Abstract
A nicotina exerce seus efeitos oncogênicos através da ligação aos receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs? ) e a activação das vias de jusante que bloqueiam a apoptose e promover o neo-angiogénese. Os nAChRs do subtipo α7 estão presentes numa grande variedade de células cancerosas e a sua inibição por neurotoxinas veneno de cobra foi proposta em vários artigos e avaliados como uma potencial terapia inovadora do cancro do pulmão. No entanto, uma vez que parte dos resultados publicados recentemente foi retraída, acreditamos que a atividade antitumoral de neurotoxinas veneno de cobra precisa ser independente reavaliado.
Foi determinada a atividade de a-neurotoxinas da
Naja atra
(neurotoxina de cadeia curta, α-cobrotoxin) e
Naja kaouthia
(de longa cadeia de neurotoxina, α-cobratoxin)
in vitro
por medições de citotoxicidade em linhas celulares de cancro do pulmão 5, por ensaio de formação de colónias com α7nAChRs expressar e não expressam linhas celulares e
in vivo
avaliando o crescimento do tumor em uma ortotópico non-Obese Diabetic /Severe Combined imunodeficientes (
NOD SCID
/) modelo de rato sistema utilizando diferentes horários e doses de tratamento.
foi observada redução estatisticamente significativa no crescimento tumoral nos braços de tratamento em comparação com o controle de ambas as toxinas. Paradoxalmente α-cobrotoxin de
Naja atra
mostrou a tendência para aumentar o crescimento do tumor, embora, mesmo nesse caso, a significância estatística não foi alcançada.
Em conclusão nossos resultados mostram que, em contraste com outros relatórios, o nAChR inibidores de α-cobratoxin de
N. kaouthia Comprar e α-cobrotoxin de
N. ATRA
nem suprimiu o crescimento do tumor nem prolongou a sobrevivência dos animais tratados
citação:. Alama A, Bruzzo C, Cavalieri Z, Forlani A, Y Utkin, Casciano I, et al. (2011) A inibição da acetilcolina nicotínica Receptores por Cobra Venom α-Neurotoxinas: Existe uma perspectiva no tratamento do câncer de pulmão? PLoS ONE 6 (6): e20695. doi: 10.1371 /journal.pone.0020695
editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong
Recebido: 10 de dezembro de 2010; Aceito: 07 de maio de 2011; Publicado: 13 Junho 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Alama et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O financiamento foi fornecida pelo Ministério da Saúde italiano (www.salute.gov.it/) e Fondazione Compagnia di San Paolo, Torino (www.compagniadisanpaolo.it/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
as evidências experimentais que sugerem que a neurotransmissão inibidora ou estimuladora está envolvida no desenvolvimento do cancro, a progressão e na resposta a terapia têm vindo acumulada [1]. Com efeito, os componentes de tabaco regulam as funções celulares relacionadas com a transformação celular e estão envolvidas com o vício de fumar e predisposição para o cancro do pulmão e no desenvolvimento de interagir directamente com os receptores de acetilcolina nicotínicos neuronais e não neuronais (nAChRs) [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. a nicotina em si tem câncer de pulmão iniciar recursos limitados, mas podem sustentar o crescimento do tumor e promover a propagação metastática através de suas propriedades anti-apoptóticos e neoangiogênicos [2], [7], [12].
A expressão de nAChRs em células não-neuronais do pulmão, e em particular no epitélio das vias respiratórias, reflecte as múltiplas funções essenciais exercida pelo sistema colinérgico no desenvolvimento do pulmão normal e função de [13], [14]. A este respeito, foi proposto que o papel de nAChRs no cancro do pulmão pode ser semelhante à dos receptores de estrogénio no cancro da mama uma vez que em ambos os casos, o estímulo inadequado dos receptores contribui para o desenvolvimento do cancro [15]. Em vista do elevado nível de expressão de certos subtipos de nAChR em células de cancro do pulmão, em comparação com o tecido afectada circundante [16], [17] e de evidências experimentais que suportam [18], [19], [20], [21] , foi colocada a hipótese de que os antagonistas dos nAChRs, e em particular a-cobra neurotoxinas, pode ser explorada como potenciais agentes terapêuticos [22], [23], [24]. No entanto, o conhecimento limitado da funcionalidade e dos efeitos a longo prazo da estimulação destes receptores em células cancerosas [2], [25], [26] e, mais importante, a recente retracção de um relatório que suportam os efeitos antitumorais de cobra α-neurotoxinas
in vitro
e
in vivo
[27] torna questionável o direcionamento de nAChRs com estas toxinas para o tratamento de câncer de pulmão.
