da sinalização de Notch no microambiente do tumor não é ainda completamente compreendido. Neste estudo, nós investigamos os papéis de NOTCH3 sinalização em câncer associado fibroblastos (FAC) em carcinoma epidermóide estudados. Estudo imuno-histoquímico de 93 casos de CCEO língua humanos indicaram que cerca de um terço do carcinoma epidermóide estudados mostraram expressão NOTCH3 na FAC, e que esta expressão significativamente correlacionada com tumor-size. Estudos in vitro mostraram que as linhas de células, especialmente células CEs HO1-N-1 estimulou a expressão NOTCH3 em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDFs) através de contacto directo célula a célula. análise imuno-histoquímica e morfométrica utilizando amostras de CCEO humanos demonstraram que a expressão NOTCH3 na FAC significativamente correlacionada com a densidade de micro-navio em estroma câncer. Em ensaios de angiogénese in vitro envolvendo a co-cultura de NHDFs com HO1-N-1 e células endoteliais umbilicais humanas (HUVEC), e knockdown NOTCH3 em NHDFs utilizando siRNA, demonstraram que as células HO1-N-1 promoveu significativamente a formação do tubo dependente NOTCH3-expressão em NHDFs. Além disso, a expressão NOTCH3 na FAC foi relacionado a um pior prognóstico dos pacientes com tumores. Este trabalho oferece uma nova visão sobre o papel da sinalização Notch na FAC associados a angiogênese do tumor e da possibilidade da terapia alvo molecular-NOTCH3 no carcinoma epidermóide estudados

Citation:. Kayamori K, Katsube Ki, Sakamoto K, Ohyama Y, Hirai H, Yukimori A, et al. (2016) NOTCH3 é induzida no cancro-associados fibroblastos e promove a angiogênese em Oral carcinoma espinocelular. PLoS ONE 11 (4): e0154112. doi: 10.1371 /journal.pone.0154112

editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital centro de pesquisa, ARÁBIA SAUDITA

Recebido: 28 Dezembro, 2015; Aceito: 09 de abril de 2016; Publicação: 28 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Kayamori et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seu arquivo de Informações de Suporte

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência: Grant-in-Aid para Jovens cientistas (b) (KAKENHI 26.861.543 para Kou Kayamori ) e Investigação Científica (C) (20.233.760 de Ken-ichi Katsube). Este trabalho também foi apoiada pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência: Grant-in-Aid para a Investigação Científica (A) (25253098 KAKENHI para Akira Yamaguchi)

Conflito de interesses:. Os autores declararam que nenhum concorrente existem interesses.

Introdução

Head and neck cancer deriva do trato aerodigestivo superior, incluindo a cavidade nasal, seios paranasais, cavidade oral, faringe e laringe. Histopatologicamente, a malignidade predominante no câncer de cabeça e pescoço é o carcinoma de células escamosas (SCC).

Oral SCC (CEB) é o tipo mais comum de câncer de cabeça e pescoço. De acordo com as recentes estimativas Globocan, aproximadamente 300.000 novos /pacientes com câncer da cavidade bucal de lábio foram diagnosticados em 2012 em todo o mundo [1]. A taxa de sobrevida em 5 anos de pacientes com tumores ainda varia de 40 a 60% [2, 3]. Investigação sobre o mecanismo molecular que regula comportamentos malignos de CEO será necessária para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas e melhoria do prognóstico pobre.

estroma Cancer é composta de vários tipos de células, incluindo fibroblastos, células do sistema imunológico, pericitos e endotelial células. Estudos recentes têm demonstrado que estas células e os seus produtos de estabelecer microambientes adequados para a proliferação do cancro, invasão, angiogénese, metástases, e quimiorresistência [4, 5]. Em particular, fibroblastos associados ao cancro (FAC), que são os principais componentes do estroma cancro, desempenham um papel crucial na progressão tumoral em vários tipos de cancro [6]. Suas origens são pensados ​​para ser ou fibroblastos do tecido residente, as células estaminais mesenquimais recrutados a partir de medula óssea ou células cancerosas que foram submetidos a transição epitelial-mesenquimal [7]. Vários estudos têm relatado que a FAC estimular a invasão de células de câncer [8-10] ou proliferação [11] e correlacionam-se com mau prognóstico no carcinoma epidermóide estudados [12, 13].

