chinesa

Abstract

Fundo

Como um reparo incompatível gene (MMR),

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desempenha um papel importante na manutenção da integridade cromossómico. Diversos estudos têm investigado as associações de

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-93G . A (rs1800734) e Ile219Val (rs1799977) em diversos tipos de tumores com resultados discordantes, mas seus papéis no cancro do ovário na população chinesa continua a ser elucidado

Métodos

em uma análise de caso-controle, que avaliou a associação entre esses dois polimorfismos e risco de câncer de ovário em 421 pacientes com câncer ovariano e 689 indivíduos controle na população chinesa meio de regressão logística.

resultados

Nós descobrimos que a variante

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genótipos (-93AA e AG) estão associados com risco de câncer de ovário (odds ratio ajustada [OR] = 2,02, 95% de confiança intervalo [IC] = 1,42-2,89) em comparação com o genótipo -93GG. O alelo A aumenta o risco de cancro do ovário de um modo dependente da dose (

P

10

-4). teste funcional mostrou que o alelo -93A aumentou

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atividade transcricional do promotor e a actividade de luciferase. No entanto, não foi encontrada diferença significativa nas freqüências genotípicas no local Ile219Val entre os casos e controles

Conclusões

Estes resultados indicam que a -93G . Um polimorfismo no

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pode afetar a suscetibilidade ao câncer de ovário na população chinesa

Citation: Niu L, Li S, Liang H, Li H (2015) o

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-93G Um Polimorfismo e Risco de. Cancro do ovário na população chinesa. PLoS ONE 10 (8): e0135822. doi: 10.1371 /journal.pone.0135822

editor: Yifeng Zhou, Faculdade de Medicina da Universidade de Soochow, CHINA

Recebido: 20 de junho de 2015; Aceito: 27 de julho de 2015; Publicação: 14 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Niu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional Natural Científico de subvenções China (No. 81.202.040 para HL), Pequim Municipal Natural Science Foundation (No. 7.142.167 para HL) e do Programa Nova Pequim (No. 2009B03 para hl)

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é um dos tipos mais comuns de. malignidades ginecológicas [1]. Globalmente, a partir de 2010, aproximadamente 160.000 pessoas morreram de câncer de ovário, contra 113.000 em 1990 [2]. levantamentos epidemiológicos têm demonstrado que alguns fatores etiológicos, incluindo a idade precoce da menarca, idade tardia na menopausa, obesidade, uso de estrogênio e terapia de reposição hormonal, e susceptibilidade hereditária, estão associados positivamente com câncer de ovário [3, 4]. Além disso, a incidência de cancro do ovário aumenta com o aumento da idade. Uma vez que uma terapia padrão existe mas não se obter resultados ideais, o cancro do ovário continua a ser um desafio terapêutico. Estudos recentes indicam que não há diferença significativa nos resultados clínicos de operação radical e quimioterapia adjuvante à base de platina para os indivíduos com diferentes polimorfismos genéticos, sugerindo que a susceptibilidade genética desempenha um papel importante no risco de um indivíduo de desenvolver câncer de ovário [5, 6]

sistemas

reparo de DNA têm um papel essencial na manutenção da integridade e estabilidade genômica. É bem conhecido que as variantes genéticas dos genes de reparação podem afectar a função das proteínas codificadas e alterar a sua capacidade de reparação do ADN, que por sua vez pode conduzir a susceptibilidade de diferentes tipos de cancro e pode também ser factores de prognóstico adversas uma vez que o cancro se desenvolveu [7 , 8]. Como um componente-chave do sistema de reparo incompatível DNA (MMR),

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(mutL homólogo humano 1) interage fisicamente com outros componentes do MMR e desempenha um papel crucial na manutenção da estabilidade do genoma nas respostas à replicação erros e física ou dano químico ao DNA [9]. Várias descobertas têm sugerido o papel essencial de

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no controlo do ciclo celular e apoptose [10-12]. Disfunção do gene da

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pode resultar em falha de realizar todas as funções do sistema de MMR e pode estar associada a uma predisposição para o cancro [13, 14]. Vários polimorfismos foram identificados no gene

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[15-17]. Recentemente, estudos exploraram a associação de um importante e frequente polimorfismo, ou seja -93G A (rs1800734), que está localizado na região de promotor-núcleo de

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, com a susceptibilidade ao desenvolvimento de várias malignidades humanas, incluindo o tabaco carcinoma -relacionados oral [18], o cancro do pulmão [19], o cancro colorectal [20] e carcinoma de tireóide papilar (PTC) [21]. Outro sítio polimórfico missense amplamente estudado no gene

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Ile219Val é, uma transição de A a G que ocorre no codão 219, que leva a uma mudança de aminoácido, que foi estudado em cancros em populações Europeias [22, 23]. Embora o facto de que o

gene hMLH1

têm sido associadas a diversos tipos de cancro, a associação destas variações com cancro do ovário na população chinesa não foi estudado. Nossa hipótese é que o

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polimorfismos do gene -93G . A e Ile219Val (rs1799977) pode causar suscetibilidade individual ao câncer de ovário, afetando a capacidade DNA mismatch reparação

Considerando o importante papel da

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no processo cancerígeno, foi realizado um estudo caso-controle em uma população chinesa para investigar a possível relação entre esses dois polimorfismos e o risco de câncer de ovário na população chinesa.