veneno de cobra é constituído por muitos polipeptídeos com múltiplas actividades tóxicos. Entre estes, as toxinas três dedos (TFTs) são os principais componentes e são representados por a-neurotoxinas e citotoxinas. A a-neurotoxinas se ligam a nAChR com diferente especificidade e afinidade: toxinas de cadeia curta (resíduos de ácidos aminados, 60-62 pontes de dissulfureto 4) do bloco do tipo muscular, enquanto que os nAChRs toxinas de cadeia longa (resíduos de ácidos aminados, 66-75 ligações dissulfureto 5 , a quinta ligação estando presente no circuito de polipéptido central), além de nAChR do tipo muscular também bloquear os receptores neuronais [28], [29]. Como um exemplo de toxinas de cadeia curta, α-neurotoxina chamado α-COBr * o * toxina a partir de
Naja atra
veneno de cobra pode ser mencionado. O principal α-neurotoxina de
Naja kaouthia
veneno de cobra chamado α-COBr * um * toxina é um exemplo de toxinas de cadeia longa. As toxinas de cadeia curta são estruturalmente relacionados com as citotoxinas que matam não selectivamente as células [30].
Enquanto a revisão da literatura sobre os efeitos anti-tumorais de α-cobratoxin [18], [19], [20], [21], [22], [27], percebemos que os vários relatórios apresentados grandes diferenças sobre a dosagem da toxina utilizada para o
in vivo
experiências, sobre o número de células injetadas e sobrevivência em ratinhos. Além disso, a presença do nAChR α7 na linha de células utilizadas para os estudos in vivo foi incerto desde resultados conflitantes estão presentes na literatura [22], [31]. Além disso, uma vez que parte dos dados foram retraídos sem motivação específica [27], sentimos necessário re-avaliar as propriedades anti-câncer de neurotoxinas cobra
in vitro
e
in vivo
em um modelo animal clinicamente relevante de cancro do pulmão [18] para se esclarecer estas toxinas poderia ser considerado o protótipo de uma nova classe de produtos naturais com propriedades anti-tumor, tal como proposto [15], [22], [24].
resultados e Discussão
a expressão de α7 nAChR em células A549 e A549-Luc
a interacção entre α-cobratoxin e o receptor nicotínico α7 [32] foi uma das evidências experimentais atrás da lógica de toxinas utilizando veneno de cobra como agentes anticancerígenos [22]. Embora este receptor é expresso num largo espectro de tecidos e linhas celulares, um estudo recente da literatura [22], [31] relataram dados contraditórios sobre a expressão deste receptor em A549, a linha celular utilizada para a
In vivo
ea maior parte do
in vitro
ensaios anticancerígenos em α-cobratoxin. Portanto, como um passo inicial para verificar a actividade de α-cobratoxin em NSCLC, realizou-se um estudo por RT-PCR semi-quantitativo e qPCR para demonstrar a expressão de α7 nAChR em linhas celulares de cancro do pulmão 5. Três das linhas de células utilizadas no presente estudo (A549, H1650 e SK-MES 1) foram os mesmos do conjunto inicial de experiências [18], [19], [20], [27]. Como mostrado na Figura 1, painel A, o receptor nicotínico α7 foi facilmente detectável em A549, H1650 e SK-MES 1, mas não em H1975 e análise CALU 1. A qPCR confirmou a presença de uma quantidade diferente da do ARNm do nAChR α7 em A549, H1650 e SK-MES 1 (Figura 1, Painel B). De acordo com os resultados de RT-PCR, em H1975 e CALU 1 a α7 nAChR transcrição, utilizando a mesma quantidade de ADNc utilizada para todas as linhas celulares, apareceu depois de ciclo 40, um resultado que poderia ser atribuído tanto a um nível extremamente baixo de expressão ou ao ruído de fundo
a) análise Alpha7 RT-PCR semiquantitativa em linhas de células carcinoma de células escamosas adenocarcinoma e NSCLC humano. expressão GAPDH foi utilizado como controle interno para a integridade mRNA e quantificação cDNA. NCI-H1975 e Calu1 são negativos. C: Não há controle modelo. B) qPCR alfa 7 expressão nas mesmas linhas celulares. No eixo y logaritm natural (ln) da mudança vezes. NCI-H1650 foi utilizado como calibrador, GAPDH como gene de referência. Uma UGR de RNA total foi retrotrascibed e a mesma quantidade de ADNc por amostra (2 ul) foi usado (Ct GAPDH compreendida entre 15,65 e 17,65). NCI-H1975 e Calu1 resultou negativo ou com baixíssima expressão devido à Ct 40. C) Análise de Western blot para alfa 7. PC12 foi carregado como controlo positivo. expressão de actina foi utilizada como controlo interno.