sinalização Notch é uma via evolutivamente conservadas que regula a proliferação celular , apoptose e diferenciação [14]. sinalização Notch é iniciada pela ligação de NOTCH-ligando ao seu receptor, que é mediada por contacto célula-a-célula. Em humanos, há quatro receptores (NOTCH1-4), e cinco ligantes (Jagged1, 2 e DLL1, 3 e 4). A ligação do ligando ao seu receptor conduz a clivagem e libertação do domínio intracelular do receptor NOTCH (NiCd). NICD transloca-se a membrana plasmática para o núcleo, o que inicia a transcrição de genes alvo NOTCH [15]. Estudos recentes têm mostrado que a desregulação de sinalização Notch está envolvido em diversas doenças, incluindo vários tipos de cancros [16, 17]. Alterações de sinalização de Notch em células de cancro incluem ganho ou perda de mutações de função, e o receptor /ligando superexpressão [18]. Nós já demonstraram downregulation NOTCH1 em células cancerosas em CCEO por microarrays e de imunohistoquímica estudos utilizando amostras de CCEO humanos [19], e estudos recentes têm indicado que NOTCH1 atua como um supressor de tumor no CCEO patogênese [20-22].

embora ambas as FAC e Notch jogo de sinalização papéis importantes na progressão do câncer, a sinalização Notch na FAC, ao contrário de células cancerosas, e sua contribuição para o comportamento maligno não foi completamente esclarecida. NOTCH3 é fisiologicamente expressa nas células do músculo liso das pequenas artérias e regula a diferenciação e maturação destas células. A perda de função mutação de NOTCH3 foi mostrado para provocar autossómica arteriopatia dominante cerebral com enfartes subcorticais e leucoencefalopatia (CADSIL) que é caracterizada pela degeneração ou perda de células musculares lisas vasculares da mídia, espessamento da parede do vaso e os depósitos de materiais granulares osmiophilic (GOM) próxima da superfície da célula das células musculares lisas ou pericitos [23]. Estudos recentes mostraram que NOTCH3 é induzido em fibroblastos por contacto directo célula a célula com células HUVEC e promove a formação de vasos [24, 25]. Estes achados sugerem que NOTCH3 tem um papel essencial na regulação da angiogênese.

Neste estudo, nós nos concentramos na análise de NOTCH3 na FAC para investigar a sua contribuição para a progressão da CEB. Nós mostramos a expressão NOTCH3 no FAC pelo estudo imuno-histoquímico de amostras de 93 casos de CCEO língua humana e descobriu que FAC NOTCH3 positivo promover a angiogênese do tumor na presença de várias linhas celulares de cancro

in vitro

. Além disso, esta indução NOTCH3 na FAC correlacionados com pior sobrevida de pacientes com tumores. Estes resultados sugerem a utilidade da terapia alvo molecular-NOTCH3 no carcinoma epidermóide estudados.

Material e Métodos

amostras clínicas

primários de língua espécimes de carcinoma de células escamosas foram coletados de 93 pacientes que tiveram foram tratados no Hospital Dental de Tokyo Medical and Dental University. Nove CCEs gengivais primárias, 10 bucal SCCs e 9 CCEs de assoalho de boca, também foram coletadas. Todos os tecidos foram fixadas com formalina a 10% tamponada neutra e embebidos em parafina de acordo com protocolos laboratoriais de rotina. Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com a Declaração de Helsinki alterado e aprovado pelo comitê de ética da Tokyo Medical and Dental University (Registro No. 1063). Usamos cirurgicamente ressecado, tecidos CEs humanos embebidos em parafina para estudo imuno-histoquímico e fixado em formol. Apesar de consentimento informado por escrito não foi obtido dos pacientes, o comitê de ética aprovado renúncia de consentimento informado específico, em conformidade com as diretrizes éticas alteradas de Estudos Clínicos fornecidos pelo Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar do Japão (31 de Julho de 2008). Este plano de pesquisa foi divulgada em um formato de cartaz no ambulatório do departamento de cirurgia oral para garantir que os pacientes tiveram a oportunidade de diminuir o uso de suas amostras patológicas, que substituíram o consentimento informado por escrito de pesquisa e comitê de ética aprovou este processo de aprovação.

