Abstract

efeito Warburg, uma das marcas para as células cancerosas, é caracterizada por interruptor metabólica da fosforilação oxidativa mitocondrial para glicólise aeróbica. Nos últimos anos, aumentou o nível de piruvato-quinase M2 (PKM2) expressão foi encontrado para ser o culpado de glicólise aeróbica melhorada em células cancerosas. No entanto, não existe qualquer agente de inibição de glicólise aeróbica por segmentação PKM2. Neste estudo, verificou-se que o ácido oleanólico (OA) induziu uma mudança de PKM2 para PKM1, e de forma consistente, revogada efeito Warburg em células cancerosas. Supressão da glicólise aeróbica pela OA é mediada pelo interruptor PKM2 /PKM1. Além disso, a sinalização mTOR foi encontrado para ser inactivada em células cancerosas tratadas com OA, e inibição de mTOR é necessário para o efeito do OA interruptor de ligar /PKM1 PKM2. Diminuição da expressão de hnRNPA1 c-Myc-dependente e hnRNPA1 foi responsável pela mudança induzida pela OA entre as isoformas PKM. Coletivamente, nós identificamos que a OA é um composto anti-tumoral que suprime glicólise aeróbica em células cancerosas e há potencial que PKM2 pode ser desenvolvido como um alvo importante na via glicólise aeróbica para o desenvolvimento de novos agentes anticancerígenos

Citation:. Liu J , Wu N, Ma L, Liu H, Liu G, Zhang Y, et al. (2014) oleanolic Ácido Suprime aeróbico A glicólise em células cancerosas, alternando piruvatoquinase tipo M isoformas. PLoS ONE 9 (3): e91606. doi: 10.1371 /journal.pone.0091606

editor: Ming Tan, University of South Alabama, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de novembro de 2013; Aceito: 12 de fevereiro de 2014; Publicação: 13 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por projetos de desenvolvimento de medicamentos inovadores nacionais de (2014ZX-09102043-001). O estudo também foi apoiado em parte pela Fundação Nacional de Natural Sci. da China (81302906, 81273550 e 41306157; https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

glicólise aeróbica, também conhecido como efeito Warburg, foi estabelecido como uma característica das células cancerosas [1]. Quase todos os tipos de células cancerosas alterar o seu metabolismo, aumentando a glicólise e a supressão da fosforilação oxidativa mitocondrial, mesmo sob condições de normóxia (portanto, definidos como glicólise aeróbica) [2]. Muitos intermediários glicolíticas são indispensáveis ​​para a síntese de moléculas que são essenciais para as estruturas e as funções celulares, tais como nucleótidos, aminoácidos e lípidos. Assim, altamente proliferam células cancerosas satisfazer as suas necessidades para materiais de construção celulares mudando seu metabolismo da fosforilação oxidativa a glicólise, embora a produção de ATP é menos eficiente no processo glicolítico.

PKM

gene codifica duas proteínas quinases, PKM1 e PKM2, e estas quinases também são responsáveis ​​pela conversão de fosfoenolpiruvato (PEP) de piruvato, que pode ser usado para a produção de ácido láctico ou enterring fosforilação oxidativa mitocondrial. PKM1 e PKM2 são geradas por splicing de ARNm exclusivo (exão 9 para PKM1 e exão 10 para PKM2) [3]. https://en.wikipedia.org/wiki/PKM2 – cite_note-Corcoran-5PKM1 é cataliticamente mais ativo do que PKM2. PKM2 é expressa em todas as células com uma elevada taxa de síntese de ácidos nucleicos [4]. As células cancerosas utilizar PKM2 a acumular-se os intermediários para a síntese de ácido nucleico e de proteína e manter a glicólise aeróbica [5]. O aumento da actividade PKM2 ou interrupção do splicing do mRNA PKM2 para PKM1 é capaz de suprimir o efeito Warburg, e, consequentemente, o crescimento do tumor compromisso [6]. Portanto, acredita-se PKM2 um alvo promissor no campo da terapia do cancro. No entanto, os compostos que podem aumentar a proporção de PKM1 para PKM2 não foram encontrados.

