Abstract
Micro RNAs (miRNAs) são importantes reguladores envolvidos em vários processos físicos e patológicos, incluindo o cancro. A família miARN-302 tem sido documentada como tendo um papel crítico na carcinogénese. Neste estudo, nós investigamos o papel de miRNA-302a no câncer de cólon. expressão miRNA-302a foi detectada em 44 tecidos de câncer de cólon e 10 tecidos de cólon normais, e seu significado clínico-patológico foi analisada. A proliferação celular e análise do ciclo celular foram realizadas em células cancerígenas do cólon que expressam estavelmente miARN-302a. O gene alvo de miRNA-302a e a via de jusante foram ainda investigadas. Em comparação com os tecidos do cólon normais, expressão miRNA-302a foi regulada negativamente em tecidos de cancro do cólon. Superexpressão de G1 induzida miRNA-302a /S paragem do ciclo celular em células de câncer de cólon, e proliferação de células de câncer de cólon suprimida ambos
in vitro
e
in vivo
. Além disso, o miRNA-302a inibida
AKT
expressão pela directamente vinculativa para a sua região 3 ‘não traduzida, resultando em alterações posteriores da
AKT-GSK3β-ciclina D1
via. Estes resultados revelam miARN-302a como um supressor tumoral no cancro do cólon, o que sugere que miARN-302a pode ser utilizado como um alvo potencial para a intervenção terapêutica em cancro do cólon
citação:. Dom S, Zhang L, Wu Z, shi W, Yang B, Li Y (2014)
MicroRNA-302a
Funciona como um supressor tumoral putativo no cancro do cólon por Segmentação
Akt
. PLoS ONE 9 (12): e115980. doi: 10.1371 /journal.pone.0115980
editor: Chun-Ming Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 15 Setembro, 2014; Aceito: 02 de dezembro de 2014; Publicação: 26 de dezembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Sun et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. As características clinicopatológicas não estão disponíveis ao público, mas pode ser disponibilizada mediante solicitação ao autor correspondente. Todos os dados necessários para replicar o estudo estão presentes no papel
Financiamento:.. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório
Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
de acordo com o Relatório de Registro de câncer anual chinês (2012), cólon /reto câncer tornou-se o segundo câncer mais comum ea segunda e quarta principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em mulheres e homens, respectivamente, na China [1]. Na verdade, o cancro do cólon é um dos cancros mais comuns no mundo, sendo responsável por cerca de 9% das mortes relacionadas ao câncer [2], principalmente devido à progressão metastática [3]. Isto exige a identificação de marcadores moleculares avançadas para o diagnóstico que ajuda no diagnóstico precoce e na prevenção da progressão metastática no câncer de cólon. A cirurgia continua sendo o tratamento de escolha para o câncer de cólon; mas nos últimos tempos, uma abordagem mais multidisciplinar incorporando quimioterapia neoadjuvante se tornou a marca registrada do tratamento [4]. Talvez não pode ser enfatizado o suficiente embora a necessidade de monitorar a resposta do tumor à terapia, a fim de selecionar os melhores candidatos para a cirurgia para garantir resultados positivos, e aí reside a necessidade de compreender o mecanismo patológico subjacente de aparecimento e progressão do cancro do cólon. Os eventos críticos que controlam todo o processo de metástase do cancro do cólon são ainda desconhecidos.
A evidência crescente indica que microRNAs (miRNAs), um tipo de endógeno, pequenos RNAs não-codificantes, participar de diversos processos celulares. Através de se ligar especificamente e clivagem de ARNm ou inibindo a sua tradução em [5], a função miARNs quer como oncogenes ou supressores de tumor [6].
