Abstract
Apesar do cancro são amplamente considerados a ser mantido por células-tronco, a existência de células-tronco em células renais carcinoma (RCC) raramente tem sido relatado, em parte devido à ausência de marcadores de superfície únicos. Nós aqui identificadas células semelhantes a células-tronco do câncer com a população lateral (SP) fenótipo em cinco linhas de células RCC humanos. Citometria de fluxo revelou que 769P, uma linha de células de carcinoma de células renais humana de células claras, continha a maior quantidade de células de SP, em comparação com outros quatro linhas celulares. Estas células 769P SP possuía características de proliferação, a auto-renovação e diferenciação, bem como uma forte resistência à quimioterapia e radioterapia que foram possivelmente relacionados com o transportador ABCB1.
In vivo
experimentos com transplante de tumor em série em ratos também mostraram que as células 769P SP tumores em NOD /SCID formado. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que as células 769P SP tem as propriedades das células-tronco do câncer, que pode desempenhar um papel importante na tumorigênese e terapia-resistência do RCC
Citation:. Huang B, Huang YJ, Yao ZJ, Chen X, Guo SJ, Mao XP, et ai. As células (2013) Stem Cancer Cell-Como Side Populacionais em Células Claras, carcinoma de células renais 769P linha celular. PLoS ONE 8 (7): e68293. doi: 10.1371 /journal.pone.0068293
editor: Neil A. Bhowmick, Cedars Sinai Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 01 de março de 2013; Aceito: 28 de maio de 2013; Publicação: 11 de julho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Natural Science Foundation (No. 81.272.809, No. 80.202.011, No. 81.202.013, No. 30.872.584); Guangdong Natural Science Foundation (nº 8251008901000018, No. S2012040007557); Sun Yat-sen Programa talentos inovadores de cultivo para excelente Tutores (N.º 80.000-3.126.205); Ciência e Tecnologia Planejamento Projeto da província de Guangdong, China (No. 2011B050400021, No. 2012B090600021, No. 445323198311050317); e Guangdong Key Laboratory of Urology, o Hospital primeira afiliada da Universidade de Medicina de Guangzhou (No. 2010A060801016). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
câncer renal é um importante problema de saúde, causando mais de 15.000 mortes na América do Norte anualmente. câncer renal com metástase ou pelo estágio avançado em adultos é resistente a medicamentos quimioterápicos convencionais [1]. Elucidar a gênese desse tipo de câncer vai ajudar o diagnóstico precoce e tratamento, melhorando assim o prognóstico.
Os tumores sólidos são compostos por diversos tipos de células com diferentes capacidades de proliferação. Apenas uma pequena população destas células podem formar tumores em ratinhos imunodeficientes [2]. Esta observação conduziu ao conceito de cancro de células estaminais (CCC), as chamadas células de iniciação do tumor ou células cancerosas haste, do [3], [4], [5], [6], que foram pensados capaz de proliferando, auto-renovação e diferenciação em múltiplas linhagens, desempenhando assim um papel essencial tanto no desenvolvimento e tratamento de tumores [2], [3]. Embora CSCs foram isolados a partir de vários tipos de tumores humanos, incluindo os cancros hematológicos [7], do cancro do ovário [8], o cancro da próstata [9], o cancro da mama [10], e tumores cerebrais [11], a falta de específicos de CSC marcadores de antígenos de superfície celular foi delimitada uma investigação mais aprofundada sobre este tema [12]. população lateral (SP) é um termo citometria de fluxo (FCM) para definir grupos de células com forte capacidade de efluxo de corante de ADN Hoechst 33342 através de transportadores ABC. as células da população lateral desaparecem após tratamento com bloqueadores do canal de cálcio ou inibidores de transportadores ABC, tais como o verapamil e a rapamicina [13] .Este actividade conduz ao “lado” (baixa fluorescência) fenótipo da população e acredita-se ser um auto fundamentais -protective função e, portanto, uma característica de células-tronco universal [14], [15]. Desde que foi introduzido pela primeira vez por Goodell et al. em 1996 [16], as células SP têm sido amplamente relatado para ser enriquecido em vários tecidos cancerígenos, tais como o cancro da mama [17], tumores do sistema gastrointestinal [18], e cancro de células pequenas do pulmão [19] e a partir de linhas celulares, tais como nasofaríngea carcinoma [20], carcinoma hepatocelular [21], e cancro da bexiga linhas de células [22]. células SP, com potenciais stemness, podem formar tumores de xenoenxerto em animais e são resistentes à quimioterapia e radioterapia, contribuindo para a reincidência do tumor [23].
