Abstract
Fundo
celular DNA livre (cfDNA) circula por todo o sangue de ambas as pessoas saudáveis e pacientes com várias doenças e actua sobre as células. Resposta a cfDNA depende de concentrações e níveis de danos dentro cfDNA. DNA extracelular oxidado atua como um sinal de estresse e provoca uma resposta adaptativa.
principais conclusões
Aqui nós mostramos que o DNA extracelular oxidado estimula a sobrevivência de células MCF-7 do tumor. Importante, em células expostas a ADN oxidado, a supressão de morte celular é acompanhada por um aumento nos marcadores de instabilidade do genoma. Exposição a curto prazo para resultados de DNA oxidados em ambas as quebras de DNA vertente simples e dupla. tratamentos mais longos evocar uma resposta compensatória que leva a uma diminuição nos níveis de fragmentação de cromatina através de populações de células. A exposição ao ADN oxidado leva a uma diminuição na actividade de NRF2 e um aumento na actividade de NF-kB e STAT3. Um modelo que descreve o papel do DNA oxidado lançado a partir de células em apoptose na biologia do tumor é proposto.
Conclusões /Significado
A sobrevivência de células com um genoma instável pode aumentar substancialmente a progressão da malignidade. Novos estudos sobre os efeitos de DNA extracelular em células malignas e normais são garantidos
Citation:. Kostyuk SV, Konkova MS, Ershova ES, Alekseeva AJ, Smirnova TD, Stukalov SV, et al. (2013) uma exposição ao DNA Oxidado aumenta tanto a instabilidade de Genoma e Sobrevivência em células cancerosas. PLoS ONE 8 (10): e77469. doi: 10.1371 /journal.pone.0077469
editor: Roberto Amendola, ENEA, Itália |
Recebido: 25 de maio de 2013; Aceito: 03 de setembro de 2013; Publicação: 17 de outubro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Kostyuk et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo RFBR (12-04-32081; 12-04-32074), pelos contratos No. 14.512.11.0090 e nº 8273 (ao abrigo do convite No. 2012-1.1-12-000-2008-067) de o Ministério da Educação e Ciência da Rússia e do Jeffress Foundation Grant No. J-1023. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução fragmentos
Free Cell DNA circulante (cfDNA) podem ser recolhidos a partir de plasma, soro ou outros fluidos corporais de ambas as pessoas saudáveis e doentes com várias doenças. Na maioria das vezes, os efeitos de cfDNA são estudados utilizando
in vitro
modelos de ADN extracelular (ecDNA), isolados a partir de sobrenadantes isentos de células de cultura de células [1], quer intactos ou expostos a diversos tipos de stress oxidativo.
O stress oxidativo é conhecido por induzir a morte celular. células que morrem liberar fragmentos de DNA oxidado na piscina cfDNA. cfDNA circula por todo o corpo e provoca efeitos sistémicos secundários, em órgãos e tecidos distantes. cfDNA extraída a partir do plasma do sangue de pacientes com níveis elevados de stress oxidativo é conhecido para influenciar a actividade fisiológica de células intactas [1-6]. Em células-tronco mesenquimais (MSCs), ambos ecDNA coletadas a partir da mídia de culturas de células tumorais primárias e cfDNA extraídos do plasma de pacientes com câncer têm influenciado a produção de ROS [5]. Em fibroblastos, oxidado ecDNA evoca uma resposta adaptativa que se manifesta como um aumento na resistência das células tratadas com irradiação e agentes de stress crónico [7]. De facto, os fragmentos ecDNA servir como sinais de stress, tanto para a resposta adaptativa e para efeito espectador que se desenvolvem em resposta à irradiação com uma dose baixa em muitos tipos de células em cultura [1,8-15].
anterior
in vitro
estudos perfilado os vários efeitos de cfDNA /ecDNA em células primárias cultivadas, incluindo endotheliocytes humanos [2,3], células-tronco mesenquimais (MSCs) [5,6], linfócitos [8-10,12] e fibroblastos [7], bem como cardiomiócitos de rato [4] e neurónios [16]. No entanto, não há estudos até agora descritos os efeitos de ecDNA sobre as células de tumor, apesar da importância óbvia deste modelo para a terapia de doenças malignas humanas, particularmente devido à abundância de observações publicadas, indicando um aumento na concentração cfDNA na circulação de doentes com cancro [17-25]. As células cancerosas são diferentes dos normais por seus aumento dos níveis de ROS; os níveis de oxidação no ADN do tumor também são maiores que no tecido normal. Com efeito, tanto a irradiação e quimioterapia levar à morte oxidativa de um grande número de células tumorais, em princípio, resultando numa libertação maciça de cfDNA oxidado.