ácidos oleanólico (OA) é amplamente distribuída em muitas plantas, e tem sido bem documentado que a OA exibe actividade anti-tumoral de uma gama de células de cancro humano. estudo anterior no nosso laboratório mostrou que o tratamento de células cancerosas humanas do pâncreas pan-28 que conduz à apoptose via mitocondrial mediada via apoptótica [7]. Outro estudo também revela que a OA pode inibir metástase em células de glioma [8]. No entanto, o alvo da OA não tem sido bem identificados. No presente estudo, verificou-se que a OA pode suprimir a glicólise aeróbica, suprimindo a expressão PKM2 e afetou

PKM

mRNA splicing através da mTOR /c-Myc sinalização /RNPhn.

Métodos e Materiais

Cultura celular e compostos químicos

linha de células de carcinoma da próstata humano, PC-3, e a linha celular do cancro da mama humano, MCF-7, foram adquiridos da American Type Culture Colecção C (ATCC). As células de PC-3 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS; GIBCO-BRL) a 37 ° C e sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO

2 condição. As células MCF-7 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).

ácido oleanólico (OA) foi adquirido a partir de Sigma Aldrich (O5504, St. Louis, MO). OA foi preparada em DMSO a uma concentração de 10 mg /ml como solução de reserva.

transfecção celular

Os plasmídeos, incluindo pWZL Neo Myr bandeira PKM2 e pMXs-hcMYC foram obtidos a partir de Addgene (Cambridge, MA). Bandeira pcDNA GFP (Flag-GFP) foi preservada em nosso laboratório e foi usado como controle. transfecção de células foi feita utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, PC-3 ou células MCF-7 foram plaqueadas numa placa de 96 poços. Quando as células são cultivadas a cerca de 85% de confluência, o meio foi substituído com meio OPTI-MEM. Em seguida, 3 ug plasmídeos e 30 ul de reagente de lipofectamina foi misturada num tubo contendo 1,500 ul OPTI-MEM com vórtex vigoroso. Após incubação durante 15 min, a mistura foi adicionada às culturas de células e incubou-se durante determinados momentos.

Immunoblotting Assays

As células foram colhidas por centrifugação a 1000 g durante 10 min e lisadas com M- PER proteínas de mamíferos Reagente de Extracção (Thermo Scientific, IL). As concentrações de proteína foram determinadas utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, FL). A proteína total foi separada por electroforese com gel de poliacrilamida a 10-12% e transferidas para membranas de nitrocelulose de 0,45 um. As membranas foram incubadas em solução (PBS, 0,1% de Tween-20, e 5% de leite em pó desnatado em pó) de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente, e, em seguida, incubadas com anticorpos primários (1:1000). Após incubação durante a noite, as membranas foram lavadas com PBS contendo 0,1% de Tween-20 por três vezes, e, em seguida, foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (IgG de cabra anti-coelho ou anti-ratinho; 1:2000; Bio-Rad , CA) durante 1 h à temperatura ambiente. As bandas de proteína foram visualizadas com SuperSignal Oeste Dura prolongado Substrato Duração (Thermo Scientific, IL). A intensidade das manchas foram quantificadas utilizando o software ImageJ

os anticorpos primários utilizados no nosso estudo foram como se segue:. PKM1 (# 7067, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), PKM2 (# 4053, Cell Signaling Technology , Danvers, MA), β-tubulina (# 2146, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfo-mTOR (Ser2448) (# 2971, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); mTOR (# 2983, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); c-Myc, (SC-40, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas); RNPhn A1 (# 8443, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); hnRNP A2 (# 9304, Cell Signaling Technology, Danvers, MA).

Análise por imunofluorescência

PC-3 e as células MCF-7 (5 x 10

4 /poço) foram plaqueadas em placas de 24 poços, e, em seguida, foi adicionado a OA (100 ug /ml). Após 6 horas de incubação, as células foram fixadas com 4% Polioximetileno durante 0,5 h, seguido de incubação com anticorpo PKM2 (1:1000) durante 2 h. Adicionou-se o anticorpo secundário correspondente e incubou-se durante mais 1 h para visualizar PKM2. 4 ‘, 6’-diamidino-2-fenilindole (DAPI) foi utilizado para corar os núcleos. A fluorescência foi detectada sob um microscópio confocal (CLS-2SS, Thorlabs).

metabólicas Ensaios

Os ensaios de O

2 conteúdo, atividade piruvato quinase (PK), a captação de glicose, lactato produção e respiração celular foram utilizados para estudar as mudanças no interruptor metabólica nas células cancerosas tratadas com OA. A piruvato-cinase (PK) Kit de Ensaio (ab83432, Abcam) e OX-500 O

2 Microsensor (Unisense, Dinamarca) foram utilizados para determinar a actividade de PK e O

2 teor de, respectivamente, no PC-3 e MCF -7 de células tratadas com OA, seguindo as instruções do fabricante

.