imunomarcação

Para a coloração imuno-histoquímica, foram utilizados, cortes de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina humanos CEs. Os anticorpos primários utilizados foram como se segue: anti-NOTCH3, policlonal de coelho, 1: 200 (ab23426, Abcam, CA, EUA); anti-SMA, monoclonal do rato, 1: 100 (M0851, Dako, Glostrup, Suécia). A recuperação de antígenos foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. EnVision + Dual Link (Dako) foi usado para o anticorpo secundário, e a coloração foi realizada com substrato diamino-benzidina. Por imunofluorescência dupla coloração, anti-NOTCH3, 1: 200 (Abcam), SMA, 1: 100 (monoclonal de ratinho, M0851, Dako ou monoclonal de coelho, clone SP-171, da mola Bioscinece, CA, EUA), CD34, 1: 100 ( monoclonal de ratinho, NCL-L-FIM, Leica, Wetzlar Biosystems, Alemanha) e citoqueratina, 1: 100 (monoclonal de ratinho, clone AE1 /AE3, M3515, Dako) foram usadas como anticorpo primário. Para a recuperação de antigénio, as secções foram tratadas com tampão Tris (pH = 7,4) contendo 0,1 mg /ml de tripsina durante 30 min a 37 ° C durante anticorpo CD34. Alexa Fluor 488 IgG de cabra anti-coelho (A11008, Invitrogen, CA, EUA) e Alexa Fluor 594 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho (A11005, Invitrogen) foram usados ​​como anticorpo secundário. DAPI foi utilizado para coloração nuclear. As imagens immunofluoroscent foram capturadas e analisadas utilizando Axioskop2 além de microscópio (Carl Zeiss, Jena, Alemanha).

Avaliação de Análises de imuno-histoquímica

Os resultados de imuno-histoquímica para NOTCH3 e α-SMA foram avaliados com base na intensidade de coloração e a proporção de células fibroblásticas positivos no estroma do cancro por dois patologistas sem conhecimento prévio dos dados clinicopatológicas do paciente. intensidade da coloração foi dividido em quatro grupos: negativa, fraca, moderada e forte. Casos com intensidade moderada ou forte em mais de 30% dos fibroblastos no estroma do cancro foram considerados positivos para a expressão de cada proteína.

Cultura celular

os seguintes oito escamosas de cabeça e pescoço foram usadas linhas de células de carcinoma, HO1-N-1, SAS, BHY, Ca9-22, HSC3, HSC4, HSC5 e SKN3. Estas linhas foram derivadas a partir da cavidade oral, excepto para HSC5 que foi derivado a partir do seio maxilar. Seis linhas celulares de cancro foram obtidas a partir de lesões não-orais, HeLa de SCC colo uterino, A549 do adenocarcinoma do pulmão, as células MCF-7 de adenocarcinoma da mama, MKN74 de adenocarcinoma gástrico, HCT-15 a partir de adenocarcinoma do cólon e Panc-1 a partir de adenocarcinoma pancreático, eram também usada. Todas as linhas celulares de cancro foram cultivadas como descrito anteriormente [26]. HO1-N-1, SAS, Ca9-22, HSC3 e HSC5, e SKN3 foram adquiridos a colecção japonesa de Bioresources investigação (Osaka, Japão). BHY foi fornecida pelo Dr. Masato Okamoto (TELLA Inc, Tóquio, Japão). HSC4 foi criado pelo Dr. Momose no departamento de cirurgia bucomaxilofacial em Tóquio Universidade de Medicina e Odontologia, conforme descrito no relatório anterior [27]. Panc-1 foi adquirido à American Type Culture Collection (ATCC). HeLa, A549, MKN74 e HCT-15 foram adquiridos da RIKEN Bioresource Center (Tsukuba, Japão). MCF-7 foi fornecido pelo celular Resource Center for Biomedical Research (Universidade de Tohoku, Miyagi, Japão). fibroblastos humanos normais primárias dérmicos (NHDFs) a partir de um dador adulto foram adquiridos a PromoCell (C-12302, Heidelberg, Alemanha) e células primárias DA VEIA UMBILICAL HUMANA endoteliais (HUVECs) foram adquiridos a partir de Lonza (CC-2517, Tokyo, Japão).

Análises co-cultura das células cancerosas e NHDFs

NHDFs (5 × 10

4 células /poço) foram semeadas em placas de 24 poços, incubadas em Fibroblasto Meio de Crescimento 2 Kit (C-23120 , PromoCell) durante 48 h, e em seguida co-cultivadas com várias linhas celulares de cancro (5 × 10

3 células /poço) por incubação em α-MEM durante 72 h. Subsequentemente, os NHDFs foram isolados usando o método seguinte e avaliada utilizando análise por PCR em tempo real. Para a análise de Western Blot, NHDFs (20 × 10

5 células /poço) e as linhas celulares de cancro (2 × 10

4 células /poço) foram co-cultivadas utilizando placas de 6 poços.