A família miARN-302 foi identificado pela primeira vez em células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e humano células de carcinoma embrionárias em 2004. Desde então, vários estudos sobre a família miRNA-302 têm-se centrado sobre o seu papel potencial na reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas, bem como auto-renovação embrionária [7]. Vários fatores de transcrição que são expressas no início do desenvolvimento de células-tronco do câncer e manutenção, tais como
Oct4
,
Sox2
, e
Nanog
, foram encontrados essencial para a regulação da transcrição de a família miARN-302 [8]. Curiosamente, Fareh et ai. demonstraram que a expressão estável de miRNA-302 foi capaz de induzir perda de
Oct4
,
Sox2
, e
Nanog
[9]. O papel do miRNA-302 na tumorigénese foi debatida recentemente, como conclusões conflitantes foram elaboradas por diferentes grupos de pesquisa. Por exemplo, endógena miARN-302 não foi detectada em células de cancro do colo do útero, e a expressão ectópica de miARN-302 inibiu a proliferação celular e a formação de tumor [10]. Em contraste, a transfecção de miARN-302B em células de cancro do cólon resultou num aumento da stemness de CD133 + células HT 29
In vitro
[11]. No entanto, até à data, não tenham sido realizados estudos para investigar o possível papel do miRNA-302 em pacientes com câncer de cólon e /ou na patogénese do cancro do cólon em modelos de xenotransplante, que foi o principal objetivo do estudo atual.
materiais e Métodos
as amostras dos pacientes
tecido de câncer de cólon e de tecido do cólon benigna foram obtidos a partir do banco de tecidos no Hospital Geral do Exército Popular de Libertação. características clinicopatológicas destes pacientes foram recuperados a partir da base de dados Departamento de Oncologia. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board Research no Hospital Geral do Exército Popular de Libertação e consentimentos foram obtidos de todos os participantes do estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsínquia e políticas relevantes na China.
cultura celular
linhas de células cancerígenas do cólon humano, HCT8 e HCT116 e células 293T de rim embrionárias humanas ( HEK293T) foram adquiridos a partir de Xangai Bioleaf Biotech Co. (Shanghai, China), Ltd.. HCT8, HCT116, e HEK293T células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%. As células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO
2.
ARN, extracção miARN, e quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase
O ARN total foi isolado a partir de células cultivadas e tumoral tecidos, utilizando o reagente Trizol. O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado utilizando o ADNc RevertAid First Strand síntese Kit (Life Technology, Carlsbad, CA), que foi então usada para real-time polymerase chain reaction (PCR), em conjunto com iniciadores directos e inversos e a potência SYBR Green PCR master Misturar. β-actina foi utilizada como um controlo interno para a
AKT
níveis de transcrição. As sequências dos iniciadores utilizados foram os seguintes:
AKT
-forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, inverta: GTCCATGGTGTTCCTACCCA; β-actina-forward: ACCGAGCGCGGCTACAG, inverta: CTTAATGTCACGCACGATTTCC. De acordo com as instruções do fabricante, miARN a partir de tecidos e células foi extraído utilizando o kit de isolamento de miRvana miARN (Life Technology, Carlsbad, CA), e os níveis de miARN-302a expressão foram detectados por ensaios de TaqMan de miARN (Life Technology, Carlsbad, CA) , usando RNA nuclear pequeno U6 como um controlo interno.
construção Vector, a produção de lentivírus, e estável transfecção
a sequência de HSA-miRNA-302a madura foi sintetizado e introduzido no vector PLKO.3G para produzir PLKO.3G-miR-302a. O repórter vector luciferase-3 não traduzida ‘(UTR) foi gerado através de subclonagem do
AKT
3’UTR, que carrega um sítio de ligação miRNA-302a putativa em MT01 vetor. Todos os vectores construídos foram verificadas por sequenciação. PLKO.3G-miR-302a e misturado com psPAX2 PMD2-G foi transfectado em células HEK293T reagente utilizando Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Quarenta e oito horas mais tarde, lentivírus foi colhido e utilizado para infectar células HCT8 e HCT116. Em seguida, as células foram separadas por citometria de fluxo (Coulter Beckman, Brea, CA) para estabelecer linhas celulares estáveis que expressam constitutivamente miARN-302a (células HCT8-302a e HCT116-302a).