Neste estudo, descrevemos os efeitos dos aumentos na oxidação ecDNA e concentrações ecDNA sobre várias características de estrogénio (ER) e receptor de progesterona (PR) de células de carcinoma da mama positivo MCF-7. Aqui mostramos que oxidado ecDNA induzir nestas células um estresse oxidativo que, por um lado, é acompanhada por uma incapacidade de manter a estabilidade do genoma e, por outro lado, origina o desenvolvimento da resposta adaptativa que aumenta a sobrevivência celular .
Resultados
As concentrações de ecDNA nos meios condicionados por células MCF-7 intactas foram, em média, a 140 ± 20 ng /mL. Efeitos da gDNA e gDNA
OX foram avaliados após a adição de várias concentrações de DNA respectiva para a mídia de cultivo. ADNg intacto foi extraído a partir de fibroblastos embrionários humanos primários (HEFs), enquanto ADNg
OX amostras foram obtidas como resultado do tratamento de ADNg com H
2O
2 como se descreveu antes [15]. Níveis de 8- oxodG em gDNA estavam em
~ 0,1 8 oxodG por um milhão de 2′- desoxinucleósidos, enquanto em gDNA
OX estes níveis estavam em ~ 750 8-oxodG por um milhão de 2′- desoxinucleósidos [5,7]. Para assegurar que ADNg corresponde ADNg
OX pelo comprimento médio de seus fragmentos e a sua distribuição de tamanho (0,2 a 15 kb), ADNg foi tratada com várias concentrações de ADNase I e a amostra ADNg correspondente foi seleccionada após avaliação electroforética em gel de agarose. Efeitos comparativos de ADNg e ADNg
OX tratamentos foram estudadas a concentrações de mídia finais de 50 ng /mL ou 5 ng /mL, enquanto que a exposição variaram entre 30 minutos e 48 horas.
1. Localização de gDNA e gDNA
OX em células MCF-7
Para saber os locais intracelulares de gDNA e gDNA
OX, um número de sondas de DNA foram sintetizados e diferencialmente rotulados. gDNA
sondas vermelhas e verdes pBR322
foram rotulados com nick-translation com SpectrumRed e SpectrumGreen, respectivamente. Em células MCF-7, gDNA
vermelho e pBR322
green demonstrar granulada semelhante, padrões de coloração aglutinados na periferia do citoplasma, visível em aproximadamente 70% das células (Figura 1А). Uma análise mais detalhada mostrou que a distribuição intracelular de fragmentos de ADN marcado é específico da amostra (Figura 1В). Em células tratadas com ambos gDNA
vermelho e pBR322
verde, algumas áreas do citoplasma estão manchadas com um, mas não o outro tipo de DNA marcado. Áreas manchadas com mais gDNA
red sequência de diversas estão presentes em maior número e ocupar um volume maior da célula. Em ADNg
células manchadas de vermelho havia também uma coloração difusa perto do envelope nuclear que era visível a uma ampliação maior (x 200). Nossas observações indicam que pelo menos alguns fragmentos gDNA exógenos são importados para dentro da célula
A – gDNA
vermelho, núcleos são corados com DAPI (x40).; B – fundiu padrões de coloração de gDNA
vermelho e pBR322
verde (x200); С – fundiu padrões de coloração de gDNA
red-boi e anticorpos conjugados com FITC a 8-oxodG (x200); D – FACS análise do início EEA1 marcador endossomal; a distribuição das células com diferentes conteúdos EEA1.
As concentrações finais de DNA adicionada nos meios de comunicação foram a 50 ng /mL; As células foram incubadas com o ADN durante 30 minutos antes de fixação em 3% de formaldeído. No caso da coloração com anticorpos conjugados com FITC a 8-oxodG, células fixadas foram pré-tratados com 0,1% de Triton Х100 para a permeação.
Para determinar os locais intracelulares para ADNg
OX, uma sonda composta foi produzido por renaturation lenta de nick-translation marcado gDNA
vermelho e gDNA
OX (gDNA
red-OX). Semelhante a ADNg
vermelho, esta sonda composto marcado foi também localizado na periferia do citoplasma (Figura 1С), no entanto, no caso de a sonda compósito ADNg
vermelho-OX, uma porção substancial dos fragmentos marcados eram encontrado no interior do citoplasma perto do núcleo. Para confirmar que esta coloração difusa correspondeu ao ADN oxidado, que as células coradas com anticorpos conjugados com FITC a 8-oxodG (Figura 1C). Nossos dados indicam que gDNA
OX é importado para o celular em um grau substancialmente maior do que gDNA. Após entrar na célula, ADNg
OX localiza no citoplasma, formação de focos em torno do núcleo.