Isolamento NHDF a partir de co-culturas

NHDFs foram isoladas a partir de co-culturas, utilizando um sistema de separação de células activadas magnético (MACS) com microesferas anti-fibroblastos (130-050-601, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, EUA) e uma coluna MS ( 130-042-201, Miltenyi Biotec), de acordo com o protocolo do fabricante.

Transfection siRNA

Antes da co-cultura, NHDFs foram transfectadas com ARNsi para NOTCH3 humano usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com a o protocolo do fabricante. Discrição siRNA para NOTCH3 humano foi adquirido de Invitrogen. A sequência da cadeia positiva do dsRNA foi 5′- UCAAUGCUGUGGAUGAGCUUGGGAA-3 ‘.

microvasos Avaliação

A densidade microvascular (MVD) das amostras de CCEO humanos foi calculado para dois grupos, a SMA (+) NOTCH3 (-) e o grupo FAC NOTCH3 SMA (+) (+) grupo FAC. Por meio da marcação de dupla imunofluorescência para SMA ou NOTCH3 e CD34, o número de pequenos vasos CD34 positivas no SMA (+) estroma câncer de fibroblastos foi avaliada no primeiro grupo, e o número de pequenos vasos CD34 positivas em NOTCH3 (+) estroma câncer fibroblástica foi contado no último grupo. Antes da contagem do número de microvasos, examinamos primeiro cada secção a baixa ampliação de energia para identificar a área de maior densidade de microvasos, e seleccionado três campos em cada caso. Três micrografias em grandes ampliações (× 200) foram tomadas. O número de pequenos vasos CD34-positiva foi contado e o SMA (+) /NOTCH3 (+) Área fibroblástica foi quantitativamente analisada utilizando um microscópio e mais Axioskop2 AxioVsion rel 4.8 software (Zeiss). As contagens totais de microvasos CD34 positivas por Total quantificada SMA (+) /NOTCH3 (+) Área de fibroblastos de três imagens foi calculada e definida como a MVD de cada caso.

In Vitro Angiogenesis Ensaio

O

in vitro

ensaio de co-cultura organotípicas endotelial de fibroblastos foi modificado conforme relatado anteriormente [28]. Em primeiro lugar (Dia 0), NHDFs foram semeadas em placas de 24 poços (5,0 x 10

4 células /poço) e cultivadas em Meio de Crescimento de Fibroblastos durante 48 h. Em seguida, ARNsi para NOTCH3 humano foi transfectado para as NHDFs de acordo com o método acima descrito. No dia seguinte (Dia 3) células de cancro A549 (6,0 x 10

3 células /cavidade), HO1-N-1 ou e células HUVEC (3,0 × 10

4 células /poço) foram co-cultivadas com as NHDFs tratados siRNA em meio de crescimento de células endoteliais. O meio de cultura foi substituído em dias alternados. No dia 9, as células foram fixadas e imuno-histoquimicamente tratados com o anticorpo anti-CD31 (monoclonal de ratinho, 1: 100, NCL-CD31-1A10, Leica Biosystems, Newcastle, UK) e anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina (WP20006, Invitrogen) e o sinal foi visualizada utilizando o substrato BCIP /NBT (11-681-45-001, Roche). Cinco imagens de fotografia, com a rede capilar mais elevada CD31-positivo em cada poço foram capturadas usando um microscópio invertido (Eclipse TS100, Nikon, Tokyo, Japão). A área de rede capilar CD31-positivo foi quantitativamente analisada utilizando software NIH imagem J.

Efeito da NOTCH3 na Proliferação Celular

Para examinar o efeito do NOTCH3 na proliferação de linha celular CCEO, HO1-N- 1 foram semeadas (2,0 × 10

3 células /cavidade) numa placa de 96 poços revestida com um recombinante humana Fc NOTCH3 quimera (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA). A proliferação celular foi medida usando a contagem celular Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) de acordo com o protocolo do fabricante.

Western Blotting

Western blot foi realizada usando o método padrão, tal como descrito antes [ ,,,0],19]. Anti-Notch3 (D11B8, Cell Signaling, MA, EUA), alfa actina do músculo liso (ab32575, Abcam) e GAPDH (D16H11, Cell Signaling) foram usadas como anticorpo primário.

análises em tempo real quantitativa de PCR

O ARN foi extraído a partir de NHDFs, e reversamente transcrito em ADNc, tal como descrito antes [26]. PCR em tempo real foi realizado utilizando um termociclador sistema de luz (Roche Diagnostics). A expressão relativa foi calculada pela comparativa C

método T utilizando GAPDH como um controlo interno. As sequências dos iniciadores de PCR foram descritas em estudos anteriores (

NOTCH1

e

NOTCH3

[29],

NOTCH2

,

NOTCH4

e

HEY1

[19],

α-SMA

[25], e

GAPDH

[30]).