RCC, o terceiro cancro mais comum do tracto urinário, é responsável por aproximadamente 3% de todas as malignidades humanas. CCRs são classificados como células claras, papilares, chromophobe, ducto coletor, e não classificados RCC, com CCR de células claras (câncer de células claras) como o tipo mais prevalente. Que responde por 82% da RCC. O tratamento do câncer de células claras metastático continua a ser um grande desafio para os clínicos e faz com que aproximadamente 35% da mortalidade relacionada com o RCC [24]. casos RCC têm vindo a aumentar de forma constante ao longo de décadas [25]. Além disso, a maioria dos pacientes que já têm ou doença metastática no momento do diagnóstico inicial ou metástases distantes do tumor primário após a ressecção [26]. O prognóstico da CCR é pobre em parte devido à resistência de RCC metastático para a maioria das terapias actuais, tais como a quimioterapia e a radioterapia. terapia direcionada contra CSCs podem trazer uma nova esperança para melhorar o prognóstico de pacientes com CCR.
Embora o progresso significativo foi feito em pesquisa SP, o papel das células SP no CCR continua a ser plenamente determinada [27], [28 ], [29], [30]. Addla et ai. [29] relataram que ambas as células epiteliais renais normais e malignas continha uma proporção de células SP que foram enriquecer com algumas propriedades semelhantes a células estaminais. Mais recentemente, Nishizawa et al. [30] descobriram que células SP derivadas de células RCC apresentou maior capacidade de iniciação do tumor do que as células NSP. Portanto, temos a hipótese de que as células SP são uma fração enriquecida de células-tronco cancerosas.
O presente estudo foi realizado para identificar as células SP a partir de linhas de células RCC humanos estabelecidos e determinar as suas características e papéis na tumorigênese e tratamento de RCC. Aqui, foram isoladas células de SP de células 769P, uma linha de células de câncer de células claras humano, por coloração de Hoechst e citometria de fluxo. Nossos in vitro e in vivo demonstraram que as células SP possuía as conhecidas características CSC de proliferação, auto-renovação e diferenciação, bem como uma forte resistência à quimioterapia e radioterapia que foram possivelmente relacionadas com o transportador ABCB1. Estas descobertas podem fornecer novas perspectivas para futuras pesquisas CSC e terapia anti-câncer clínica.
Materiais e Métodos
Cultura celular
Cinco linhas de células RCC humanos 769P, 786-O , SO-RC-2, SN12C, e SKRC39 foram usadas neste estudo. As linhas de células 769P e 786-O foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA); OS-RC-2, SN12C e SKRC39 foram gentilmente oferecida por Dr. Zhuowei Liu (Departamento de Urologia, Sun Yat-sen University Cancer Center), que obteve estas linhas celulares de Type Culture Collection da Academia Chinesa de Ciências (Shanghai, China) [31], [32], [33]. 769P, 786-O, SO-rc-2 células, e SKRC39 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, Califórnia, EUA), enquanto que as células SN12C foram cultivadas em meio modificado de Dulbecco de Eagle (DMEM, Gibco) a 37 ° C em CO a 5%
2 atmosfera. Ambos os meios continha 10% de soro fetal de vitelo (FCS, Gibco), 1% (v /v) de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina.