A expressão de α7 nAChR ao nível da proteína foi confirmada por análise de Western blot em A549 e células A549-Luc (Figura 1, Painel C).
tem sido relatado que a estimulação de α7 nAChR em células humanas de cancro do pulmão resulta na regulação para cima deste receptor [33]. Nós testamos a influência dos a- neurotoxinas da
N. atra
e
N.kaouthia
sobre o nível de α7 nAChR focando A549 e A549-luc.
A análise qPCR mostrou que o tratamento com α-cobrotoxin ou α-cobratoxin na concentração de 0,003 ^ M, o relatado IC
50 para α-cobratoxin em A549 [20], em conjunto com as concentrações três vezes inferior (0.001 uM) e três vezes mais elevado (0.009 uM), não altera substancialmente o nível de a expressão do receptor nestas linhas de células (variação inferior a duas vezes, Figura S1).
efeitos in vitro de curto de cadeia longa e a-neurotoxinas em linhas celulares de NSCLC
precoce
in vitro
experiências sugeriram que o efeito de α-cobratoxin é dependente da dose e que a elevada selectividade e especificidade desta molécula depende da densidade de α7 nAChR [20], [21]. A este respeito, as células pulmonares não-tumorais, bem como outras células não afectadas primários que expressam baixos níveis de receptores a7 eram notavelmente resistente ao ácido a-cobratoxin tratamento [20].
Para avaliar a actividade citotóxica de α-cobratoxin, que eficientemente se liga ao α7 nAChR (ver Materiais e Métodos) e a especificidade e selectividade da sua acção, foram realizados ensaios de MTT com as de curto e de cadeia longa a-neurotoxinas em presumivelmente sensíveis α7 nAChR-positiva e, presumivelmente resistentes α7 nAChR-negativos linhas de celular. As curvas de dose-resposta foram desenhados para avaliar a concentração da droga reduzindo a sobrevivência. As experiências de citotoxicidade iniciais foram realizadas utilizando concentrações de toxinas que em outras publicações foram relatados para ser eficaz em linhas celulares de NSCLC nAChR-positiva a7 mas não tóxica em células normais (IC50: 0,003 uM para A549, 0,04? M para SK-MES 1 e 1 uM para H1650) [18], [20], [21], [22]. No entanto, a estas concentrações não foi possível detectar uma actividade citotóxica significativa e o IC50 não poderia ser alcançado com qualquer uma das duas toxinas (dados não mostrados).
A concentrações mais elevadas (até 30 uM) a α-cobrotoxin mostrou uma toxicidade dependente da dose não limitada, que permaneceu essencialmente constante em uma ampla gama de concentrações em todas as linhas de células 5 (Figura 2, painel A).
O NSCLC linhas de células A549, NCI-H1975, H1650, CALU 1 e SK-MES 1 foram incubadas durante 72 horas com α-cobrotoxin (0,6-30? M), o painel superior, ou α-cobratoxin (0,75-50? M), painel inferior, e a toxicidade foi medida com o ensaio de MTT colorimétrico. O IC50 foi alcançado apenas com α-cobratoxin.