Para medir a captação de glicose, PC-3 e MCF-7 foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

3 células /cavidade em placas de 96 placas de poços. Após incubação durante a noite, as células foram transfectadas com plasmídeos ou certos tratada com MHY1485. Em seguida, as células foram tratadas com 50 ou 100 ug /ml de OA, respectivamente. Após incubação durante 6 ou 12 horas, os meios de cultura foram colhidas por centrifugação a 3000 g durante 15 min. A quantidade de consumo de glucose das células tumorais testadas foi detectada utilizando Glucose Uptake Colorimetric Assay Kit I (# K676, BioVision, Milpitas, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A densidade de absorção (OD) a 412 nm foi lida utilizando um leitor de microplacas BioRad680 (Bio-Rad, Hercules, CA).

A produção de ácido láctico foi determinada usando Colorimetria Lactato Assay Kit II (# K627, BioVision , Milpitas, CA) como os protocolos do fabricante. Resumidamente, PC-3 e células MCF-7 foram tratados com a bandeira pWZL Neo Myr PKM2, pMXs-hcMYC e bandeira pcDNA GFP durante 72 h ou MHY1485 durante 1 hora, respectivamente. OA foi adicionado às concentrações indicadas e incubaram-se durante os tempos indicados. Em seguida, os meios de cultura foram colhidas por centrifugação a 3000 g durante 15 min, misturou-se com 45 ul de tampão de ensaio de lactato. A absorvância a 450 nm foi lida utilizando um leitor de microplacas BioRad680 (Bio-Rad, Hercules, CA).

O consumo de oxigénio foi examinada utilizando Consumo de Oxigénio Classificação Assay Kit (# 600800, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI), seguindo as instruções do fabricante. VICTOR X3 Multilabel Leitor de placas (Perkin Elmer) foi utilizado para detectar o valor de DO a 650 nm. A taxa de consumo de oxigénio foi mostrado como tempo de vida em função do tempo (uS /hr).

Ensaio de formação de colónias

PC-3 ou células MCF-7 foram plaqueadas numa placa de 6 poços, e foram transfectadas com plasmídeos, incluindo pWZL Neo Myr Bandeira PKM2 e bandeira pcDNA GFP. Após incubação durante determinadas horas, as células foram tripsinizadas, suspensas em DMEM contendo FBS a 10%, plaqueadas sobre uma camada inferior contendo 0,6% de agar e coberto com uma camada superior contendo 0,6% de agar. As células foram cultivadas numa placa de 6 poços e o meio foi mudado semanalmente. Após incubação durante 10 dias, foi adicionado violeta de cristal e o número de colónias foi contado e analisados ​​com o software ImageJ.

Análise estatística

As experiências, excepto os ensaios de imunotransferência foram realizadas pelo menos três vezes. Todos os valores foram expressos como média ± DP e comparados num dado ponto de tempo por desemparelhado, o teste t de duas caudas. Os dados foram considerados estatisticamente significativos quando p 0,05 (*) e p . 0.01 (**)

Resultados

OA Inibe aeróbico A glicólise em células cancerosas

Aerobic glicólise é caracterizada pelo aumento da absorção de glucose e produção de lactato, e o consumo de oxigénio comprometida em células cancerosas com elevada disponibilidade de oxigénio. Portanto, medimos o efeito do OA sobre estas actividades de células de cancro. consumo de glucose reduzida foi encontrado em vários tipos de células cancerosas quando a OA foi adicionado às culturas (Fig. 1a). A produção de ácido láctico nestes células cancerosas também foi encontrado para ser reduzida nas células tratadas com OA (Fig. 1B). Além disso, a OA melhorada do consumo de oxigénio nas células de cancro (Fig. 1C). Os dados acima mostram que a OA foi capaz de induzir a alteração metabólica das células cancerosas através da supressão de glicólise aeróbica.