lateral análise da população e separação de células
população lateral análise e classificação de células foram realizados como anteriormente descrito por Goodell et ai. [16] com modificações. Resumidamente, as células foram tripsinizadas, suspensas em 1 × 10
6 células /mL em pré-aquecido meio RPMI-1640 contendo 2% de FBS e 10 mmol /L de HEPES (Gibco), depois incubadas com 5 ug /ml de Hoechst 33342 (Sigma , St. Louis, MO, EUA), quer isoladamente ou em combinação com 50 pmol /L de verapamil (Sigma), um inibidor de transportador ABC, no escuro, durante 90 minutos no banho de água a 37 ° C com mistura intermitente. No final da coloração, as células foram centrifugadas e ressuspensas em HBSS frio (Gibco) contendo 2% de FBS e 10 mmol /L de HEPES. FCM análise e classificação de células foram, em seguida, levada a cabo directamente no fluxo EPICS ALTRA Cytosorter (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA). Hoechst 33342 estava animado com 100 mW do laser UV e foi detectado com 450 filtro BP para a fluorescência azul e 675 filtro BP para fluorescência vermelha. A 610-
nm espelho dicróico curta Restaurant –
passar
(DMSP) do filtro foi usado para separar os comprimentos de onda de emissão. Um portão ao vivo poligonal no lote azul FS-HO foi criada para excluir detritos e células mortas. células SP e células não-SP (NSP) foram classificadas para os ensaios seguintes.
Formação Clone e de longo prazo de Diferenciação Os ensaios
De acordo com o modo de classificação autoclone, a cada 500 769P células de SP ou NSP fenótipo foram classificados directamente para uma placa de cultura de 6 cm, e cultivadas com meio RPMI-1640 completo cultura durante 10 dias. Depois de a maioria dos clones de células tinha expandido para mais de 50 células, elas foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas em 75% de metanol durante 15 min, e coradas com violeta de cristal durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, os pratos foram lavados e o número de clones que continham mais do que 50 células foram contadas sob um microscópio de contraste de fase. A eficiência de formação de clones foi a razão entre o número de clones com o número de células semeadas. Os ensaios de formação de clones foram repetidas em triplicado.
O ensaio de diferenciação de longo prazo foi realizada 10 dias após a separação de células, de acordo com o protocolo de análise da população lado, para determinar a capacidade de diferenciação das células SP e NSP.
mRNA detectar a expressão da ABC Family Members in Ordenado 769P SP células por RT-PCR
RNA total foi extraído de SP e células NSP separadamente usando o reagente Trizol (Invitrogen, San Diego, CA). A expressão de ABCB1, ABCC1, ABCG2 e foi detectado utilizando o PrimeScript
Kit TMRT-PCR (Takara, Otsu, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores (Tabela 1) foram desenhados e sintetizados pela Invitrogen. GAPDH foi usada como uma referência interna. As condições de PCR foram desnaturação a 94 ° C durante 4 minutos seguido de 40 ciclos de recozimento a 94 ° C durante 45 s, 58 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 45 s, com alongamento a 72 ° C durante 8 min . Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em agarose a 1,5% para a expressão de mRNA dos membros da família do ABC.
detectar a expressão de proteína de ABC Family Members in Ordenado 769P SP Células por Western Blotting
As proteínas totais foram extraídos a partir de SP e células NSP separadamente e desnaturadas em tampão de amostra de dodecilsulfato de sódio (SDS), então igualmente carregado em gel de poliacrilamida a 8%. Após a electroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. As membranas foram incubadas com anticorpos primários indicados durante a noite a 4 ° C, em seguida, incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano, e foram finalmente detectados utilizando quimioluminescência aumentada ocidentais reagentes de detecção de mancha (GE Healthcare, Reino Unido). O ABCG2 rato (em 1:1,000 diluição), ABCB1 (1:1,000), e ABCC1 (1:5,000) anticorpos monoclonais a partir de Abcam Inc. (Cambridge, Reino Unido), bem como anti-GAPDH (1:2,000) de Santa Cruz biotecnologia (Santa Cruz, CA, EUA) foram utilizados para determinar os níveis de proteína relativos.