Os ensaios de luciferase
Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lisadas com 50 ul de tampão de lise passiva. Em seguida, um ensaio de luciferase dupla foi realizada tal como indicado pelo fabricante (Promega, Madison, WI). A proporção de pirilampo para Renilla actividade de luciferase foi usado para expressar as actividades da luciferase. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. Os dados são representados como média ± desvio padrão (SD).
Proteína colheita e Western Blot
As proteínas totais foram colhidas usando o kit de extração CelLytic (Roche, Basileia, Suiça) contendo inibidores de protease e, em seguida quantificada utilizando o kit BCA Protein Assay Reagent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Depois de separar as proteínas utilizando electroforese em gel de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida, a proteína foi transferida para membranas de fluoreto de polivinilideno e, em seguida, bloqueadas em leite isento de gordura a 5%. Utilizando os anticorpos primários e anti-coelho ligado a peroxidase de rábano (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) como o anticorpo secundário, as proteínas alvo foram sondados e então visualizadas utilizando o Plus Ocidental Blotting sistema ECL (Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA). As manchas foram retirados e sondadas com anticorpo-α β-actina para confirmar carga equivalente. Os anticorpos primários incluíram o seguinte: AKT (1:1000), GSK3β (1:500), ciclina D1 (1:1000), PI3K (1:1000), PTEN (1:500) (Cell Signaling Technology, Boston, MA ) e β-actina (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX).
ensaios
proliferação de células e ciclo celular
proliferação de células Os ensaios de CCK-8 e edu foram realizados para detectar . Resumidamente, CCK-8 ensaios foram realizados como se segue: As células foram semeadas numa placa de 96 poços a uma concentração de 1 × 10
4 células /poço. Após a adesão, as células foram cultivadas em meio fresco misturado com CCK-8 (10:01) (Dojindo, Xangai, China) durante 2 horas, antes de a absorvância foi medida com um leitor de microplacas a 450 nm. Para os ensaios de edu, as células foram incubadas em solução EdU (1:5000) durante 2 horas, em seguida foram colhidas e coradas utilizando o Cell-Luz EdU 643 Apollo in vitro Citometria de Fluxo Kit (Ribobio, Cantão, China), de acordo com as instruções do fabricante . As células foram depois analisadas por citometria de fluxo
Um ensaio de ciclo celular foi também realizada utilizando a citometria de fluxo:. Resumidamente, as células foram fixadas com etanol frio a 75% durante a noite, e, em seguida, lavou-se com solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, o iodeto de propídio (50 ug /mL) foi adicionada às células para coloração de ADN antes de análise de citometria de fluxo.
Colónia ensaio de formação de
células isoladas foram inoculadas em placas de 60 mm a uma concentração de 500 células /poço e depois incubados em 5% de CO
2 a 37 ° C. Vinte dias mais tarde, as células foram coradas com violeta de cristal a 0,5% durante 30 minutos. número de colónias em cada placa foram contadas usando um microscópio invertido.
em
tumorigenicidade
As células HCT8 PLKO.3G-SCR-transfectadas (células in vivo HCT-8-Scr ) e células HCT116-302a foram injectadas subcutaneamente em cada flanco posterior do mesmo ratinho nu macho 4-6 semanas de idade. O volume do tumor foi calculado e o peso do tumor foi medido após o sacrifício no dia 40. Os tumores foram, em seguida, dividido em duas partes, cada parte fixada com formalina a 10% ou conservados em -80 ° C. Os experimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética em Estudos Animais do Hospital Geral do Exército de Libertação Popular.