consumo de glucose (A), a produção de ácido láctico (B) e o consumo de oxigénio (C) foram avaliadas em PC- 3 e células MCF-7 tratadas com 50 ou 100 ug /ml de OA para 6 ou 12 horas, respectivamente. Os detalhes da metodologia foram descritos na secção de Materiais e Métodos. A proporção de cada grupo de controlo foi apresentado aqui. As barras mostram os valores médios de três experimentos independentes (média ± SD). *, P 0,05; **, P . 0,01

Além disso, nós comparamos O

2 de conteúdo em células cancerosas com ou sem tratamento OA. Os dados mostraram que a OA não tem influência sobre a concentração de oxigênio na cultura de células, excluindo assim a possibilidade de que a OA levam a alteração metabólica, afetando as condições normic (Figura S1).

OA Induz a mudança de PKM2 para PKM1 e aumentar PK actividade em células cancerosas

piruvato cinase muscular isozima 2 (PKM2), cuja actividade enzimática é menos activo do que PKM1, é responsável para a conversão de piruvato em phosphopyruvate no processo glicolítica. PKM2, especialmente na sua forma dimérica, intermediários e acumula-os canais glicolíticas para a biossíntese de ácidos de nucleótidos e de aminoácidos, contribuindo assim para o crescimento das células. PKM2 foi encontrado para ser altamente expressa em todas as células que proliferam, tais como células tumorais [4]. Para identificar os mecanismos que a OA afetadas glicólise aeróbica, que posteriormente avaliadas as alterações no nível de expressão de PKM1 e PKM2 em células cancerosas tratadas com OA. A análise de imunotransferência mostrou que a OA foi capaz de diminuir abundância PKM2, e aumentar a expressão PKM1, em ambas as linhas de células PC-3 e MCF-7cancer, numa dose e forma dependente do tempo (Fig. 2A e 2B). A redução na expressão PKM2 também foi encontrada nas experiências de coloração imunofluorescente. O tratamento de células cancerosas com OA regulada negativamente a expressão PKM2 significativamente em ambos os PC-3 e células MCF-7 (Fig. 2C). Além disso, a actividade de PK foi demonstrado ser elevados em células cancerosas tratadas com OA, juntamente com o interruptor de PKM2 para PKM1 (Figura S2A e S2B).

nível PKM1 e expressão PKM2 foi avaliada por imunotransf erência em ensaios de PC- 3 e células MCF-7 tratadas com 10, 25, 50100 ug /ml, respectivamente OA, durante 12 h (a) ou 100 ug /ml de OA durante 0,5, 1, 2, 3, 6, 12 h, respectivamente (B). β-tubulina foi utilizada como referências endógenos. Os níveis PKM2 (verde) (C) foram em PC-3 e MCF-7 de células tratadas com 100 ug /ml de OA durante 12 h, respectivamente, conforme determinado por coloração com immunfluorescent. Os núcleos (azul) foram coradas com DAPI. As imagens foram mesclados mostrado na parte inferior do painel. A intensidade de fluorescência foi quantificada com o software ImageJ. A proporção de cada grupo de controlo foi apresentado aqui. As barras representados os valores médios de 5 experimentos selecionados aleatoriamente.

O aumento da atividade PK Causada por PKM2 Switch /PKM1 Medeia OA Supressão de aeróbico A glicólise

Com base na constatação de que a mudança de PKM2 para PKM1 ocorre em células cancerosas tratadas com OA, que posteriormente investigado o papel da atividade PK increaed na supressão OA de glicólise aeróbica. Células PC-3 foram transfectadas com vector ou PKM2–expressando GFP antes da estimulação OA (Fig. 3A). aumento induzida por OA na actividade de PK foi resgatada por PKM2 sobreexpressão em células PC-3 (Figura S3). Os resultados também mostraram que o consumo de glucose, a produção de lactato, assim como o consumo de oxigénio foram todos restaurados em células que sobre-expressam PKM2 (Fig. 3B, 3C e 3D). Os resultados sugerem que o aumento da actividade de PK devido ao interruptor /PKM1 PKM2 é necessário para o efeito inibitório da OA na glicólise aeróbica em células cancerosas.