Análises estatísticas

Correlação entre NOTCH3 expressão na FAC e os parâmetros clínico foram analisados ​​utilizando o qui-quadrado ou teste exato de Fischer. Em

in vitro

ensaios, as diferenças nos valores médios entre dois grupos foram comparados pelo teste t de Student, enquanto que, as diferenças nos valores médios entre vários grupos foram analisados ​​usando um one-way ANOVA seguido por -múltiplos comparação com métodos de Tukey. taxa de sobrevida global foi estimado de acordo com a Kaplan-Meier Método e significância estatística foi analisada pelo teste de log-rank. tempos de sobrevida global foram calculados a partir da data do diagnóstico patológico inicial à data da morte.

P

-Valores inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-Ekuseru Toukei 2015 (social Levantamento de Informações Research, Tóquio, Japão).

Resultados

NOTCH3 Expressão em FAC no microambiente tumoral de CCEO

Para investigar a distribuição de NOTCH3 expressando células no microambiente tumoral, nós imunohistoquímica examinou expressão NOTCH3 em espécimes cirúrgicos de 93 casos de CCEO língua. Os fibroblastos no estroma do cancro, especialmente aqueles adjacente à periferia do tumor, apresentou coloração positiva para NOTCH3 (31 de 93 casos, 33,3%, Figura 1A e 1B). Cerca de 90% (82 de 93 casos, 88,2%) dos casos exibiram fraca expressão NOTCH3 negativo ou ocasionais nas células cancerosas. O último resultado foi compatível com o nosso estudo cDNA microarray anterior, utilizando amostras de CCEO humanos [19]. Para caracterizar ainda mais os fibroblastos NOTCH3 positivos, foi realizada a coloração imuno-histoquímica para α-SMA, que é um marcador de câncer associado fibroblastos (FAC). As secções em série dos tumores mostraram que os fibroblastos NOTCH3-positiva expressa α-SMA (Fig 1C). Duplo stainig immunofluorecent demonstrou a co-localização de NOTCH3 e α-SMA em fibroblastos (Figura 1D-1F). Conforme resumido na Tabela 1, os fibroblastos positivos α-SMA, que poderiam ser consideradas como FAC, observou-se no estroma do cancro em 64 de 93 amostras (68,8%). Os restantes 29 casos não mostrou nenhuma reação fibroblástica em torno de ninhos de câncer invasivo e foram negativas para α-SMA, embora tenha sido observado uma reação inflamatória proeminente. fibroblastos NOTCH3-positivos que foram negativos para α-SMA não foram observados em nenhum caso

A:. Histologia do tumor frente invasiva. H E de coloração. barra de escala, de 100 um. B: Distribuição de células fibroblásticas NOTCH3-positiva. C: Distribuição de células fibroblásticas a-SMA positivos. Células coradas marrom na B e C representam células positivas para cada anticorpo. As setas em A, B e C indicam camada vaso sanguíneo, que é o controlo positivo interno de cada anticorpo. D, E, F: análise imuno-histoquímica duplo para α-SMA (vermelho) e NOTCH3 (verde). A co-localização de α-SMA e NOTCH3 em fibroblastos foi observada no estroma do cancro. Barra de escala, 50 um. Ca, as células cancerosas. As linhas pontilhadas em A-F indicam a interface de ninhos e estroma cancerosas. G: curva de Kaplan-Meier para a sobrevida global em relação à expressão NOTCH3 na FAC utilizando 93 casos de CCEO humanos. Teste log-rank foi usado para calcular importância.

Embora o local envolvimento mais frequente para CEB é a língua, nós ainda imunohistoquímica investigaram a expressão NOTCH3 na FAC usando casos de CCEO ocorreu na gengiva humana, mucosa bucal e assoalho da boca. Estes resultados mostraram que FAC NOTCH3 positivo apareceu em CCEs gengivais (4 de 9 casos, 44,4%), CECs bucais (3 em 10cases, 30%) e CCEs de assoalho de boca (3 de 9 casos, 33,3 %) (Fig S1). Não havia muita diferença na frequência da FAC NOTCH3 positivo em estroma tumoral entre língua CCEs e outros CCEs.