Em concentrações elevadas o α-cobratoxin mostrou uma toxicidade dependente da dose clara (Figura 2, painel B). No entanto, a concentração IC50 observado em nosso estudo para o A549 e SK-MES 1 2466 e 105 vezes maior do que o relatado em uma publicação anterior [20]. A diferença foi muito mais baixo para H1650 (2,9 vezes) um resultado compatível com a utilização de uma preparação de toxina diferentes.
O efeito tóxico limitado de cadeia curta α-cobrotoxin podia ser explicada pela sua incapacidade para se ligarem ao receptor α7. Surpreendentemente no entanto, o α-cobratoxin também foi eficaz em células de nAChR a7-negativo, sugerindo que a actividade tóxica não é mediada pela ligação da toxina ao receptor α7.
Para confirmar e estender esta observação nós realizada num ensaio de formação de colónias com o nAChR α7 + A549 e com as linhas de células de nAChR-NCI-H1975 a7. Uma vez que o IC50 não foi alcançado com α-cobrotoxin, utilizou-se as duas maiores concentrações testadas por MTT (brometo de 15 e 30 | iM). Para α-cobratoxin utilizamos as concentrações correspondentes ao IC50 para A549 e NCI-H1975 (7. 5 e 3 uM, respectivamente) e concentrações correspondentes a metade e o dobro da IC50. Como mostrado na Figura 3, a actividade clonogénico das duas linhas de células não foi afectada pelo tratamento e pela presença do receptor nach α7.
As linhas de células A549 (α7 AChR +) e NCI-H1975 ( α7 AChR -) foram plaqueadas em 35 mm pratos Petri ou em 24 poços de placas nas densidades de 150 (A549) e 300 (NCI-H1975) células /prato e expostas quer de cadeia longa α-neurotoxina de
Naja kaouthia
, em concentrações de 15 uM, 7,5 uM, 3,8 uM (A549) e 6 uM, 3 uM, 1,5 uM (NCI-H1975), ou de cadeia curta a partir de
Naja Atra
, em concentrações de 30 uM e 15 uM (ambas as linhas celulares). As células tratadas foram então incubadas durante 7-10 dias, até as colónias visíveis formadas.
A activação da cascata apoptótica foi considerado o efeito chave da ligação do α-cobratoxin ao α7 nAChR [18 ], [20], [21], [22]. Tendo em vista as grandes diferenças entre nossos resultados e daqueles publicados anteriormente sobre a dosagem em que a IC50 pudesse ser obtida ea ausência de ação seletiva de α-cobratoxin em células nAChR positivo a7, tentamos entender se a ativação da apoptose, de fato ocorre após tratamento com α-cobratoxin por anexina V-PI coloração de citometria de fluxo. Relatou-se que a indução máxima de apoptose em células A549 pode ser obtido por tratamento com uma toxina uM durante 24 horas [18]. Repetimos a mesma experiência, utilizando a mesma metodologia, mas com concentrações de toxina (1, 10 e 50 uM), que induziu inibition crescimento variando de 5 a 87% em ensaios MTT.
Como se mostra na Figura 4, mesmo em a concentração mais elevada muito poucas células (1-3%) apresentou evidências da apoptose com células necróticas sendo prevalente.
células foram incubadas durante 24 horas com 1, 10 e 50 uM α-cobratoxin e a apoptose foi avaliada por Anexina coloração V-PI e separação por FACS. Apoptose em células não tratadas foi de 0,63% e nas células tratadas estava na gama de 0,98-2,32%.
geral estes resultados sugerem que a morte celular observada in vitro é provavelmente o resultado de necrose em vez da activação da via apoptótica após a ligação do α-cobratoxin para o seu ligando específico.