Imunohistoquímica
A imuno-histoquímica (IHQ) coloração de espécimes embebidos em parafina foi realizada como descrito anteriormente [12]. Resumidamente, de coelho anti-AKT e anticorpo anti-murganho /coelho de peroxidase de rábano-anticorpo marcado (Santa Cruz Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) foram utilizados como o primário e o segundo anticorpo, respectivamente.
Estatística analisa
a diferença entre as variáveis contínuas foi analisada utilizando t-teste ou análise de variância de Student. Frente e verso P-valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS versão 20.0 (IBM Corporation, NY).
Resultados
expressão miRNA-302a é suprimida em tecidos de câncer de cólon
tecidos de câncer de cólon foram adquiridos de um total de 44 pacientes do sexo masculino com idade média de 67 anos (variando de 49 a 77 anos) com diagnóstico recente, o cancro do cólon patologicamente confirmada. Todos os pacientes tinham recebido a ressecção cirúrgica. tecidos de cólon normais patologicamente confirmados foram adquiridos a partir de 10 pacientes do sexo masculino com cancro da bexiga que tinham recebido cistectomia radical.
Detectamos níveis de expressão de miRNA-302A em 44 tecidos do cólon e 10 tecidos de cólon normais e descobriram que, em comparação com cólon normal, tecidos, tecidos de cancro do cólon expressaram níveis mais baixos de miARN-302a (Fig. 1A). Além disso, foi analisada a relação entre os níveis de miRNA-302A e características clínico-patológicas em pacientes com câncer de cólon. Não houve associação significativa observada entre os níveis de miRNA-302A e idade ou estágio clínico (dados não mostrados).
expressão (A) miRNA-302a foi reprimidos no tecido do cancro do cólon em comparação com o tecido do cólon normal. (B) Os baixos níveis de expressão miRNA-302a foram detectadas em quatro linhas de células cancerígenas do cólon humano, HCT8, HCT116, HT29, e CaCO2. (C) Os níveis elevados de expressão de miARN-302a foram detectados em HCT8 e células cancerígenas do cólon HCT116 que expressam estavelmente miARN-302a (* P 0,05)
A sobre-expressão de miARN-302a inibe o crescimento celular do cancro do cólon. in vitro e in vivo
Para investigar a função de miRNA-302a no câncer de cólon, medimos a expressão de miRNA-302a em quatro linhas celulares de cancro do cólon humano (HCT8, HCT116, HT29, e Caco2) por quantitativa PCR em tempo real. Como mostrado na Fig. 1B, houve baixa expressão de miARN-302a em todas as quatro linhas celulares. Porque especulamos que a sobre-expressão de miARN-302a pode inibir o crescimento celular do cancro do cólon, que sobre-expresso de forma estável miARN-302a em células HCT8 e HCT116 (denominado como HCT8-302a e células HCT116-302a), que foi confirmado por transcriptase reversa quantitativa (qRT )-PCR (Fig. 1C).
Os CCK-8, edu, e ensaios de formação de colónias foram realizados para examinar se miRNA-302a superexpressão afetados proliferação de células do cancro do cólon
in vitro
. Como mostrado na Fig. 2, houve um número significativamente menor (P 0,05) taxa de crescimento em células HCT116-302a HCT8-302a e comparados com os controlos. As análises de citometria de fluxo indicou que a percentagem de células EDU-positivos em ambas as células e HCT8-302a HCT116-302a foram menores do que nos controlos. Além disso, em comparação com os controles, tanto as células HCT8-302a e HCT116-302a desenvolveram menos colónias no dia 20 e 15 dias, respectivamente. Por conseguinte,
In vitro
experiências demonstraram que miARN-302a exercido um papel supressivo na proliferação de células do cancro do cólon.
ensaio CCK-8 foi realizada para medir a proliferação em (A) HCT8 e (B) células HCT116. Os dados representam a média ± desvio-padrão do valor de densidade óptica (DO) a 450 nm, detectada a partir de três experiências independentes. A proliferação celular foi detectado em (C) e HCT8 células HCT116 (D) utilizando o ensaio de EdU analisadas por citometria de fluxo. (E, F) ensaios de formação de colónias indicou menos colónias em miARN-302a superexpressando HCT8 células. (* P 0,05).