Radiation and Drug sensibilidade Ensaios
SP
para determinar a sensibilidade das células à radiação, recém-ordenados e células NSP foram semeadas em placas de 6 poços (500 células /poço), e foram expostas a 5 Gy de raios-X (500 cGy /min, usando de 12 cm x 6 centímetros campo de irradiação) com ou sem 30 minutos de pré-incubação com verapamil (50 mmol /L) o dia após a triagem. Quando a maioria dos clones de células tinha mais de 50 células, que foram coradas com violeta de cristal para determinar o número de células de sobrevivência.
Para determinar a sensibilidade de células a drogas, células SP e NSP foram semeadas em placas de 96 poços (500 células /poço) e cultivadas com mitoxantrona (MTX, um inibidor de agente anti-neoplásico de topoisomerase II, Sigma), 5-fluorouracilo (5-FU, Sigma), ou de sunitinib (um inibidor da tirosina cinase, Sutent, Pfizer, Nova Iorque, EUA ) no dia seguinte em um gradiente de concentração, com ou sem 30 minutos de pré-incubação com 50 mmol /mL de verapamil como um chemosensitizer a mitoxantrona. células não tratadas foram utilizados como controle. Quatro poços paralelos foram definidos para cada grupo. Após 3 dias, a absorvância de cada poço a um comprimento de onda de 570 nm (
Um
570) foi medida. taxa de sobrevivência celular foi calculada usando a fórmula: taxa de sobrevivência = (média
A
570 dos poços de teste /média
A
570 dos poços de controlo) × 100% . taxa de inibição foi calculada utilizando a fórmula:. taxa de inibição = 100% – taxa de sobrevivência
Formação xenoenxerto de tumor Ensaio
As experiências com animais foram realizados em estrita conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Laboratório animais de Sun Yat-sen University. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal do Primeiro Hospital Filiado de Sun Yat-sen University. Um total de 54 5 a 7 semanas de idade não obesos diabéticos (NOD) /camundongos fêmeas graves imunodeficientes combinados (SCID) foram obtidos a partir do Centro Experimental animal de Sun Yat-sen University. Os ratos foram divididos em 6 grupos, com 9 ratinhos em cada grupo. quantidade indicada de SP recentemente classificados e células NSP foram suspensos em 200 ul de PBS, separadamente, e inoculou-se por via subcutânea para a fossa axilar de ratinhos NOD /SCID imediatamente após a triagem. Os ratinhos foram monitorados duas vezes por semana para a formação de tumores palpáveis. Às 6 semanas após a inoculação, os ratinhos foram sacrificados para avaliar a formação de tumores. Os tumores foram medidos utilizando um compasso de calibre de Vernier, pesados, e fotografados. Uma porção de cada tumor subcutâneo foi colhidas, fixadas em formaldeído a 10% e embebidos em parafina para avaliação patológica depois com H E de coloração. A outra porção de cada tumor foi dissociado em suspensão de célula única, que foi preparado como descrito anteriormente [34], com modificações menores. Resumidamente, o tecido tumoral foi dissociado manualmente em fragmentos de 0,5 mm e todos os aglomerados visíveis foram removidos, em seguida, digerido com 1 mg /mL de colagenase tipo II (Sigma) e 1,2 mg /mL Dispase (Sigma) durante 45 a 90 min a 37 ° C. Ocasionalmente, 0,2 ug /ml de tripsina (Invitrogen) foi utilizado para 10 min para assegurar a dissociação em células individuais. As células foram filtrados através de filtros de células de 70 mícrons consecutivos para remover aglomerados remanescentes. As células recolhidas foram suspensas em PBS suplementado com 1% de FCS. Pelo menos 100.000 células colhidas foram corados para análise SP. Vinte 5 a camundongos fêmeas SDIC 6 semanas de idade, foram divididos igualmente em 4 grupos de ensaio de transplante de série. Cada 5.000 células dissociadas de um tumor xenoenxerto, que foi formado com 2.000 SP células, 20.000 SP células, 20.000 células NSP, ou 200.000 células NSP, foram re-inoculado em camundongos NOD /SCID. avaliação de formação de tumores e o exame patológico foram realizadas 6 semanas mais tarde.