In vivo
toxicidade de a-neurotoxinas
a toxicidade aguda de doses crescentes de toxinas depois iv administração (como em M M) foi avaliada em ratinhos CD1 com base em sinais clínicos e comportamentais. Os sintomas agudos desenvolvido dentro de 15 minutos após a injecção e foram caracterizados principalmente por desconforto geral e desconforto respiratório que restaurado para as condições normais dentro de 60-180 minutos. Com base no número de ratinhos CD1 mortos, após a administração de qualquer das α-cobrotoxin ou α-cobratoxin e ao longo de um período de observação de 14 dias, os valores de LD foram determinados e a MTD identificado como 0,1 mg /kg para α-cobrotoxin e 0,2 mg /kg para α-cobratoxin como mostra a Tabela 1.
importante, o DL50 para α-cobrotoxin determinada em nosso estudo (0,128 mg /kg) foi muito boa concordância com os dados da literatura (0,1 mg /kg: https://www.uniprot.org/uniprot/P60770). A DL50 observada para α-cobratoxin foi de 0,35 mg /kg, um valor da mesma ordem de grandeza dos dados da literatura (0,1 mg /kg; https://www.uniprot.org/uniprot/P01391).
os relatórios sobre a toxicidade in vivo de α-cobratoxin são confusas e na literatura recente observou-se que a concentração de DL50 relatado em três publicações diferentes a partir do mesmo grupo difere de 1000 vezes (0,15 mg /kg ou 0,15 ug /kg ) [18], [21], [22]. Os resultados obtidos no presente estudo são essencialmente de acordo com os de dois dos relatórios anteriores [18], [21] e, sobretudo, demonstrar a atividade biológica
in vivo
de nossas preparações de toxina.
Metade da MTD para cada toxina (0,05 e 0,1 mg /kg, respectivamente) foram, em seguida, utilizados em um dos dois protocolos de tratamento concebido para avaliar a actividade anti-tumoral in vivo destas toxinas.
a actividade antitumoral de a-neurotoxinas
Para avaliar a actividade antitumoral de ambas as toxinas,
NOD /SCID
ratos foram transplantados ortotopicamente com 0,5 × 10
6 células A549-luc humanos /num volume de 10 ul de PBS em pulmão direito. Tal como marcador substituto do crescimento do tumor foi medida a emissão de luz das células A549 luciferase marcado com; este sistema permitiu-nos longitudinalmente siga cada animal e para monitorar o efeito do tratamento.
Na sequência da avaliação dos implantes tumorais, por detecção IVIS, os ratos foram distribuídos aleatoriamente a um dos grupos de estudo e tratamento iniciado 7 dias após o transplante ortotópico de acordo com os dois protocolos diferentes descritos na Figura 5.
os ratinhos foram injectados com 0,5 × 10
6 células A549-Luc humanos. No dia 7, após a determinação IVIS, os animais foram distribuídos aleatoriamente e submetidos a tratamento. Para um cronograma, os ratinhos foram tratados com 1/1000 da DL10, tal como indicado em [20] três vezes /semana, durante três semanas. Para cronograma 2, os ratos foram tratados uma vez por semana com uma dose correspondente a ½ MTD (determinado no presente estudo)
Protocolo. 1: 8 animais foram designados para receber intravenosa 0,12 ug /kg de toxina (1/1000 do LD
10 indicado em [20]), três vezes por semana durante três semanas, de acordo com uma programação previamente relatada [20] e 8 animais recebeu veículo sozinho.
Protocolo 2: 8 animais foram tratados iv uma vez por semana durante três semanas com 0,05 mg /kg de α-cobrotoxin ou 0,1 mg /kg de α-cobratoxin (correspondente a meia-DMT). Para α-cobratoxin a meia-DMT corresponde a 12,8 | iM, uma concentração que
in vitro
deve matar entre 50 e 63% das células A549. Oito animais de controlo receberam veículo sozinho.
Em outra publicação [18], onde o tempo-calendário de Protocolo 1 foi utilizado, a dosagem α-cobratoxin relatado foi de 0,12 mg /kg. Com base no nosso
in vivo
determinação toxicidade consideramos esta dosagem muito alta para ser administrado durante três dias consecutivos a ratos com insuficiência respiratória.
Depois de uma avaliação inicial do crescimento do tumor no dia 7, a actividade anti-tumoral induzida por toxinas foi avaliada em ratos tratados e não tratados, nos dias 14, 21 e 28 após a administração em ambos os protocolos. Temos observado que, nas fases iniciais do crescimento, o bioluminiscence dos animais representada estreitamente a extensão do crescimento do tumor. Por outro lado, em fases posteriores, de necrose tumoral e perfusão reduzida, provavelmente diminuiu a emissão de luz em ratos, mesmo quando o tumor havia invadido completamente a cavidade torácica e, na maioria dos casos, tinha estendido fora do tórax.