Estes resultados sugerem que existem epidermóide estudados com FAC NOTCH3-positivas e carcinoma epidermóide estudados com FAC NOTCH3-negativos em sua estroma tumoral.

significado clínico-patológico de NOTCH3 expressão em FAC em carcinoma epidermóide estudados

Para caracterizar a importância da presença da FAC NOTCH3 positivo em CCEO, foi investigada a correlação entre a expressão NOTCH3 na FAC e clinico características Patológica nos casos língua CEs descrito acima. Como mostrado na Tabela 2, carcinoma epidermóide estudados com FAC NOTCH3-positivo estão associados com o tamanho do tumor significativamente maior (P = 0,0292) e metástases nos linfonodos (P = 0,0023) em comparação com carcinoma epidermóide estudados sem FAC NOTCH3-positiva. Não houve correlação entre a expressão NOTCH3 na FAC e idade, sexo ou diferenciação histológica da SCC. Nós também avaliou a correlação entre a expressão NOTCH3 na FAC eo prognóstico dos pacientes com tumores 93 da língua. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier demonstrou que pacientes com FAC NOTCH3-positivos apresentam um pior prognóstico do que aqueles sem FAC NOTCH3-positivos (Fig 1G).

epidermóide estudados Humanos estimular a expressão NOTCH3 em fibroblastos

Para confirmar estes resultados imuno-histoquímica, foi realizada

in vitro

experimentos utilizando linhas de células de CCEO co-cultivadas e fibroblastos primários normais humanos dérmicos (NHDFs). Na sequência de co-cultura, as NHDFs foram separados utilizando anti-fibroblastos Microbeads como descrito em um relatório anterior [31]. A análise de transferência de Western destas NHDFs indicaram que a sua co-cultura com carcinoma epidermóide estudados, especialmente com células HO1-N-1, estimulada expressão NOTCH3 nas NHDFs em comparação com a expressão basal quando os NHDFs foram cultivados sozinhos (Fig 2A). Além disso, os níveis de proteína α-SMA também foram mais elevados em NHDFs co-cultivadas com carcinoma epidermóide estudados em comparação com NHDFs de controlo (Fig 2A). Em seguida, analisamos ainda co-cultura NHDF /CEB usando células HO1-N-1 e NHDFs. coloração de imunofluorescência dupla de NOTCH3 e queratina neste modelo de co-cultura mostrou que feixes de NHDFs NOTCH3 positivo rodeado ninhos HO1-N-1 câncer de queratina-positivo (Fig 2B), que se assemelhava a distribuição de fibroblastos NOTCH3 positivo em torno dos ninhos de câncer no amostras de CCEO humanos. Além disso, coloração de imunofluorescência dupla para NOTCH3 e α-SMA mostrou que esses NHDFs NOTCH3-positivo também co-expressa α-SMA (Fig 2C). Western blotting e análise em tempo real quantitativa de PCR dos NHDFs separado deste co-cultura mostraram que a expressão NOTCH3 foi significativamente regulada positivamente em ambos os níveis de mRNA no NHDFs proteína e co-cultivadas com HO1-N-1, em comparação com os NHDFs cultivadas isoladamente (Fig 2D e 2E; siCtrl). A expressão de ARNm de HEY1, um alvo a jusante da fossa, foi também significativamente aumentada em NHDFs co-cultivadas com HO1-N-1 em comparação com a sua expressão na ausência de HO1-N-1 (Figura 2F; siCtrl). Além disso, a expressão α-SMA em NHDFs co-cultivadas com HO1-N-1 também foi aumentado em ambos os níveis de mRNA e proteína em comparação com a cultura na ausência de HO1-N-1 (Figura 2D-2F; siCtrl). A indução de HEY1 e α-SMA por co-cultura foi significativamente inibida na NHDFs transfectadas com ARNsi para NOTCH3 (SÍN3) em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo (siCtrl) (Figura 2D, 2F e 2G). Este Sin3 suprimiu significativamente a expressão NOTCH3 comparação com siCtrl (Figura 2D e 2E). Colectivamente, estes dados indicam que epidermóide estudados têm o potencial de induzir a actividade do entalhe, estimulando a expressão de NOTCH3 em NHDFs, e que regula a expressão da expressão NOTCH3 α-SMA. A indução NOTCH3 acima em NHDFs foi observada quando NHDFs HO1-N-1 e foram co-cultivados num sistema de contacto directo. co-cultura de separação utilizando um Transwell porosa não induziu a regulação positiva de