Análise estatística
Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (DP) de pelo menos três experiências independentes. 2007 e SPSS13.0 softwares Microsoft Office Excel foram utilizados para processamento de dados. A significância estatística foi determinada com
t
teste de Student. A
P
valor 0,05 foi considerado significativo
Resultados
existência de células SP em linhas de células RCC
Cinco linhas de células RCC foram analisadas para. seus fenótipos SP. O portão R2 mostra que a percentagem de células SP, com dim Hoechst 33342 fluorescência, caiu de 4,82% entre células 769P sem tratamento verapamil a 0,02% entre células 769P com verapamil pré-incubação (Fig. 1A). Novo teste de células classificadas demonstrou uma pureza de 96,61% para as células SP e 99,89% para as células de NSP (Fig. 1B). Para as restantes quatro linhas de células RCC, as proporções de células de SP em 786-S e células SO-RC-2 foram de 0,1% e 0,2%, que foram demasiado baixos para as seguintes experiências; não há células SP foram detectadas entre SN12C e células SKRC39 (Fig. S1). Portanto, células SP e NSP foram ordenados a partir de células 769P para experiências posteriores.
A, SP classificação usando Hoechst 33342. Um portão ao vivo poligonal foi criada para excluir detritos e células mortas. Pelo menos 50.000 células foram adquiridas para analisar o fenótipo SP de cada amostra. A percentagem de células SP caiu quando as células 769P foram pré-incubadas com verapamil para bloquear o transportador de ATP. B, a pureza das células recém-ordenados 769P SP e não-SP (NSP) foi 96,61% e 99,89% (1-0,11%).
Formação Clone e diferenciação de Ordenado 769P SP e Células NSP
Após 7 dias de cultura, a maioria dos clones continham mais do que 50 células. Contamos o número de clones e verificou que a eficiência de formação de clones significativo células SP foi significativamente mais elevada do que a de células [NSP (56,4 ± 1,3)% vs (22,7 ± 1,5)%,
P
0,001; FIG. 2A).
a, ensaios de formação de clones revelam que a eficiência da formação de clones de células SP recém-ordenadas foi maior do que a de células de PNS. **,
P Art 0,01. B, em 10 dias após separação, a proporção de células SP (indicado pela porta R2) entre as células SP ordenados e classificados células NSP foram medidos. A proporção de células SP entre células SP ordenadas só é 19,51%, o que sugere que as células SP mais ordenadas são diferenciadas em células de PNS. A proporção de células SP entre as células NSP ordenadas apenas 2,39%, o que sugere que as células NSP ordenados não podem se diferenciar em células SP.
Após 10 dias de cultura, as células 769P SP mais ordenados diferenciadas em células NSP, Considerando que apenas uma pequena proporção de células SP foram detectadas entre as células 769P NSP ordenados (Fig. 2B), sugerindo a capacidade das células SP se auto-renovar e diferenciar em células NSP.
Expressão da ABC Family Members em Ordenado 769P SP e NSP células
A expressão de ABCB1, ABCG2, e ABCC1 foi detectada por RT-PCR e transferência de Western. Ambos os experimentos mostraram que ABCB1 foi expresso a um nível elevado em células SP ordenados mas a um nível bastante baixo em células NSP ordenados, enquanto ABCC1 e ABCG2 eram indetectáveis em qualquer SP ordenada ou células NSP (Fig. 3).
a, reacção em cadeia da polimerase-transcrição reversa. B, Western blotting. Pista 1, classificado células NSP; pista 2, classificado células SP. GAPDH foi usada como um controlo interno. Ambos os experimentos mostram que a expressão ABCB1 é mais forte em SP do que nas células NSP e que ABCG2 e ABCC1 não são expressos em células SP e NSP.