Para validar ainda mais nossas observações
in vivo
, as células HCT8 SCR e células HCT8-302a foram injectados no flanco esquerdo e posterior direito de nu camundongos, respectivamente. Os volumes dos tumores foram medidos utilizando compassos de calibre em diferentes pontos de tempo após a inoculação, e os pesos dos tumores foram medidos após o sacrifício. Tanto o volume e massa eram notavelmente mais baixa do que em tumores HCT8-302a em tumores HCT8-Scr (P 0,05; Fig. 3). Tomados em conjunto, inibição da proliferação celular óbvio foi observada após a sobre-expressão de miARN-302a em células de cancro do cólon.
Células
HCT8-GFP e células HCT8-302a foram injectados no flanco esquerdo e posterior direito de ratinhos nus, respectivamente ( A, B). O volume de tumor (C) e de massa (D) no grupo HCT8-302a foram notavelmente mais baixa do que no grupo HCT8-GFP. (* P 0,05).
A superexpressão de miRNA-302a induz a paragem do ciclo celular em células de câncer de cólon
Agora que a inibição do crescimento foi observado em células cancerígenas do cólon, foi realizada ciclo celular análise para investigar se a sobre-expressão de miARN-302a resultou em alterações no ciclo celular. Como mostrado na Fig. 4, a proporção de células em fase G1-aumentou notavelmente em células HCT8-302a, enquanto a proporção de células na fase S foram notavelmente menos do que no controlo. Resultados análogos foram observados em células HCT16-302a, sugerindo que miARN-302a induzir eficazmente /s paragem do ciclo celular G1 em células de cancro do cólon
.
A percentagem de células em fase G1-aumentou significativamente em células HCT8-302a ( a, C) e as células HCT116-302a (B, D) em comparação com os controlos, enquanto que a proporção de células na fase S foram notavelmente menos do que os controlos. (* P 0,05).
miRNA-302a suprime a expressão AKT, visando directamente a sua 3’UTR
Para detectar os mecanismos moleculares pelos quais miRNA-302a exerce suas funções de regulação pós-transcricional , utilizou-se de bioinformática algoritmos (https://www.targetscan.org) para procurar possíveis genes-alvo, e descobriu que a 3’UTR do
AKT
mRNA abriga um sítio de ligação conservado para miRNA-302a. Em seguida, examinámos a expressão de AKT no ARNm e o nível de proteína em células HCT8-302a e HCT116-302a e controlos. Como mostrado na Fig. 5A e 6, em comparação com os controles, expressões AKT diminuiu significativamente em células HCT8-302a e HCT116-302a, tanto a nível da proteína mRNA e. Além disso, a expressão de AKT em tumores HCT8-302a foi significativamente menor do que em tumores HCT8-Scr, tal como determinado por PCR em tempo real e coloração IHC (Fig. 5B e C). Estes resultados sugerem que a expressão AKT é regulada negativamente por miRNA-302a no câncer de cólon.
AKT
expressão de mRNA foi notavelmente suprimida em células (A) HCT8-302a e HCT116-302a, e (B tumores HCT8-302a). (C) A imuno-histoquímica coloração indicou menor expressão de AKT em tumores HCT8-302a. (D) a actividade de luciferase relativa foi notavelmente suprimida na região não traduzida de tipo selvagem AKT-3 ‘(UTR) células transfectadas. (E) Representação esquemática do repórter de luciferase, o qual realizado a de tipo selvagem ou mutante
AKT
-3 ‘UTR. (* P 0,05).
análises de Western blot níveis mostraram AKT reprimidos e ciclina D1 e regulada níveis GSK3β em células HCT8 miRNA-302a superexpressão. níveis de PTEN e PI3K não foram afetados.