expressão NOTCH3

em NHDFs (Fig 2H). Este resultado implica que juxtacrine sinalização através de contacto célula-a-célula entre as células cancerosas e fibroblastos é essencial para a indução da expressão em fibroblastos NOTCH3. Além disso, o nível de expressão de mRNA de NOTCH1 ou NOTCH2 em NHDFs co-cultivadas em um sistema de contacto directo com as células HO1-N-1 não mostrou nenhuma mudança significativa em comparação com os NHDFs cultivadas sozinho. NOTCH4 expressão não foi detectada neste sistema (Figura 2I). Estes resultados sugerem que epidermóide estudados estimular especificamente a expressão NOTCH3 em fibroblastos

A: NHDFs foram cultivados sozinhos (CTL; ​​controle) ou co-cultivadas com linhagens de células CEC oral e maxilar representados.. 3 dias após a co-cultura, NHDFs foram isolados a partir desta co-cultura utilizando microesferas anti-fibroblastos para a análise de Western blot. B e C: Immunofluorostainig usando co-cultura com HO1-N-1 e NHDFs. Cultura de NHDFs isoladamente foi utilizado como controlo. Os feixes de NHDFs NOTCH3-positivos (verdes) foram observados ao redor dos ninhos AE1 /AE3-positve HO1-N-1 câncer (vermelho) (B). NOTCH3 casal e NHDFs α-SMA positivos foram interveio entre ninhos HO1-N-1 cancerosas. Ca, ninhos HO1-N-1 cancerosas. As linhas a tracejado mostram a interface de HO1-N-1 ninhos e NHDFs cancerosas. (C). barra de escala, de 100 um. Os núcleos foram contrastadas por DAPI. D-L: NHDFs transfectadas com ARNsi de controlo negativo (siCtrl) ou siRNA para NOTCH3 (SÍN3) foi cultivado sozinho ou co-cultivadas com células HO1-N-1. 3 dias após a co-cultura, NHDFs foram isolados a partir desta co-cultura e sujeitos a Western blot (D) e qPCR análises para medir NOTCH3 (E), HEY1 (F), α-SMA (L). H: NHDFs foram cultivadas isoladamente (controlo), ou directamente co-cultivados com células HO1-N-1, ou co-cultivadas com células HO1-N-1 separados por Transwell. 3 dias após a cultura, NHDFs foram isoladas e sujeitas a análise de qPCR. I: qPCR para medir a expressão de ARNm de cada entalhe na NHDFs isoladas a partir de co-cultura com células HO1-N-1. ND, não detectado. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01.

NOTCH3 Expresso em FAC regula a angiogénese

O estudo imuno-histoquímico utilizando amostras de CCEO humanos indicaram que a expressão NOTCH3 na FAC significativamente correlacionados com a T-estágio (tamanho do tumor). Este resultado sugeriu que o FAC NOTCH3-positivo promover o crescimento do tumor por estimulação da proliferação de células tumorais e /ou através do reforço da angiogénese. Para investigar estas possibilidades, é primeiro executada uma

In vitro

ensaio de proliferação celular utilizando células HO1-N-1, que expressa o ligando JAG1 NOTCH como determinado por Western blotting (Figura 3A). O tratamento com um NOTCH3-Fc /quimera humana recombinante, que se pode ligar ao seu ligando, JAG1, não afectou HO1-N-1 a proliferação (Fig 3B)

A:. Jagged1 expressão em várias linhas celulares de cancro orais foi analisada por Western blot. B: O efeito de NOTCH3 sobre a proliferação celular. A proliferação de N HO1-1 células com ou sem tratamento humano recombinante quimera NOTCH3-Fc foi monitorado durante 72hr.