Sensibilidade do Ordenado 769P SP e NSP células à radiação e Drogas
Nós medimos a sensibilidade das células 769P SP e NSP ordenados à radiação por ensaio de formação de clone. A eficiência de formação de clones de células SP foi significativamente mais elevada do que a de células NSP antes ou após a irradiação (
P
0,05; Fig. 4A). Em detalhe, a eficiência formação clone de células SP não mudou notavelmente após a radiação (
P Art 0,05), enquanto que a de células NSP diminuiu drasticamente (
P Art 0,05), sugerindo que as células SP foram mais resistentes a danos de raios X do que as células de PNS.
a, a eficiência de formação de clones de células 769P SP ordenadas é significativamente mais elevada do que a de células NSP quer antes ou depois de 5 Gy de raios-X irradiação. A eficiência de formação de clones de células SP é significativamente mais elevada do que a de células após a irradiação NSP (
P
0,01); a eficiência de formação de clones de células não irradiadas NSP é significativamente maior do que a de células irradiadas NSP (
P
0,05). B, células SP 769P recentemente classificadas são mais resistentes do que as células de mitoxantrona NSP (
P
0,01), ao passo que esta resistência é invertida com tratamento prévio verapamil. células C, Sp também são mais resistentes a 5-fluorouracilo do que as células NSP (
P
0,05). A resistência pode também ser invertida, com o pré-tratamento de verapamil. D, a sensibilidade das células de SP de sunitinib é semelhante ao de células de NSP (
P
0,05)
também mediu a sensibilidade de células 769P SP e NSP ordenadas. a MTX, 5-FU, e sunitinib. células SP mostrou uma forte resistência a MTX, enquanto que as células NSP foram sensíveis ao MTX (
P
0,001). O verapamil, um inibidor de transportador ABC, aumentou o efeito inibidor da mistura em células SP, com uma taxa de inibição da proliferação similar à das células NSP sob as mesmas condições (
P
0,05); No entanto, o verapamil não para aumentar o efeito da mistura sobre células NSP (
P
0,05) (Figura 4B.). Nós também descobrimos que as células SP eram muito mais resistentes a 5-FU do que as células NSP (
P Art 0,05; A Fig. 4C), mas as suas sensibilidades a sunitinib foram similares (
P Art 0,05;. a Fig. 4D)
formação de tumor de células classificadas 769P SP e NSP em NOD /SCID
células Ordenado 769P SP e NSP foram inoculadas em camundongos NOD /SCID para observar sua capacidade para formar tumores. Um rato que foi inoculado com 20.000 células NSP e 1 com 200.000 células NSP morreram após a inoculação. Às 6 semanas após a inoculação das células, 2 ratinhos desenvolveram tumores, com apenas 200 SP células, ao passo que o menor número de células para formar tumores NSP foi de 20.000 células (Figura 5A;. Tabela 2). O exame patológico confirmou que os tumores formados com células SP e NSP mostrou as mesmas características que as células normais como as células RCC apenas 769P não ordenados (Fig. 5B).
, locais de injecção A e B de ratinhos NOD /SCID no 6 semanas após a inoculação com SP recém-classificadas ou células NSP. Os tumores são observados em todos os ratinhos inoculados com células SP 2.000, mas não em ratinhos inoculados com 2.000 células NSP. C e D, o exame patológico mostra carcinoma de células renais típica em camundongos inoculados com tanto 2.000 SP células ou 200.000 células NSP.