O pré avaliação do tratamento IVIS dos 56 ratinhos incluídos no estudo ao dia 7 apresentaram um crescimento de tumor bem sucedida em todos os animais, apesar de um 300 vezes variabilidade individual (emissão média de fotões: 5,5 × 10
7 /murganho, escala de 6,68 x 10
5-2,06 × 10
8). Portanto, para a análise dos dados, foi considerada a fold-mudança de emissões entre os animais tratados e não-tratados em cada ponto de tempo de tratamento (14, 21 e 28 dias), em vez de os valores de emissão de fótons absolutos [18].
na Figura 6, relatamos a determinação IVIS cru em cada camundongos tratados com α-cobrotoxin acordo com a programação 1 e no grupo de controle correspondente. Como mostrado, este tratamento não parecem ter um efeito considerável sobre o crescimento tumoral neste sistema modelo animal. A única diferença notável aparente era o número de animais mortos ao fim do período de observação (4 no grupo de controlo e 2 no grupo de tratamento). No entanto, deve ser notado que, neste momento todos os animais tiveram que ser sacrificados por razões éticas e que autópsia revelou que o tumor tinha estendida para fora da cavidade torácica, em todos os ratos tratados e não tratados. Como mostrado na Figura 7 também nas doses mais elevadas utilizadas no plano de tratamento da Tabela 2, o efeito de α-cobrotoxin como agente anti-tumoral foi insignificante, se algum. Como para o plano de tratamento programação 1, também estes animais foram sacrificados no dia 28, devido a sintomas relacionados com o crescimento tumoral. De fato, na autópsia todos os animais apresentaram uma cavidade torácica completamente invadida por tumores que se estendem fora do peito, independentemente do regime de tratamento.
X denota os animais mortos.
X denota os animais mortos.
na Figura 8 é relatada a média fold-change da emissão no tratamento e controle de armas para a programação 1 (Painel a) e do anexo 2 (Painel B). Embora a diferença, avaliado pelo teste de Mann-Withney, não atingiu significância estatística (excepto para um cronograma, dia 14, p = 0,04), observou-se uma maior emissão marcante no grupo de tratamento com a toxina com respeito ao braço de controlo. Este efeito foi dramaticamente evidente no esquema de 2 a 28 dias, embora, a diferença na emissão de fotões não atingiu significância estatística, provavelmente por causa do número limitado de animais,
Painel A: murganhos tratados com α- cobrotoxin acordo com a programação 1. Painel B: ratos tratados com α-cobrotoxin acordo com a programação 2. Painel C: ratos tratados com α-cobratoxin de acordo com os horários 1 e 2.
Os mesmos esquemas de tratamento foram também utilizada com a α-cobratoxin. Os resultados deste conjunto de experiências mostraram que esta toxina não possui actividade antitumoral bem como evidente. Na Figura 9, relatamos a determinação IVIS cru para cada camundongos tratados com α-cobratoxin de acordo com os horários 1 e 2, enquanto na Figura 8, Painel C, mostramos a fold-change médio de emissões no controle e ratos tratados. Como pode ser observado, o tratamento não influencia significativamente o crescimento do tumor como a emissão de fotões, em ratinhos tratados foi comparável à dos controlos, em cada ponto de tempo. O número de animais que tiveram que ser sacrificados por motivos humanitários antes do final do período de observação foi mais elevada no controlo em comparação com os ratinhos tratados. No entanto, deve-se salientar que também neste caso todos os animais, no dia 28, apresentou crescimento tumoral maciça que se estendeu fora da cavidade torácica independentemente do plano de tratamento.