Endocytosis é uma das formas mais comuns de distribuição de compostos exógenos para dentro da célula. A formação de novos endossomas é acompanhada por um aumento na expressão de antigénio precoce do endossoma uma proteína (EEA1), conhecido como um biomarcador endossomal precoce [26]. Utilizando FACS, que demonstrou que a exposição ao DNA
OX leva a um aumento da proporção de células que expressam níveis elevados de EEA1 (Figura 1D). Estas observações estão em concerto com padrões visuais de coloração intracelular para ADNg
OX.
Sabe-se que os sensores intracelulares são capazes de se ligar a fragmentos de ADN, quer no interior do citoplasma (AIM2, RIG1, picada) [27 ] ou dentro dos endossomas (TLR9) [28]. Curiosamente, a 2 horas de exposição a ADNg
OX estimula a expressão de mRNAs que codificam AIM2, TLR9 e RIG1 (Tabela 1). Dois sensores de ADN, AIM2 e TLR9, foram estudados em maiores detalhes (Figura 2).
Gene Símbolo
gDNA, 50 ng /mL
gDNA
OX, 50 ng /ml
2h
48h
2h
48h
Ciclo celular Checkpoint e interrupção do ciclo celular:
CDKN2A (p16INK4)
1,8 ± 0.53.3 ± 0,3 * 1,6 ± 0,1 * 2,5 ± 0,3 *
CDKN1A (p21Cip1 /WAF1)
1,3 ± 0.32.9 ± 0,2 * 1,1 ± 0.22.2 ± 0,2 *
TP53
0,8 ± 0.41.6 ± 0,2 * 2,6 ± 0,3 * 2,1 ± 0,2 * anti-apoptótica
BCL2
1,2 ± 0.22.5 ± 0,3 * 3,3 ± 0,3 * 3,2 ± 0,2 *
BCL2A1 (Bfl-1 /A1)
1,3 ± 0.32.0 ± 0,3 * 5,0 ± 0,3 * 1,8 ± 0,3 *
BCL2L1 (BCL-X)
1,0 ± 0.21.9 ± 0,3 * 1,2 ± 0.31.6 ± 0,3 *
BIRC3 (c-IAP1)
0,7 ± 0,33. 5 ± 0,4 * 1,8 ± 0,2 * 2,6 ± 0,4 * Repair dupla vertente DNA ruptura
BRCA1
1,0 ± 0.11.0 ± 0.16.4 ± 0,6 * 2,1 ± 0,5 receptores * DNA citoplasmática:
AIM2
1,2 ± 0.21.3 ± 0.12.2 ± 0,2 * 2,5 ± 0,4 *
RIG1
1,5 ± 0.21.3 ± 0.22.4 ± 0,2 * 1,4 ± 0,3
STING
1,3 ± 0,21. 4 ± 0.21.0 ± 0.21.3 ± 0,3
TLR9
1,6 ± 0,2 * 1,3 ± 0.23.0 ± 0,3 * 1,2 ± 0.2Nrf2-Keap1 Caminho:
NRF2 (NFE2L2)
1,4 ± 0,1 * 1,1 ± 0.12.3 ± 0,1 * 1,2 ± 0,2
KEAP1
0,9 ± 0.11.1 ± 0.13.6 ± 0,2 * 1,0 ± 0.1NFκB Caminho:
MAP4K4
1,1 ± 0.21.5 ± 0.22.0 ± 0,1 * 1,1 ± 0,3
MyD88
1,0 ± 0.22.0 ± 0,2 * 3,6 ± 0,2 * 1,4 ± 0,2
NFKB1
1,6 ± 0,2 * 0,9 ± 0.21.8 ± 0,2 * 1,5 ± 0,4
TIRAP
1,0 ± 0.22.2 ± 0,2 * 2,7 ± 0,3 * 1,3 ± Família 0.3STAT:
STAT3
1,2 ± 0.21.8 ± 0,1 * 3,0 ± 0,3 * 1,0 ± 0.2
STAT6
1,2 ± 0.21.8 ± 0,3 * 1,6 ± 0,3 * 1,1 ± 0.3MAPK e JNK /p38 Caminho:
FOS
1,3 ± 0.21.4 ± 0.31.4 ± 0.21.3 ± 0.3
junho
1,6 ± 0,3 * 1,6 ± 0,2 * 2,3 ± 0,3 * 1,9 ± 0,4 *
MAPK8 (JNK1)
0,8 ± 0.21.8 ± 0,2 * 1,3 ± 0.21.3 ± 0,2 citocinas
IL10
0,8 ± 0.25.3 ± 0,5 * 1,8 ± 0,2 * 4,2 ± 0,4 *
IL6
0,8 ± 0.31.8 ± 0,2 * 2,6 ± 0,3 * 1,9 ± 0,2 *
IL8
1,7 ± 0,2 * 1,1 ± 0.23.2 ± 0,2 * 1,4 ± 0,4
TNFa
1,8 ± 0,2 * 2,2 ± 0,2 * 3,6 ± 0,2 * 2,3 ± 0,3 * adesão celular e celular Migração Moléculas:
ICAM1
0,9 ± 0.21.3 ± 0.22.6 ± 0,3 * 1,6 ± 0,4
PECAM1
1,3 ± 0.21.4 ± 0.21.7 ± 0,2 * 1,2 ± 0,2