Para confirmar o papel postulado de células SP na formação de tumores, um tumor formado com 200 células de SP, e um tumor formado com 20000 células NSP foram dissociados em suspensão de células, respectivamente, e foram coradas com Hoechst 33342. análise de citometria de fluxo mostrou que a proporção de células SP foi maior em tumores formados por células SP do que em tumores formados por células NSP . (Fig. 6), sugerindo o desenvolvimento in vivo de auto-renovação e diferenciação de NSP-
células SP
a, as células foram dissociadas a partir do tumor formado com 200 células 769P SP; B, as células foram dissociadas a partir do tumor formado com 20000 células 769P NSP. A proporção de células SP foi maior no tumor formado por células SP do que no tumor formado por células NSP (1,5% vs. 0,2%).
Para determinar ainda mais a capacidade formação de tumores de segunda geração SP células, foi inoculado 5.000 células SP (a partir de 2 tumores formados com 20.000 e 2.000 células SP, respectivamente) ou 5000 células NSP (a partir de 2 tumores formados com 200.000 e 20.000 células NSP, respectivamente) em ratinhos NOD /SCID. Todos os ratinhos desenvolveram tumores 6 semanas após a inoculação. Os de segunda geração tumores NSP foram significativamente menores e mais leves do que os tumores SP de segunda geração (
P Art 0,01; A Fig. 7A e B). Todos os tumores de segunda geração foram histologicamente idêntico ao xenoenxerto de tumores primários (Fig. 7C). Estes resultados indicaram que as células SP foram capazes de gerar tumores em série.
a, NOD /SCID foram inoculados com 5000 células SP de segunda geração a partir de um tumor formado com 2.000 células SP ou com 5000 células NSP de segunda geração a partir de um tumor formado com 200.000 células NSP. Os tumores foram removidos dos ratos 6 semanas após a inoculação. B, os tumores SP de segunda geração são significativamente mais pesado do que a segunda geração de tumores NSP (**
P Art 0,01). C, o exame patológico mostra que tanto o tumor SP de segunda geração eo tumor NSP de segunda geração são histologicamente idêntico ao tumores de xenoenxerto primários.
Discussão
Nos últimos anos, pesquisas sobre CSCs em tumores sólidos têm demonstrado resultados notáveis. Neste estudo, foram isoladas células de SP de linhas celulares de células claras RCC humanos para determinar as propriedades biológicas desta população de células.
Verificou-se que 4,8% de células RCC foram 769P células SP, que mostraram a capacidade de auto- renovação e diferenciação de multi-linhagem. Observou-se uma eficiência de formação de clones de células SP mais elevadas do que a de células de PNS. Além disso, as células SP mostrou capacidade formação do tumor, pelo menos, 100 vezes mais elevada do que a de células de PNS. Os tumores foram formados em NOD /SCID que foram inoculados apenas com células SP 200 recém-ordenadas, enquanto que, pelo menos, 20.000 células NSP foram necessários para formar tumores em ratinhos. Estes resultados fornecem evidência direta para a alta tumorigenicidade de células SP.
A auto-renovação e capacidades de diferenciação multi-linhagem são características de células-tronco. Serial transplante de células em modelos animais, embora imperfeita, pode ajudar a avaliar a estabilidade das células de SP em comportamentos biológicos. A nossa análise SP re-ordenação em série após o transplante de células de SP em ratinhos mostraram que as células SP-segunda geração derivadas de tumores de xenoenxerto de células SP mantida a capacidade de auto-renovação e diferenciação de multi-linhagem. Além disso, as células de ambas as SP e NSP tumores de xenoenxerto mantida a capacidade de formar tumores em ratinhos, mas os tumores SP de segunda geração foram significativamente mais pesado do que a segunda geração de tumores PNS, sugerindo que as células 769P SP são mais do que as células tumorigénicas NSP.