Em seguida, realizamos coloração de imunofluorescência dupla de NOTCH3 e CD34 (marcador de células endoteliais ) para determinar se a expressão em NOTCH3 FAC está associada com a densidade de vasos sanguíneos em amostras CEs língua humana. densidade de micro-vasos no tumor a área invasivo foi significativamente aumentada no grupo FAC NOTCH3 (+) em comparação com o NOTCH3 (-) grupo FAC (Figura 4A e 4B). Este resultado sugeriu que NOTCH3 (+) FAC promover a angiogénese. Para investigar adicionalmente o mecanismo de tal angiogénese, foi realizado um ensaio de angiogénese por organotípicas coculturing células HO1-N-1, de HUVEC e NHDFs para determinar se NOTCH3 induzida CEB em NHDFs facilita a formação de vasos. coloração de imunofluorescência desta co-cultura mostrou uma malha CD31-positiva formada por HUVECs e NHDFs NOTCH3 positivo em torno dos ninhos de células de câncer (Fig 4C). A análise por Western blot indicou que NHDFs co-cultivadas com células HUVEC sozinho, na ausência de células HO1-N-1 mostrou indução NOTCH3 em comparação com os de controlo NHDFs. níveis muito mais elevados de expressão foram observados em NOTCH3 NHDFs que foram co-cultivadas com células HUVEC em conjunto com HO1-N-1, células (Fig 4D). Para avaliar a formação de tubo neste ensaio, foi visualizada células CD31-positivas por imunocoloração. Em comparação com o grupo de controlo, CD31-positivas a formação de tubos por células HUVEC na presença de NHDFs e ARNsi de controlo foi significativamente aumentada pela co-cultura com HO1-N-1. Esta formação do tubo foi significativamente suprimida quando as NHDFs foram transfectadas com Sin3 (Figura 4E e 4F). Estes resultados sugeriram que epidermóide estudados promover a angiogénese através da indução de expressão em NOTCH3 FAC

A e B: A comparação da densidade de microvasos (MVD) entre NOTCH3 (-) e FAC NOTCH3 (+) cafs casos.. Immunofluorostaining para α-SMA (verde), NOTCH3 (verde) e CD34 (vermelho), utilizando amostras de CCEO língua humana. Ca, ninhos de câncer. As linhas a tracejado mostram a interface dos ninhos e estroma cancerosas. Setas demonstrou a microvasos CD34-positivas. Barra de escala, 50 um. Os núcleos foram contrastadas por DAPI (A). A avaliação quantitativa de MVD entre estes dois grupos (B). C-F:

In vitro

ensaio de angiogénese co-cultivadas com células HO1-N-1, células HUVEC e siRNA NHDFs transfectadas. Immunofluorostaining para NOTCH3 (verde) e CD31 (vermelho). Ca, ninhos HO1-N-1 cancerosas. As linhas ponteadas indicam a margem dos ninhos cancerosas HO1-N-1. barra de escala, de 100 um. Os núcleos foram contrastadas por DAPI (C). NHDFs isolado a partir desta co-cultura foram sujeitos a Western blot (D). Imagem representativa de formação do tubo por HUVECs em cada condição. barra de escala, de 100 um (E). A avaliação quantitativa da área de formação do tubo (área de CD31-positivo) em cada condição (F). siCtrl, ARNsi de controlo negativo. Sin3, siRNA para NOTCH3. **

P Art 0,01.

Para investigar se a indução NOTCH3 em fibroblastos é uma propriedade única de carcinoma epidermóide estudados, nós co-cultivadas NHDFs com linhas celulares derivadas de cancros de vários órgãos, incluindo colo uterino, pulmão, mama, estômago, cólon e pâncreas. análise de transferência de Western indicou que as células A549, que são uma linha celular de adenocarcinoma de pulmão, estimulou a expressão de NOTCH3 em NHDFs a um nível que foi semelhante à induzida por HO1-N-1 (Figura 5A). Um

In vitro

ensaio de angiogénese mostrou que as células A549 induziu significativamente a formação de tubos HUVEC no quando co-cultivadas com NHDFs e que essa malha foi significativamente reduzida por knockdown NOTCH3 em NHDFs (Fig 5B e 5C). A análise de Western blot de NHDFs isolado a partir do ensaio de angiogénese revelou resultados semelhantes aos obtidos quando co-cultivadas com células HUVEC NHDFs e-N-1 HO1 foram analisados ​​(Figura 5D). Estes resultados indicam que, para além CEB células cancerosas pode induzir NOTCH3 em FAC e promover a angiogénese

A:. NHDFs foram co-cultivadas com várias linhas celulares de cancro derivadas de lesões não-orais. 3 dias após a co-cultura, NHDFS foram isolados a partir desta co-cultura e sujeito a análise de transferência de Western para detectar e NOTCH3 α-SMA. B-D: Ensaio de angiogénese in vitro co-cultivadas com A549, células HUVEC e NHDFs siARN transfectadas. Imagens representativas da formação de tubo (B) e a sua avaliação quantitativa (C) em cada condição. barra de escala, de 100 um. **

P Art **

P Art