X denota os animais mortos.
o
in vivo
experimentos foram realizados apenas com a linha celular A549-Luc uma vez que a utilização de não-Luc com a etiqueta células teria exigido um grande número de ratos para avaliar a actividade antitumoral da toxinas. Tendo em vista os resultados obtidos
in vitro
em 5 linhas celulares e
in vivo
com A549-luc foi considerado antiético para preceder com estudos animais adicionais
A base molecular cancro do pulmão têm sido extensivamente estudado e a interacção entre a nicotina e os nAChRs tem sido reconhecida como um dos principais eventos que conduzem ao desenvolvimento deste tipo de tumor [2], [4], [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11], [16], [26]. Assim, não é surpreendente que nAChRs foram considerados como bons alvos candidatos para terapias inovadoras “biológicos” [15], [22], [23], [24]. A este respeito, a existência de toxinas potentes que inibem receptores Nach pode abrir a possibilidade de adaptar o conceito “bala mágica” de Paul Ehrlich para terapia de câncer de pulmão [34].
O veneno da cobra é uma fonte de diferentes toxinas possuindo citolítica e nAChR actividades inibidoras, [35] [32]. Devido a esta última actividade, o α-cobratoxin de
N. kaouthia
tem sido proposta como um agente terapêutico naturais inovador para o cancro do pulmão [18], [19], [20], [22], [24] capaz de inibir significativamente o crescimento do pulmão de células tumorais e para melhorar significativamente a sobrevivência de pulmonar ratos portadores de tumor. Temos re-avaliou as atividades antitumorais de duas neurotoxinas cobra diferentes
in vitro
e
in vivo
utilizando dois esquemas de administração e as mesmas condições experimentais de relatórios anteriores. Os resultados de nossas experiências mostram claramente que estas duas toxinas biologicamente ativas têm essencialmente nenhum efeito sobre o crescimento de células tumorais em
in vitro
ensaios na concentração relatada em outras publicações. Uma inibição do crescimento de células de tumor significativa foi obtida a uma concentração de α-cobratoxin demasiado alta para ser utilizada
In vivo
. É importante salientar a-neurotoxinas, em concentrações utilizáveis
in vivo
, não inibiu o crescimento do tumor, nem foram capazes de prolongar significativamente a sobrevivência em camundongos com uma NSCLC ortotopicamente-enxertado. Na verdade, o
in vivo
experimentos teve de ser interrompida no dia 28, ou mais cedo, em animais experimentais tratados e não tratados por razões éticas uma vez que em todos os casos o tumor enxertado tinha estendido fora do tórax. Estes resultados estão em forte contraste com os de outros estudos que relataram um aumento do tempo de vida de 93% em α-cobratoxin tratado versus ratos não tratados [20] e sugerem que cobra α-neurotoxinas não têm efeito terapêutico potencial no câncer de pulmão.
resta explicou por que em um relatório publicado do mesmo grupo todos os animais tiveram de ser mortos por razões humanitárias no dia 29 [18], enquanto em outro estudo, os animais, tratados de modo semelhante, pode ser seguido até ao dia 170 [20 ], (revisto em [22]).
Surpreendentemente observou-se que o
in vivo
crescimento do tumor nos ratos tratados com α-cobrotoxin foi maior do que a dos grupos de controlo. Este resultado inesperado pode sugerir que embora esta toxina não se liga ao receptor α7, o subtipo predominante relatado presente em células A549, que pode activar a via tumorigénico dependentes de nicotina através da sua ligação a diferentes nAChR (mais provavelmente ao receptor do tipo muscular) . Assim, esta toxina pode ser uma excelente ferramenta para finamente dissecar as vias biológicas onde os nAChRs estão envolvidos
declaração de Ética Materiais e Métodos
Todos os detalhes sobre:. Permissões , regulamentos e bem-estar animal são relatados em “Animals” sub-seção desta seção Métodos
linhas de células do tumor e preparações α-neurotoxina
A linha de células de feocromocitoma de rato PC12, utilizada como controle positivo para α7 expressão nAChR, as linhas celulares de adenocarcinoma de NSCLC humanas H1650 e H1975 foram obtidas a partir de ATCC; o adenocarcinoma A549 NSCLC e as linhas de células de carcinoma escamoso SK-MES 1 e Calu 1, foram obtidos do nosso repositório celular Institucional (ICLC, www.iclc.it). A linha de células A549-luc, modificado para expressar estavelmente luciferase, e utilizada para
In vivo
estudos foi gentilmente cedido pelo Dr. J. W. Shay (H. Simmons Comprehensive Cancer Center da Universidade do Texas, Dallas). O A549, A549-luc, SK-MES 1 e H1650 utilizado no presente estudo teve a mesma origem daqueles utilizados em outros trabalhos publicados [18], [19], [20], [27]. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 com soro bovino a 10%. (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Itália).