SELE
1,0 ± 0.11.1 ± 0.22.1 ± 0,3 * 1,0 ± 0,2
SELP
3,7 ± 0,3 * 1,5 ± 0,2 * 1,3 ± 0.21.6 ± 0,3 *
VCAM1
1,5 ± 0.31.9 ± 0,2 * 3,2 ± 0,3 * 1,3 ± 0,2
RHOA
1,3 ± 0.21.2 ± 0.21.6 ± 0,2 * 1,1 ± 0.1Growth fatores:
BMP2
1,6 ± 0,2 * 1,7 ± 0,2 * 3,0 ± 0,3 * 2,4 ± 0,2 *
BMP4
1,2 ± 0.21.9 ± 0,3 * 2,6 ± 0,4 * 1,4 ± 0,4
VEGFA
1,3 ± 0.21.8 ± 0,4 * 0,7 ± 0.31.4 ± 0.3Pluripotent tronco genes relacionados com celulares:
NANOG
1,2 ± 0.31.4 ± 0,1 * 1,2 ± 0.21.0 ± 0,2
OCT4
1,2 ± 0.21.5 ± 0,2 * 2,5 ± 0,2 * 1,7 ± 0,1 *
GATA-4
1,1 ± 0.21.5 ± 0,2 * 1,4 ± 0.31.3 ± 0.3Table 1. As mudanças nos níveis de selecione mRNAs de expressão após a exposição de células MCF-7, quer gDNA ou gDNA
OX.
níveis relativos de expressão são médias para três repetições biológicas e um desvio padrão. (*) P 0,05 – contra células de controlo, não paramétrico
U
-test (Mann-Whitney U-testes) CSV Baixar CSV
A – localização intracelular de AIM2 (anticorpos conjugados com FITC) e sonda marcada gDNA
red-ox (x40). B – a relação entre os níveis de aim1 [1] e TLR9 [2] – codifica ARN para o ARNm de referência os níveis de TBP-codificação em células expostas a ADNg ou ADNg
OX durante 2 horas (colunas cinzentas) e 48 horas ( colunas pretas)
C e D -. a citometria de fluxo da detecção AIM2 (C) e expressão de TLR9 (D) em células MCF-7. As células foram coradas com AIM2 (C) ou de TLR9 (D) anticorpo (anticorpos secundários conjugado com PE). Painéis D [1] e E [1] – As células de controlo parcelas: FL2 contra o SSC. R: área fechada. Painéis C [2] e D [2]: intensidade de sinal mediana de FL2 (R) em células MCF-7 (valor de três experiências independentes média). Painéis C [3] e D [3]: proporções relativas de AIM2- ou TLR9 células positivas em portões R [1]. a fluorescência de fundo foi quantificada usando anticorpos secundários conjugados com PE.
* p 0,05 contra o grupo de controlo de células, não paramétrico U-teste.
AIM2.
Em células MCF-7 não confluentes, os níveis de
AIM2
ARNm (Figura 2B [1]) e a expressão da proteína (Figura 2C) são baixos. Nas células de controlo, os níveis de proteína de AIM2 correlacionam com o grau de confluência. Em culturas não confluentes, AIM2 é expressa em cerca de 25% das células (Figura 2C [1,3]). Em culturas confluentes, a proporção de células com AIM2 aumenta duas vezes (Figura 2C [1,3]). Estes aumentos são em paralelo com os aumentos nos níveis de proteína AIM2 por célula (Figura 2C [2]), ao passo que os níveis de ARNm que codificam AIM2 permanecer aproximadamente o mesmo (Figura 2B [1]). Estas observações podem ser explicadas pela regulação da actividade AIM2 existentes ao nível da tradução ou a sua estabilidade, em vez de no nível da transcrição e aguardam uma investigação mais aprofundada.