células PC-3 tratadas com OA (A) foram transfectadas com pWZL Neo Myr bandeira PKM2 (flag-PKM2) ou vector de controlo (flag-GFP). Os ensaios de imunotransferência foram realizadas para determinar a expressão da proteína PKM2. β-tubulina foi utilizada como referências endógenos. consumo de glucose (B), a produção de ácido láctico (C) e o consumo de oxigénio (D) foram avaliadas em células tratadas com 100 ug /ml de OA durante 12 h PC-3. Os detalhes da metodologia foi descrito na secção de Materiais e Métodos. A proporção de cada grupo de controlo foi apresentado aqui. As barras mostram os valores médios de três experimentos independentes (média ± SD). *, P 0,05; **, P . 0,01

OA Supressão de mTOR medeia a alteração no perfil de expressão de PKM isoformas e Metabólica interruptor em células cancerosas

Nós estavam interessados ​​em como induzido OA a diminuir no interruptor de PKM2 para PKM1 em células cancerosas. sinalização mTOR tem sido demonstrada para participar no interruptor de isoformas de PKM em células cancerosas [9]. Portanto, nós detectamos as mudanças no status ativo de mTOR em células cancerosas tratadas com OA. A análise de imunotransferência mostrou que a activação de mTOR foi diminuída quando a OA foi adicionado à cultura de células de cancro (Fig. 4A). Reativando mTOR por MHY1485 células cancerosas protegido de declínio mediada por OA na expressão PKM2 e aumento nos níveis de PKM1 (Fig. 4B). O nosso estudo adicional mostrou que o consumo de glucose, a produção de lactato e a taxa de consumo de oxigénio também são restaurados em células tratadas com MHY1485 (Fig. 4C, 4D e 4E). O resultado revela que mTOR é responsável pela OA induzida o interruptor de isoformas PKM e metabolismo.

(A) Os níveis de mTOR fosforilado foi examinado em células PC-3 e MCF-7 tratadas com 50 ou 100 ug /ml OA para 6 ou 12 horas, respectivamente, como determinado por ensaios de immunoblot. β-tubulina foi utilizada como referências endógenos. (B) Análise de imunotransferência da expressão PKM2 PKM1 e foi realizada em células PC-3 incubadas com OA (100 ug /ml) e /ou um activador de mTOR MHY1485 (2 uM). consumo de glucose (C), a produção de ácido láctico (D) e o consumo de oxigénio (E) foram detectados em células PC-3 tratadas com OA (100 ug /ml) e /ou MHY1485 (2 uM) durante 12 h. A proporção de cada grupo de controlo foi apresentado aqui. As barras mostram os valores médios de três experimentos independentes (média ± SD). *, P 0,05; **, P . 0,01

induzida por OA Repressão mTOR Induz a Chave de PKM isoformas inibindo hnRNPA1 c-Myc-dependente e Expressão hnRNPA2

mTOR tem sido demonstrado para elevar nível PKM2 por estimular a expressão e hnRNPA1 hnRNPA2 c-myc-dependente [9], ambos os quais são responsáveis ​​pela splicing exclusiva de ARNm PKM [3]. A seguir, foi determinada a influência da OA sobre a expressão de hnRNPA1 e hnRNPA2. Os resultados mostraram que a OA podem reduzir o nível de expressão de c-myc, bem como a sua hnRNPA1 gene alvo e expressão hnRNPA2 (Fig. 5A). mTOR activação mediada por MHY1485 foi capaz de restaurar a expressão de c-Myc, hnRNPA1, e hnRNPA2 em células cancerosas tratadas com OA (Fig. 5B). Além disso, a transfecção de células cancerígenas tratadas com OA com plasmídeos que expressam c-Myc revogada o efeito do OA na mudança de PKM1 e expressões PKM2 (Fig. 5C). Os resultados sugerem que a OA pode induzir interruptor PKM2 /PKM1 via c-Myc-dependente hnRNPA1 e via de sinalização hnRNPA2 mTOR.

(A) A expressão de c-Myc, hnRNPA1 e hnRNPA2 foi determinada por análise de imunotransferência no PC células -3 e MCF-7 tratadas com 50 ou 100 ug /ml de OA para 6 ou 12 horas, respectivamente. (B) O expressionof c-myc, expressão e hnRNPA1 hnRNPA2 foi determinada por análise de imunotransferência de células PC-3 tratadas com OA (100 ug /ml) ou /e MHY1485 (2 uM), respectivamente. (C) O nível de c-Myc, hnRNPA1, hnRNPA2, PKM1 e PKM2 foi determinada por ensaios de immunoblot em células PC-3 tratadas com plasmídeos pMXs-hcMYC (Flag-cMyc) na presença ou ausência de OA. β-tubulina foi utilizada como referências endógenos.