A de cadeia curta α-cobrotoxin de
N. ATRA
(MW 6949 kDa) foi obtido a partir de Sigma (Milão, Itália). A DL50 em camundongos do lote utilizado neste trabalho, determinado pela Companhia, foi de 0,09 mg /kg.
O longa cadeia α-cobratoxin (MW 7821 kDa) foi purificada a partir de
N. kaouthia
veneno como descrito [36]. O processo envolve: por filtração em gel, permuta iónica e cromatografia de alto desempenho de fase reversa, e é utilizado para produzir grandes quantidades de toxina para estudos do receptor [37]. O α-cobratoxin preparado por este método é totalmente ativo e inibiu correntes induzidas por acetilcolina em
Xenopus
oócitos que expressam o receptor de acetilcolina nicotínico α7 humana com IC
50 de 4,1 nM [38]. A actividade biológica da toxina do lote utilizado neste estudo, foi testado quanto à capacidade para inibir a ligação ao receptor de acetilcolina nicotínico α7 humano heterologamente expressos em células GH4C1 radioactivos α-bungarotoxina. Aos 20 nM α-cobratoxin inibida α-bungarotoxina a ligação em mais de 50%.
As toxinas liofilizados foram dissolvidos na concentração de estoque de 10
-3 M em fosfato salino tamponado (PBS) e mantidos a -20 ° C.
análise Western blot
As suspensões de células foram obtidos após tripsinização de A549 ou A549-Luc e culturas de PC12 (utilizado como controlo positivo). As células foram dissolvidas em tampão de lise e processado como anteriormente descrito [39]. A concentração de proteína de lisados de células foi determinada pela proteína de Bio-Rad de ensaio (Laboratórios Bio-Rad, Segrate, Itália) de acordo com as instruções do fabricante.
Cinquenta ug de proteínas totais foram separadas em NuPAGE 4-12% bis-Tris gel (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Itália) e, em seguida, transferidos para uma membrana de nitrocelulose por iBlot ™ gel Tranfer Pilhas (Invitrogen).
as manchas foram sondadas com o anticorpo AChR policlonal anti α7 (Santa Cruz, Heidelberg, Alemanha) e subsequentemente com anticorpo monoclonal anti-ßActin (Sigma, Milão, Itália), para determinar que uma quantidade igual de proteína foi carregada em cada faixa.
a imunodetecção foi realizada utilizando a quimioluminescência aumentada (ECL) kit (GE Healthcare, Milano, Itália) seguindo os procedimentos recomendados pelo fornecedor.
TA e qPCR análise
o ARN total a partir de A549-Luc (não tratados e tratados com 1, 3 e 9 nM de α- cobratoxin ou α-cobrotoxin durante 72 h), A549 (não tratados e tratados com 1, 3 e 9 nM de α-cobratoxin), H1650, H1975, SK-MES 1, Calu 1 e de células PC12 linhas foi isolado utilizando o Kit de RNAeasy Mini (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. O ARN foi tratado com ADNase isenta de RNase durante a purificação em coluna. a integridade de ARN foi avaliada por electroforese em gel de: razão de 28S a 18S foi de aproximadamente 02:01. O ARN foi quantificado por espectrofotometria. A razão entre as leituras a 260 nm e 280 nm foi compreendida entre 1,9 e 2,1.
Um? G de ARN total foi utilizado para preparar ADNc com o SuperScript II RNase H- ™ Trascriptase Reversa (Invitrogen) de acordo com a instruções do fabricante.
Para determinar a presença de α7 nAChR em linhas celulares, o ADNc foram utilizados numa reacção de semiquantitativo como descrito noutro local [40], [41], [42].
as condições de PCR foram:. 95 ° C durante 10 min, 45 ciclos de 95 ° C durante 15 seg, 55 ° C durante 15 seg e 72 ° C durante 30 seg)
qPCR reacções foram realizadas utilizando Maxima Sybr mistura verde mestre qPCR .