padrões de coloração para anticorpos anti intercalados-AIM2 conjugados com FITC e sonda marcada ADNg
vermelho-boi são mostrados na Figura 2A. Muitas áreas manchadas, de fato, sobreposição, possivelmente indicando uma interação entre gDNA
OX com sensores AIM2. Em células MCF-7 em cultura de células expostas ao ADN oxidado, os níveis de ambas as proteínas e os seus mRNA AIM2 são elevados (Figuras 2B [1] e 2C). Na população AIM2-positivo de células, a exposição a qualquer DNA ou DNA genoma oxidada durante 48 horas leva à queda nos níveis de proteína AIM2 por célula (Figura 2С [2]).
TLR9.
Em células MCF-7 não confluentes, os níveis de TLR9 são baixos, com aproximadamente 20% de células coradas (Figura 2B [2], D), de acordo com estudos anteriores [28]. Em confluentes MCF-7 culturas, a proporção de células que expressam a proteína de TLR9 aumenta para aproximadamente 40% (Figura 2D [3]), juntamente com as intensidades de TLR9 coloração das células individuais (Figura 2D [2]). Da mesma forma que os níveis de ARNm AIM2 codificações, os níveis de mRNAs de TLR9 codificações permanecem inalterados (Figura 2B [2]). Após 2 horas de exposição ao ADN oxidado, os níveis de ARNm que codifica aumento TLR9, enquanto quantidades de proteína TLR9 em células individuais não mudam.
A exposição prolongada de células MCF-7 com ADN oxidado leva a uma diminuição na intensidade da coloração das células individuais com anticorpos anti-TLR9 (Figura 2D [2]). Mais cedo, o mesmo tipo de resposta gDNA e gDNA
OX foi observada em fibroblastos humanos cultivados [7]. Todos em conjunto, os nossos dados indicam que a exposição prolongada a qualquer ADNg ou ADNg
OX leva à diminuição dos níveis celulares de sensores de ADN AIM2 e TLR9 e, possivelmente, o processo de dessensibilização parcial destas células para efeitos de ADN extracelular.
2. A exposição a gDNA
OX induz estresse oxidativo de curto prazo
Para estudar possível influência de gDNA e gDNA
OX sobre os níveis intracelulares de espécies reactivas de oxigénio (ROS), o ROS foram medidos usando dichlorodihydrofluorescindiacetate ( H2DCFH-dA) corante que penetra rapidamente as membranas celulares, e fica preso no citoplasma em sua forma desacetilada. Não fluorescente DCFH transforma a fluorescente DCF por uma variedade de radicais ROS e, portanto, serve como um marcador intracelular sensível para o stress oxidativo [29]. A Figura 3A apresenta os resultados da análise de níveis de ROS nas células vivas. Nas células de controlo não tratadas, o DCF difusamente corante associa com a superfície da célula, e pode ser removido da membrana por lavagem PBS. A maioria das fontes comuns de ROS, na membrana celular são enzimas da família NOX [30]. Em células tratadas com ADNg (50 ng /mL), H2DCFH-DA mancha visualiza tanto a membrana e uma certa quantidade de grânulos intracelulares. O PBS de lavagem não influenciar a coloração dos grânulos citoplasmático. Padrões de grânulos DCF e rotulados gDNA
manchas vermelhas sonda cerca de sobreposição (Figura 3C), possivelmente indicando que uma interação de gDNA com alguns constituintes celulares estimula ROS biossíntese no local de contato. Esta observação alinha bem com a hipótese anteriormente afirmado que ecDNA pode estimular alguma forma directamente a actividade enzimática das proteínas de NOX [5]
А -. Microscopia à base de avaliação de MCF-7 Células sequencialmente tratados com o ADN (50 ng /ml) e H2DCFH-DA (controlo, ADNg, ADNg
boi [1]) e incubados durante 30 minutos (x100). Alternativamente, as células MCF-7 foram incubadas com o ADN (50 ng /mL) durante 1 hora seguido da adição de H2DCFH-DA e a fotografia 30 minutos mais tarde (ADNg
boi [2]). B – células MCF-7 expostas a ADNg
boi (0,5 h; 50 ng /ml), foram sequencialmente tratados com Mito TMRM-rastreador (15 min) e H2DCFH-DA (15 min) (x200). C – Co-detecção da sonda marcada gDNA
vermelho (50 ng /mL) e DCF após 30 minutos de incubação. D – Os resultados de quantificação de fluorescência usando leitor de placas [1]. A cinética de tempo de saídas de fluorescência nas células tratadas sequencialmente com H2DCFH-DA e, três minutos mais tarde, uma amostra de ADN a uma concentração final de 5 ou 50 ng /ml [2]. O mesmo para células pré-tratadas com o DNA (concentração final de 5 ng /mL) durante uma hora, com a subsequente adição de H2DCFH-DA. *) P 0,05 contra o grupo de controlo de células, não paramétrico U-test.