Materiais e métodos

população do estudo

os pacientes elegíveis (421) foram aqueles diagnosticados de cancro do ovário consecutivamente recrutados a partir de março de 2003 a Maio de 2009, Peking University Third Hospital (Beijing) e do Hospital do câncer da Academia chinesa de Ciências médicas (Pequim). Os pacientes eram da cidade de Beijing e as suas regiões vizinhas com idade inferior a 90 anos. Os controles (689) foram frequência correspondente aos casos por idade (± 5 anos), viviam na região de Pequim e foram selecionados aleatoriamente entre aqueles que foram submetidos a um exame físico em hospitais. A taxa de resposta foi de 96,5%. O exame físico incluiu radiografia de tórax, ultra-sonografia abdominal, ginecológica e exames citológicos cervicais. Os critérios de selecção incluídos sem histórico de câncer ou de operações anteriores no ovário. O estado histológico do tumor e estadiamento clínico foram baseados nos critérios da Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) [24]. As características clínicas dos pacientes para o nosso estudo são apresentados na Tabela 1. No recrutamento, todos os participantes foram convidados a fornecer consentimento informado para colheita de sangue deles e preencheram um questionário estruturado. O procedimento de estudo foi aprovado pelo Peking University Third Hospital e do Hospital do Câncer da Academia Chinesa de Ciências Médicas.

A genotipagem análise

O DNA genômico foi isolado do sangue periférico do estudo sujeitos utilizando o ADN do sangue Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). plataforma de MALDI-TOF foram utilizados para genotipar

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-93G A e polimorfismos Ile219Val como descrito anteriormente [25, 26]. Para controle de qualidade, 5% das amostras foram selecionados aleatoriamente para repetir, e foram incluídos 50 amostras de seqüência direta para confirmar genótipos a partir da análise por espectrometria de massa. Hardy-Weinberg foi verificada em todos os grupos de amostras.

plasmídeos repórter, transfections e ensaios de luciferase

As construções repórter alélicas 93G e 93A foram preparados pelo Genewiz Company (Pequim, China), amplificando região do promotor nuclear de

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, um fragmento de 282 pb a partir de -299 a -17, tal como descrito anteriormente [27], e em seguida clonado no vector de luciferase pGL3-basic (Promega, Madison, WI, EUA ). células 293T e células SKOV-3 (linha de células de cancro do ovário) foram utilizados para transfectar os plasmídeos repórter acima, com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por meio de procedimentos publicados anteriormente [28, 29], o vector vazio foi utilizado como um controle negativo. As actividades de luciferase Renilla foram medidos com o Luciferase Dual-sistema de ensaio Repórter (Promega).

Real-Time Análise do

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mRNA

O RNA total Do vigésimo-oitavo amostras de tecido de cancro dos ovários obtidos a partir de amostras removidas por biópsia de doentes individuais foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Inc.). A quantificação relativa da expressão do gene

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foi realizada utilizando o Ensaio de SYBR Green utilizando o sistema de detecção de sequência ABI Prism 7500 (Applied Biosystems). β-actina foi usado como controles endógenos para

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expressões. Os iniciadores utilizados para

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foram 5′-CAGAGGAAGATGGTCCCAAA-3 ‘(F) e 5′-TCTTCGTCCCAATTCACCTC-3′ (R), e aqueles para β-actina foram 5’-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3 ‘(F ) e 5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3 ‘(R). A expressão relativa de

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foi realizada usando a 2

cálculo -ΔΔCT.

A análise estatística

testes qui-quadrado com dois lados foram usadas para avaliar as diferenças no índice de idade e massa corporal (IMC) distribuições, bem como as freqüências alélicas e genotípicas entre os casos e controles. As freqüências genotípicas observadas nos controles sem câncer foi testado para Hardy-Weinberg (HWE) pela bondade do ajuste

x

2 testes. As associações de todos os genótipos com risco de câncer de ovário foram calculados pelo odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC), seguido por análise de estratificação com ajuste para idade e IMC. O poder estatístico foi calculado mediante a aplicação do software PS (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize, acessado 14 de dezembro de 2010). As diferenças na atividade repórter luciferase e níveis de mRNA de

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em tecidos de câncer de ovário entre diferentes cada alelo foram examinadas por ANOVA one-way eo teste t de Student. A DL dos dois SNPs foi detectado pelo programa 2LD e o procedimento estatístico PROC ALELO no software SAS /Genetics (SAS Institute, Inc., Cary, NC, EUA).