Redução aeróbico glicólise explica parcialmente a actividade anti-tumoral da OA

Para abordar a contribuição de glicólise aeróbica prejudicada a actividade supressora de tumores de OA sobre as células cancerosas, detectamos as mudanças no fenótipo maligno das células cancerosas, estimulada pela OA, que ainda submetidos a glicólise aeróbica devido à PKM2 superexpressão. OA foi encontrada para reduzir o crescimento de células PC-3 (Fig. 6A). Além disso, o número de colónias formadas em células PC-3 foi também diminuída no âmbito do tratamento de OA (OA + GFP grupo) (Fig. 6B). No entanto, PKM2 restauração suprimidos significativamente o efeito da OA em células cancerosas, evidenciada pelo aumento na taxa de crescimento e o número de colónias formadas em células PC-3 de co-tratados com OA e os vectores que expressam PKM2 (OA + PKM2 grupo) ( a Fig. 6A e 6B).

(a) as células de PC-3 foram contadas 12, 24, 36 e 48 horas após o tratamento de OA (100 ug /ml) ou /e MHY1485 (2 ^ M) usando hemacytometry. Os valores médios de três experiências independentes são apresentados como média ± DP. **, P 0,01. A figura representativa foi mostrada para cada grupo. (B) As células foram tratadas com OA (100 ug /ml) ou /e MHY1485 (2 pM) durante 10 dias, o número de colónias de células PC-3 foram contadas e analisadas utilizando o software ImageJ. A figura representativa foi mostrada para cada grupo. (C) OA suprime a activação de mTOR em células cancerosas. Este efeito inibitório sobre a sinalização de mTOR, por sua vez, revogada PKM2 expressão de c-Myc /hnRNPA1 /dependente hnRNPA2-. Por conseguinte, a glicólise aeróbica foi inibida em células de cancro tratados com OA.

Em resumo, a OA suprime a activação de mTOR sinalização em células cancerosas. Por sua vez, o efeito inibitório do OA na via mTOR conduz ao interruptor de PKM2 a expressão PKM1, que é mediado por via de c-Myc /hnRNPA1 /hnRNPA2. Eventualmente, glicólise aeróbica foi suprimida em células cancerosas tratadas com OA (Fig. 6C).

Discussão

OA, um composto natural amplamente distribuído nas plantas, tem sido documentada a possuir uma variedade de bioatividades incluindo a propriedade anti-tumoral [10]. Os mecanismos de actividade anti-tumoral da OA envolve a indução de apoptose, a paragem do ciclo celular e inibição de metástases [7], [8]. No entanto, o efeito do OA na via metabólica em células de cancro ainda é incerto. Neste estudo, verificou-se que a OA foi capaz de suprimir o efeito Warburg em células cancerosas, evidenciada pelo aumento do consumo de oxigênio, diminuição da produção de lactato e captação de glicose inferior (Fig. 1A-1C). Para nosso conhecimento, esta é a primeira vez para revelar que a OA afecta o interruptor metabólico das células cancerosas. A nossa descoberta pode contribuir para a compreensão da acção OA em células cancerosas e contribuir para o desenvolvimento de OA e seus derivados com eficácia mais potente para a aplicação clínica.

é acreditado glicólise aeróbica para ser um novo, alvo importante e eficaz na quimioterapia do cancro. evidências crescentes indicam que a glicólise aeróbica desempenha um papel crucial no início e progressão de doenças malignas. Vários compostos têm sido relatados para suprimir o crescimento de células de tumor por acção sobre a glicólise aeróbica [11] – [15]. Para os casos, o extracto de spatholobus suberectus mostrou inibir a actividade de lactato desidrogenase A (LDHA), suprimindo desse modo a glicólise aeróbica em células de cancro da mama [13]. Um composto anti-inflamatório, a curcumina, foi recentemente demonstrado para inverter efeito Warburg causada por estimulação do Factor de Necrose Tumoral (TNF) em células de cancro da mama [14]. Nosso estudo confirmou que a OA também possui atividade inibidora da glicólise aeróbica. O estudo aumenta a compreensão do mecanismo de anti-cancro da OA.