em células tratadas com ADNg
OX (50 ng /ml), grânulos intracelulares produtoras de ROS surgem rápido, e os seus números são substancialmente maiores do que nas células tratadas com ADNg (Figura 3A, inserir ADNg
OX [1]). Estes eventos são acompanhadas por alterações na morfologia das células MCF-7, incluindo um aumento no tamanho dos núcleos e do citoplasma do inchamento. É importante notar que as respostas celulares são observados rápida e de vida curta. alterações descritas nos padrões de coloração e morfologia das células são vistos apenas em caso de adições sequenciais de H2DCFH-DA e gDNA
OX para MCF-7 mídia. Quando as células foram pré-tratadas com ADNg
OX durante 1 hora, em seguida, estudou usando а corante H2DCFH-DA, o número de grânulos de ROS de síntese observados em células era inferior e suas intensidades foram menos brilhante do que no caso de não pré-tratamento protocolo (Figura 3А inserir gDNA
OX [2]). Ainda mais interessante, no protocolo de pré-tratamento, algumas células parou ROS biossíntese em tudo, e tornou-se ainda menos brilhante células controle, então não tratados (células mais escuras que são menos fluorescente do que o fundo (Figura 3А inserir gDNA
OX (b )).
Os fenómenos observados foram confirmadas independentemente, em um estudo da cinética de geração de DCF utilizando quantificação com um leitor de fluorescência (Figura 3D). Quando as células MCF-7 foram tratadas com ADN imediatamente após a adição de H2DCFH-dA de observou-se a mídia, um aumento dramático na intensidade da DCF fluorescência. Estes aumentos foram as mais altas taxas de crescimento durante primeiros 20 minutos após a adição de DNA para a mídia (k1 coeficiente), depois, com o tempo, esses índices caem ( coeficiente K2) (Figura 3D [1], inserir Tabela) K1 e K2 coeficientes foram dependentes do tipo e concentrações de tratamento de DNA:. ADNg
OX (5 ng /mL) ADNg (5 ng /mL) ADNg
OX (50 ng /mL) ≥ ADNg (50 ng /mL) . controlar estes efeitos não foram observados quando as células foram pré-tratadas com o DNA durante 1 hora antes da adição de H2DCFH-dA (Figura 3D [2]).
Tomados em conjunto, os resultados destas experiências indicam que o tratamento com ADNg
OX induz rapidamente ROS biossíntese em células MCF-7. Em paralelo, o processo inverso da supressão da produção de ROS, ou ROS têmpera, é iniciada. Quanto maior a quantidade de gDNA
OX foram adicionados aos meios de comunicação, o mais rápido foi o desenvolvimento de ROS têmpera.
A maior parte do intracelular ROS é gerado pela mitocôndria. Um aumento no metabolismo oxidativo em mitocôndrias pode levar à difusão de ROS no citoplasma e subsequente aumento na detecção perimitochondrial de ROS por DCF. Para testar esta hipótese, foram sequencialmente corada das células expostas a 50 ng /mL de ADNg
OX durante 30 minutos com Mito-rastreador (TMRM vermelho) e DCF (Figura 3B). Uma maioria de Mito-rastreador e o sinal de DCF foram localizados próximos uns dos outros, com sobrepõe parcialmente (sinal amarelo, Figura 3B). Em células intactas, H2DCFH-DA não mancha mitocôndrias (Figura 3А, controle). As nossas observações indicam que nas células expostas ao ADN oxidado, uma maioria de ROS endógena é gerado pela mitocôndria.