P Art 0,05 foi utilizado como critério de significância estatística, e todos os testes foram bilaterais e executado com o software SAS (versão 9.1; SAS Institute, Cary, NC, EUA).

resultados

genótipos e risco de câncer de ovário

A associação do cancro do ovário com -93G A foi determinado com base em 421 casos e 689 controles. Os resultados de genotipagem na Tabela 2 mostrou que

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-93G A foi significativamente associada com o risco de câncer de ovário. Em comparação com os controles saudáveis, portadores -93AA e AG foram significativamente associados com o risco de câncer de ovário (odds ratio ajustada [OR] = 2,02, 95% intervalo de confiança [CI] = 1,42-2,89). Além disso, a freqüência do alelo -93A em casos (65,6%) também foi significativamente maior do que nos controles (52,4%) (

P Art 10

-4). No entanto, não houve diferença significativa entre os diferentes genótipos da variante Ile219Val e susceptibilidade ao cancro do ovário. análise de desequilíbrio de ligação mostrou que a ligação entre -93G A e Ile219Val foi relativamente fraca (r

2 = 0,051), sugerindo que cada um pode ter um efeito independente sobre o risco de câncer de ovário e, portanto, não ser adequada para análise de haplótipos

o risco de câncer de ovário relacionado com o

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-93G a genótipos foi ainda determinada com estratificação por idade e IMC. Não houve associação significativa entre os genótipos variantes e risco de câncer de ovário

Efeitos da

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-93G . Um polimorfismo na atividade transcricional

Tendo em conta que -93G Um polimorfismo pode ser associado com o risco de câncer de ovário, dois repórter luciferase constrói (pGL3-

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-G-alelo e pGL3-

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-A-alelo) foram utilizados para transfectar transitoriamente 293T células para determinar directamente os efeitos da -93G Um polimorfismo na actividade de transcrição da

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promotor. Como mostrado na Fig 1A, em comparação com a construção contendo o alelo -93G, a construção que contém o alelo -93A exibiram aumento significativo da actividade da luciferase (

P

0,001). Consistente com o aumento da

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actividade de transcrição do promotor para o alelo -93A nas células 293T, a actividade da luciferase da construção que contém o alelo -93A parecia ser mais elevada em linhas de células em SK-OV-3 de células (

P

= 0,002).

(a) Representação esquemática de construções de gene repórter contendo a região de promotor-núcleo de

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(um fragmento de 282 pb a partir de -299 a -17) com o alelo G ou a no sítio polimórfico -93 (superior). A expressão de luciferase de duas construções (pGL3-93G e pGL3-93A) em 293T e SK OV-3 células cotransfectadas com PRL-SV40 para padronizar a eficiência de transfecção é mostrado (inferior). Cada grupo tem seis réplicas, e as experiências de transfecção foram repetidas três vezes. Os dados são as médias ± erro padrão da média. O asterisco indica uma alteração significativa. (B)

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nível de expressão em vinte e oito tecidos do cancro do ovário com diferentes -93G A genótipos (6 -93GG, 10 -93AG e 12 -93AA); os dados são as médias ± erro padrão da média. O nível dos -93GG e -93AG genótipos de expressão foram significativamente maiores do que a do genótipo AA (

P Art 0,001).

Associação de

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-93G a genótipos com

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expressão

Para melhor avaliar o efeito do SNP -93G a no risco de câncer de ovário, examinamos

expressão hMLH1

entre os diferentes genótipos do SNP em vinte e oito tecidos de cancro do ovário individuais (6 -93GG, 10 -93AG e 12 -93AA) por PCR em tempo real. Como mostrado na Figura 1B, nos vinte e oito tecidos de cancro do ovário,

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expressão foi significativamente maior naqueles com a -93GG e genótipos -93AG do que naqueles com o genótipo -93AA (GG, 0,428 ± 0,036 ; AG, 0,287 ± 0,026; AA, 0,192 ± 0,029, teste ANOVA:

P Art 0,001)

Discussão

no presente caso-controle de base hospitalar. estudo, buscou-se identificar fatores genéticos que conferem suscetibilidade individual ao câncer de ovário. Os resultados obtidos através da análise de 421 pacientes e 689 controles saudáveis ​​mostrou que

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-93G A é associado com o risco de câncer de ovário na população chinesa. Nossos dados mostraram que, em comparação com o genótipo GG, os indivíduos portadores do -93AA e genótipos AG tinha aumentado significativamente o risco de câncer de ovário (