Muitos estudos têm revelado que PKM2 desempenha um papel essencial na glicólise aeróbica em células cancerosas [3]. No presente estudo, verificou-se que a expressão PKM2 pode ser inibida em células tratadas com OA em uma dose e forma dependente do tempo (Fig. 2A-2C). Mais importante ainda, o aumento da actividade de PK, devido ao interruptor /PKM1 PKM2, mediada por efeito de OA na glicólise aeróbica em células de cancro, uma vez que reduzir a actividade de PK por sobre-expressam nível PKM2 em células cancerosas aboliu o interruptor metabólico induzida por OA (Fig. 3A-3D ). OA é, por conseguinte, identificado como o primeiro composto redutor PKM2 abundância, e exerce o seu efeito sobre o metabolismo de células cancerosas através de um novo alvo. Portanto, nós fornecemos evidências iniciais de que a segmentação PKM2 pode ser uma estratégia inovadora para desenvolver agentes de câncer, e OA pode ser um composto de chumbo para o desenvolvimento de drogas anti-câncer alvo PKM2.

activação aberrante de sinalização mTOR está intimamente implicada na uma variedade de cânceres [16]. activação de mTOR promove a resistência das células cancerosas a apoptose induzida por ambas as citoquinas e agentes quimioterapêuticos, acelera a proliferação de uma grande variedade de células cancerosas, e facilita a metástase [16]. A maioria dos inibidores de mTOR actuais suprimir o crescimento de células cancerosas principalmente por indução de apoptose de células e ciclo de captura, ou reduzir a metástase [17] – [19]. Neste estudo, verificou-se que OA reduz o nível de mTOR fosforilado em células de cancro (Fig. 4A) associado com a sua actividade inibidora na glicólise aeróbica expressão. Recentemente, a sinalização mTOR tem sido provado para modular o interruptor metabólico nas células cancerosas e este efeito é mediado pela mudança na expressão PKM2 [14], [20], [21]. Além disso, mTOR /PKM2 via é responsável por, pelo menos, tumorigênese fígado [22]. Estas novas descobertas sugerem que a segmentação do metabolismo pode ser uma nova estratégia de inibidor de mTOR para suprimir o crescimento de cânceres.

Coletivamente, nós provamos evidência de que a OA foi capaz de mudar padrões metabólicos da glicólise aeróbica para fosforilação oxidativa através afetando mTOR /c-Myc via /PKM2 em células cancerosas. Dada a sua baixa toxicidade para os tecidos normais, OA e as suas analoges pode ser um agente candidato promissor para o desenvolvimento de agentes anti-cancerígenos de segmentação metabolismo. Nossos estudos contribuem para um melhor entendimento sobre o mecanismo de propriedade antitumoral da OA, e também o estudo fornece evidência primária que PKM2 pode ser selecionado como um alvo terapêutico importante na via glicólise aeróbica no desenvolvimento de novos agentes anticancerígenos.

Informações de Suporte

Figura S1.

OA não conseguiu afectar o teor de oxigénio numa cultura de células. PC-3 e células MCF-7 foram tratadas com ou sem OA durante 12 h. O

2 O conteúdo foi detectado com nos pontos de tempo indicados. Os valores médios de três experimentos independentes foram apresentados como média ± SD

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091606.s001

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Figura S2.

OA incubação induzida a elevação da actividade de PK em células cancerosas. As células PC-3 e MCF-7 (a) foram tratadas com OA nas doses indicadas e a actividade de PK foi determinada 12 horas após o tratamento de OA. Os valores médios de três experiências independentes são apresentados como média ± DP. *, P 0,05, **, P 0,01. (B) A actividade de PK foi também avaliada nas células cancerosas expostas com 100 ug /ml OA nos pontos de tempo indicados. Os valores médios de três experiências independentes são apresentados como média ± DP. *, P 0,05, **, P 0,01

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091606.s002

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Figura S3.

PKM2 superexpressão resgatar a elevação da atividade PK induzida pela opção /PKM1 PKM2. a actividade de PK foi avaliada em células PC-3 tratadas com OA transfectadas com PKM2- ou vector expressando GFP, 12 horas após o tratamento com 100 ug /ml de OA. Os valores médios de três experiências independentes são apresentados como média ± DP. *, P 0,05

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091606.s003

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