3. Exposição togDNA
OX estimula um aumento nos níveis de modificação oxidativa das «células próprio DNA
É provável que a produção de ROS intensiva observada imediatamente após a exposição das células a ADNg
OX pode resultar na danos no DNA celular. Para visualizar este dano, as células MCF-7 fixadas foram coradas com anticorpos-8-oxodG anti marcado com PE (Figura 4). Em comparação com células não tratadas de controlo, em células MCF-7 culturas tratadas com quer ADNg ou ADNg
OX, foram aumentadas as quantidades de células coradas (Figura 4A (x20). Em ampliações maiores, três tipos de padrões de coloração pode ser detectados (Figura 4B):. (1) – de coloração nuclear; (2) – coloração citoplasmática; (3) – de coloração para micronúcleos em populações não tratadas de controlo de células MCF-7, PE-anticorpos marcados anti-8-oxodG predominantemente micronúcleos mancha. em populações tratadas com gDNA
OX, houve um aumento nos valores de células com coloração nuclear (Figura 4E). Como nossas experiências anteriores mostraram que gDNA
red-OX está localizado no citoplasma e não faz penetrar no núcleo, de coloração observada de núcleos deve ser atribuído aos danos do próprio DNA “célula
-. células coradas com anticorpos anti-8-oxodG marcado com PE e DAPI (x20) B -. Três tipos distribuição de mancha anti-8-oxodG observada em células tratadas com ADNg
OX (x100). As células foram incubadas com as amostras de DNA durante 1 hora, fixadas com 3% de formaldeído, permeadas com Triton X100 a 0,1% e coradas com anti -8-oxodG (anticorpos secundários conjugados com PE). C – co-localização de 8-oxodG com mitocôndrias. As células foram incubadas com ADNg
OX durante 0,5 horas, обработаны Mito-rastreador (30 nM, 15 minutos), fotografado, então fixadas com 3% de formaldeído, permeadas com 0,1% de Triton X100, corados com anti-8-oxodG anticorpos (anticorpos secundários conjugados com FITC) e fotografados outra vez. D – Teor de 8-oxodG em células expostas de ADN pré-tratados com NAC (análise FACS). As células foram incubadas com NAC (0,15 mM) durante 30 min, em seguida, expostos a ADNg
OX durante 1 hora e analisadas utilizando anticorpos anti-8-oxodG (anticorpos secundários conjugados com PE). a fluorescência de fundo foi quantificada usando anticorpos secundários conjugados com PE. E – proporções relativas dos núcleos corados para 8-oxodG em células não tratadas de controlo, as células expostas a ADNg, as células expostas a ADNg
OX (colunas cinzentas). coluna de cinza claro reflete células pré-tratadas com NAC e expostos a gDNA
OX. * P 0,05 contra o grupo de células controle, não-paramétrico U-teste.
Um aumento da biossíntese mitocondrial do ROS em gDNA
células OX expostos demonstrado acima (Figura 3В) pode levar a um aumento do nível de oxidação em DNA mitocondrial que, por sua vez, podem explicar observada coloração citoplasmática para ADNg
vermelho-OX mostrado na Figura 1C. Na Figura 4C, pode-se ver que alguns sinais de 8 oxodG não fundir-se com gDNA
red-OX. Em células pré-tratados com antioxidante N-acetil-cisteína (NAC) (0,15 mM) durante 30 minutos antes da exposição ao ADNg
OX, os níveis de oxidação em ADN celular foram substancialmente mais baixos do que em células não tratadas com a NAC (figura 4D e 4E).
4. A exposição a gDNA
OX estimula um aumento na rupturas dos filamentos em ‘células próprio DNA
Uma das característica bem conhecida da oxidação do DNA é uma acumulação de quebras de DNA vertente simples e dupla (SSB e DSB). Para quantificar SSBs e LAP em células MCF-7 expostos a qualquer gDNA ou gDNA
OX, foram empregados eletroforese cometa em condições alcalinas (Figura 5А). Três tipos de núcleos foram enumeradas: núcleos com ADN intacto (Figura 5А [1], Tipo I); núcleos com algum grau de fragmentação da cromatina (Tipo II); núcleos com fragmentação de ADN significativa (Tipo III). Na maioria dos casos, os núcleos de controlo não tratados são classificados como Tipo I ou Tipo II, Tipo III, enquanto os núcleos são predominantes em células tratadas com ADNg
OX. Dependendo do tempo, as células foram expostas a ADNg
OX, as proporções de núcleos do tipo III pode ser diferente. Figura 5A apresenta também os momentos cauda de cometa [2] e DNA% tail [3]. Após 30 minutos de incubação de células MCF-7 com gDNA
OX, as quantidades de DNA quebras de aumentar drasticamente, enquanto o tratamento semelhante com gDNA leva a elevação moderada dos níveis de cromatina de fragmentação. Após 2 horas de incubação, quer com gDNA ou gDNA
OX, as quantidades de DNA quebra queda, e seu número cai para abaixo do que a encontrada em respectivas populações específicas de porta em células não tratadas de controlo.