de células estaminais do cancro é considerado capaz de passar por uma divisão celular auto-renovação assimétrico, dividindo-se em uma célula-tronco e uma célula progenitora, o que poderia gerar uma variedade de células funcionais mais diferenciadas que compreendem da sociedade tumoral inteira [35]. Em nosso estudo, a pureza das células 769P SP ordenadas foi 96,61% ea de células NSP ordenadas foi 99,89%. É possível que algumas células SP pode ter ligado a células NSP e, portanto, foram recolhidos juntos. Depois de cultura de 10 dias, as células SP ordenados desenvolvido em uma comunidade contendo 19,51% de células SP e cerca de 80% de células NSP, enquanto as células NSP ordenadas desenvolvido em uma comunidade contendo apenas 2,39% de células SP que podem surgir a partir de alguns furtiva-in SP células durante a classificação. NSP células podem formar colónias alguns tumores menores e também regeneradas embora os tumores eram mais pequenos. Tomado os achados de diferenciação de longo prazo e experiências de transplante de série em conjunto, sugerem fortemente que as células SP sofrem divisão assimétrica e são capazes de se diferenciar em células NSP e formando a maior parte do tumor. As capacidades de células NSP para formar colónias e tumores, que foram muito mais fracos do que as capacidades de células SP, pode ser explicado pela pequena proporção de aprontar-SP em células entre células NSP ordenadas.
O fenótipo é SP determinada pelos estados de ABC transportadores ABCB1, ABCC1-5 e ABCG2 [36]. Assim, as células SP são classificados por meio da medição da rápida efluxo de corantes fluorescentes lipofílicos por transportadores ABC [16]. A maioria dos estudos anteriores focaram-se na função de ABCG2, enquanto que a necessidade da função de bomba da ABCB1 na expansão de células estaminais estava sob debate [37]. No nosso estudo, a expressão de ABCB1 foi elevada em células SP mas baixa em células NSP conforme detectado por ambos RT-PCR e transferência de Western. Curiosamente, nem ABCC1 nem ABCG2 foi expressa em células de SP e de PNS, sugerindo que apenas ABCB1 contribui para a função de fenótipo SP em células 769P.
De acordo com a teoria CSC, CSCs em tumores sólidos são resistentes à quimioterapia e radioterapia e residentes CSCs que sobreviveram tratamento pode reformar tumores [38]. Realizamos ensaios Chemosensitivity e radiossensibilidade para comparar a sensibilidade das células SP e NSP às terapias convencionais. Descobrimos que as células SP foram mais resistentes à radiação do que células NSP. Além disso, as células SP foram mais resistentes a misturar e 5-FU do que as células de PNS, o que indica que as células SP são amplamente resistentes a fármacos quimioterapêuticos convencionais. No entanto, esta resistência aos fármacos pode ser revertida pelo pré-tratamento com o verapamil, um inibidor de transportador ABC, sugerindo que os transportadores de ABC pode ser responsável pela resistência a drogas [36], [37], [39].
Em conclusão, o nosso estudo provou que as células SP isoladas a partir da linha de células RCC 769P possui haste características celulares, tanto através
in vitro
e
in vivo
experimentos. Estas células SP são caracterizados por forte potencial de proliferação, auto-renovação, a diferenciação, a resistência à quimioterapia e radiação, e
in vivo
tumor capacidade de formação. ABCB1 foi encontrada para contribuir para a função das células SP. Felizmente, o desenvolvimento de uma terapia alvo desta população celular vai ajudar a melhorar o prognóstico da RCC.
Informações de Apoio
Figura S1.
células SP ordenação resulta em linhas de células humanas de cancro renal de células 786-S, SO-RC-2, SN12C, e SKRC39 usando Hoechst 33342. apenas algumas células SP foram detectados entre 786-S e células de OS-2-RC , e a percentagem de células SP caiu quando as células foram pré-incubadas com verapamil durante cerca de 30 min. Nenhuma célula SP foram detectadas entre as células SN12C e SKRC39
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068293.s001
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