Para testar se regula miRNA-302A
AKT
pela directamente vinculativa para a sua 3’UTR, um vector repórter luciferase contendo o humano
AKT
3’UTR que carregava o tipo selvagem sequência de ligação ao miRNA-302a foi sub clonado. Um vector transportando luciferase mutante da região de 7 pb complementar à região 5 ‘de semente de miARN-302a foi gerado como o repórter de controlo (Fig. 5E). Em comparação com o controlo, a actividade de luciferase relativa foi suprimido em 36% (P 0,05) no tipo selvagem
AKT
3’UTR células transfectadas (Fig 5D.). Portanto, miRNA-302a inibe células cancerígenas do cólon através de segmentação diretamente
AKT
.
miRNA-302A induzida alterações do ciclo celular em células cancerígenas do cólon através da inibição da AKT-GSK3β-ciclina D1 via
Para avaliar ainda o efeito de miARN-302a sobre a via de sinalização de AKT, foi detectada a expressão de montante (PI3K e PTEN) e a jusante (GSK3β e ciclina D1) efectores Akt por western blot. Em comparação com as células de controlo correspondentes, níveis GSK3β foram notavelmente elevada, enquanto que a ciclina D1 foi notavelmente reduzido em miARN-302A células transfectadas HCT8 andHCT116. No entanto, a expressão de dois principais efectores a montante de AKT, PI3K e PTEN, não foram influenciados pela miARN-transfecção 302a (Fig. 6). Dado o papel essencial da via de sinalização D1 AKT-GSK3β-ciclina na transição do ciclo celular, os nossos resultados sugerem que miARN-302a pode induzir /S paragem do ciclo celular G1 em células de cancro de cólon por inibição da via D1 AKT-GSK3β-ciclina, assim suprimindo a proliferação de células de câncer de cólon.
Discussão
neste estudo, observou-se que miRNA-302a foi regulada negativamente em tecidos de cancro do cólon. Superexpressão de G1 induzida miRNA-302a /prisão S em células de câncer de cólon, e proliferação de células de câncer de cólon notavelmente suprimida
in vitro
e
in vivo
. Além disso,
AKT
foi revelado como um gene alvo direto e funcional do miRNA-302a.
Durante a última década, a maioria das pesquisas envolvendo miRNA-302 tem incidido sobre o seu papel na hESCs, que são caracteriza-se por auto-renovação e pluripotência. Estudos que analisam miRNA-302 função na carcinogênese são limitados e inconsistentes. Lin et ai. descobriram que miARN-302 poderia inibir a tumorigenicidade e induzir a apoptose em células MCF-7 de cancro da mama humano, células Tera-2 teratocarcinoma embrionário, células HepG2 e de carcinoma hepatocelular [13]. Da mesma forma, a proliferação celular foi suprimida em células de cancro do colo do útero HeLa e SiHa, bem como carcinoma hepatocelular células SMMC-7721, através da regulação do ciclo celular [10], [14]. No entanto, Zhu et ai. observou-se um fenómeno inverso em células de câncer de cólon, onde a sobre-expressão de miRNA-302b levaram a capacidade de formação de colónia reforçada
in vitro
[11]. A capacidade formação de colónias aumentada também foi validado em células-tronco do câncer de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas [15]. Pela primeira vez, nós revelamos suprimida a expressão miRNA-302a em tecidos de câncer de cólon em comparação com os tecidos do cólon normais. Por isso, especula-se que o miRNA-302a pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento do câncer de cólon e progressão.