А – teste do cometa em condições alcalinas [1]. – A fotografia digital dos núcleos com vários graus de danos no DNA [2,3]; – Histogramas cumulativos para momento da cauda e porcentagem de DNA dentro de caudas. A confiabilidade de diferenças com o controle nas distribuições obtidos foram analisados por meio da estatística de Kolmogorov-Smirnov (a tabela mostra os valores de D e α)
B -. Breaks dsDNA em células expostas a gDNA
(OX /ml, 1 hora) 50 ng .Cells foram processadas para coloração por imunofluorescência com anticorpo anti γH2AX (x40) [1] .- Três detectado tipos de núcleos são indicados pelos números: 1- núcleo com múltiplas quebras dsDNA, 2- núcleo com alguns breaks dsDNA, 3- núcleo com DNA intacto [2]. – Exemplo de micronúcleos com quebras dsDNA
С – FACS análise de γ-focos A:. Ali principais frações das células como evidentes em áreas gating R1, R2, R3 [1], a distribuição de γH2AX fluorescência intensidades [2], as proporções relativas de células dentro das áreas gating R1-R3 [3]. * P 0,05 contra o grupo de controlo de células, não paramétrico U-teste.
As observações acima descritas foram independentemente confirmada utilizando uma outra técnica comum para a visualização de LAP, uma imunocoloração com anticorpos contra a histona γH2AX, fosforilada por serina -139. Esta forma de H2AX é conhecido por se acumular rapidamente em loci de ADN que flanqueia o local de DSB [31]. Células MCF-7 coradas com anticorpos conjugados com FITC a Ser-139 fosforilada histona γН2АХ são mostradas na Figura 5B [1]. lâminas coradas também incluiu três populações celulares diferentes de células positivas γН2АХ. Neste experimento, as células foram classificados como células tipo 1 quando tiveram múltiplos focos fosfo-γН2АХ. A maioria das células positivas γН2АХ foram classificados como tipo 2 células (entre 2 e 10 focos distintos γН2АХ por célula) e Tipo 3 células sem sinais da focal coloração γН2АХ fosfo-.
Em γН2АХ anti-manchas , a intensidade de fluorescência global da célula é proporcional ao número de focos γН2АХ por célula, e, portanto, à quantidade de LAP. Utilizando FACS, três áreas fechado, R1 a R3, foram estudados (Figura 5C [1,2]). Células dentro portão R1 tem maior FL1 (γH2AX); isto é interpretado como vários LAP (células de tipo 1, Figura 5B). Portão R2 contém células com numerosos não γH2AX (Tipo 2 células). Portão R3 contém o maior número de células; a maioria destas células se encontram intactos sem LAP (tipo 3 células). Em culturas de células MCF-7, uma exposição a ADNg
OX (1H) conduz a um 1,5-dobras aumento do número de células, no portão R1 que é paralela a uma diminuição no número de células no interior R2. Após 24 horas de exposição a ADNg
OX, as quantidades de células com múltiplas LAP diminuir para níveis abaixo dos que que nas células não tratadas de controlo (Figura 5C [3]). Um tratamento com ADNg evoca tipo semelhante, mas menos pronunciado do que a resposta celular na sua magnitude não atingiu significância quando em comparação com células de controlo não tratadas (p 0,05).
Estas observações indicam que, em células MCF-7, a exposição a curto prazo para gDNA
OX resultados em ambas as quebras de DNA vertente simples e dupla. durações mais longas de tratamento (entre 2 e 24 horas) evocar algum tipo de resposta compensatória que leva a uma diminuição nos níveis de fragmentação de cromatina através de populações de células.
A queda na proporção de células contendo ORL após a exposição de curto prazo ao ADN oxidado ou controlo pode ser explicado quer por a reparação das quebras, ou por apoptose /descolamento de células danificadas, ou ambos. Para avaliar esta possibilidade, que enumerado células que permanecem nos meios de comunicação após a sua remoção da camada celular, e as células removidas da camada após lavagem com PBS. Em culturas expostas a ADN oxidado durante 2 horas, a proporção de células isoladas permaneceu semelhante para que, em culturas expostas a ADN genómico e as culturas de controlo não tratadas (aproximadamente 2% da quantidade total de células em cultura dada). Foram obtidos resultados semelhantes em experiências destinadas a avaliação directa da apoptose (ver abaixo). Portanto, é provável que a diminuição da proporção de células com LAP observados após exposição a ADNg ou ADNg
OX é devido a um aumento na reparação do ADN.
5. A exposição a ADNg
OX leva a um aumento da instabilidade do genoma
Single- e quebras duplas ADN de cadeia são conhecidos para resultar na perda de estabilidade cromossoma que é especialmente importante em células em proliferação activa [32]. Um estudo aprofundado dos núcleos das células incubadas com gDNA
OX revelou instabilidade cromossômica pronunciada (Figura 6).