P Art 10

-4).

recentemente, a mutação de genes de reparação do ADN na etiologia de vários cancros tem recebido uma grande atenção. Foi proposto que as variantes genéticas nos genes de reparação de ADN que potencialmente resultar na expressão da proteína alterada ou função levaria a falha no reconhecimento de danos e reparação do ADN, que por sua vez iria permitir mutações subsequentes a acumular-se e, portanto, pode aumentar a susceptibilidade a vários cancros [30 -32]. Em humanos, existem várias vias de reparação de DNA que são essenciais para a integridade do genoma, incluindo reparação de excisão de bases (BER), a reparação por excisão de nucleotídeos (NER), ADN de cadeia dupla breaks (LAP) e MMR [33]. Um conjunto altamente conservada de proteínas MMR tem sido conhecido por ser o principal responsável pela reparação de bases sem correspondência durante a replicação do DNA [34, 35]. No entanto, estudos recentes têm comumente informou que

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desempenha um papel central no sistema de MMR em excisão incompatibilidade vertente e da subsequente reparação [36, 37]. A variante genética do

gene MLH1

pode afetar a capacidade MMR da proteína codificada e, portanto, pode contribuir para o risco de câncer. Até à data, tem havido um grande interesse na associação entre dois polimorfismos amplamente estudados (-93G A e Ile219Val) e diferentes tipos de câncer; No entanto, os resultados são contraditórios. O polimorfismo comum

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-93G A está situado na região do promotor nuclear, 93 nucleótidos a montante do local de início da transcrição, contém sequências de consenso para o factor de transcrição putativos locais de ligação, e podem desempenhar um papel importante na regulação

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atividade do promotor, modulando assim a susceptibilidade ao câncer [38]. O

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-93G Um polimorfismo tem sido investigada em vários estudos, mas os resultados não são consistentes. Recentemente,

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-93G A genótipos variantes (AA, AG) têm sido associados com um risco aumentado de câncer de pulmão [39], o cancro da mama [40] e cancro colorectal [41]. Curiosamente, um estudo recente de índios asiáticos que usam a 242 pacientes com carcinoma oral e 205 controles saudáveis, descobriram que o genótipo GG apresentou maior prevalência em pacientes em comparação com os controles saudáveis ​​(P 0,0006) [18]. Nossos resultados indicaram que os genótipos variantes (AA, AG) de

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-93G . Uma pode estar relacionado ao risco de câncer

Outra comumente estudados

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polimorfismo, Ile219Val , é uma mutação não-sinónimo que muda Ile 219 a Val, possivelmente alterando a função da proteína hMLH1. Vários estudos têm relatado que o

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Ile219Val polimorfismo está intimamente relacionado com o aparecimento de uma variedade de cancros, incluindo o cancro do pulmão [42], o cancro da mama [40] e câncer gástrico [43]. No entanto, a associação entre o

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Ile219Val genótipos variantes e risco de câncer não é o mesmo em diferentes tipos de câncer e grupos étnicos. Por exemplo, no cancro da próstata, Burmester et ai. descobriram que o

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Ile219Val polimorfismo é significativamente associada com maiores taxas de câncer de próstata em pessoas de ascendência europeia, enquanto que Fredriksson et al. mostrou que

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não têm um papel importante no cancro da próstata em uma população finlandesa [22]. Nossos resultados sugerem que não há associação entre este polimorfismo e câncer de ovário na população chinesa.

Algumas limitações podem existir no presente estudo devido ao seu design baseado no hospital limitado a população chinesa. Além disso, o viés de seleção inerente que apresenta fatores de confusão desequilibradas podem afetar as conclusões do actual nossos resultados, porque os casos e controles eram de diferentes centros. No entanto, as freqüências genotípicas entre os controles caber a lei desequilíbrio de Hardy-Weinberg, sugerindo seleção assunto aleatório, e conseguimos um poder mais de 90% do estudo (teste bilateral, α = 0,05) para detectar uma OR de 2,02 para o

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-93 genótipos AG (que ocorreu com uma frequência de 78,2% nos controles) em comparação com o genótipo -93GG, sugerindo que este achado é digno de nota AA +.

em conclusão, o presente estudo indica que na população chinesa, os portadores dos genótipos -93AA e AG têm maior risco de câncer de ovário em comparação com as transportadoras GG. Para o melhor de nosso conhecimento, este estudo forneceu a primeira evidência de que a -93G Um polimorfismo no

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está associada com um risco significativo de desenvolver câncer de ovário na população chinesa. Outros estudos de caso-controle de base populacional independentes são necessários para validar os nossos resultados em amostras maiores, bem como em diferentes populações.