Em nosso estudo, foi observado um efeito inibidor de miRNA-302a sobre a proliferação celular em células HCT8 câncer e HCT116 do cólon, através dificultando a transição G1 para a fase S, que é considerada como um evento chave durante a proliferação celular. De acordo com estudos anteriores [8], [10], [14], também encontramos notável infra-regulação da ciclina D1 em miRNA-302a superexpressão células cancerígenas do cólon. Curiosamente, miARN-302 está previsto para segmentar muitos reguladores do ciclo celular. Por exemplo, Lin et ai. demonstraram que miARN-302 simultaneamente suprimida tanto a ciclina D CDK4-ciclina /6 vias de sinalização [13] E-CDK2 e, e este bloqueio alvo foi regulada por vários factores de transcrição, tais como Oct4 e Sox28. No entanto, Card et ai. relataram que miARN-302a promoveu um aumento na fase S e uma diminuição na fase G1 em hESCs, embora ciclina D1 também foi reprimida [8]. Claramente, mais pesquisa elucidar os mecanismos exatos de miRNA-302 função é garantido.
As nossas observações de que a sobre-expressão de miRNA-302a em células cancerígenas do cólon induzida inibição do crescimento celular
in vitro
e
in vivo sugerem que miARN-302a pode pós-transcricionalmente regular um gene essencial que está envolvida na proliferação celular. Como um oncogene importante,
AKT
influencia uma grande variedade de funções fisiológicas, incluindo o metabolismo, proliferação, sobrevivência, angiogénese, migração e invasão [16]. Os nossos resultados indicam que miARN-302a suprimiu a proliferação e a tumorigenicidade de células cancerígenas do cólon através da via D1 AKT-GSK3β de ciclina, e por ligação directa a 3 ‘UTR de
AKT
. Além disso, a expressão da PI3K e PTEN, que são os principais efectores a montante de AKT e também comprovada importante no desenvolvimento do câncer de cólon, não foram afetados pelo miRNA-302. O papel regulador de miARN-302 em AKT foi também demonstrada por Cai et al: depois de miARN-302s transfecção em células de cancro do colo do útero, que observaram uma expressão elevada de inibidores de cinase p27Kip1 dependentes de ciclina e p21Cip1, juntamente com os níveis de AKT downregulated [10]. Assim, como um alvo de miRNA-302,
AKT
foi notavelmente suprimida e evocou alterações em muitas vias de sinalização a jusante.
Nossos resultados também dar certas pistas que diz respeito ao tratamento de câncer miRNAs-alvo. Estudos anteriores revelaram que alguns miRNAs específicos foram muitas vezes sobre-expressos em tumores, enquanto a maioria dos miRNAs foram.
reprimidos [17], [18]. supressão global miRNA foi encontrado para aumentar a carcinogênese em ambos os
in vitro Comprar e
in vivo
modelos [19], destacando os efeitos pró tumorigênicos seguinte miRNA perda de função. Liang et ai. observado um papel sensibilizador de terapia de substituição de miARN-302 em células de cancro da mama à radiação ionizante [20]. Outro estudo recente relatou que a entrega viral de deixar-7 miARN pode inibir o crescimento do tumor em um modelo de rato de adenocarcinoma pulmonar [21]. Da mesma forma, os nossos resultados validado o efeito inibidor da substituição de miARN-302a em células cancerígenas do cólon. Tomados em conjunto, estes estudos sugerem que a superexpressão de até mesmo um único miRNA em células cancerosas pode conferir benefício terapêutico substancial.
Em resumo, nosso estudo demonstra que miRNA-302a é fundamental para o crescimento de células de câncer de cólon, regulando G1-S transição de fase. expressão miRNA-302a é suprimida em tecidos de câncer de cólon. Além disso, através de ligação directa com a sua, inibe miRNA-302A
expressão 3’UTR AKT
, resultando em alterações posteriores nas vias D1 AKT-GSK3β de ciclina. Embora seja claro que miRNA-302a participa de cancro do cólon, mais estudos são necessários para explicar os mecanismos precisos subjacentes ao seu papel na progressão do câncer de cólon, e, assim, determinar o seu valor potencial como um biomarcador e /ou um alvo terapêutico.