Abstract
O câncer de bexiga representa uma carga significativa de tumor humano, representando cerca de 7,7% e 2,4% de todos os casos de câncer em homens e mulheres, respectivamente. Enquanto os homens têm um risco maior de desenvolver câncer de bexiga, as mulheres tendem a apresentar numa fase posterior da doença e com tumores mais agressivos. Estudos anteriores sugeriram um papel promocional de sinalização de andrógeno na melhoria do desenvolvimento do cancro de bexiga. Para avaliar diretamente o papel dos andrógenos em tumorigênese bexiga, temos desenvolvido uma nova estirpe de ratinho transgénico,
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
, em que o ser humano
AR
transgene é condicionalmente expressa em urotélio da bexiga. Curiosamente, ambos os sexos masculino e feminino
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
CGE /+
ratos exibir uma maior incidência de carcinoma urotelial (UCC) do que a idade e sexo correspondentes da mesma ninhada de controlo em resposta ao agente cancerígeno, N-butil-N- (4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN). Nós detectar a expressão do humano
AR
transgene em células basais CK5-positivos e p63-positivas em urotélio da bexiga. Outras análises de tecidos UCC de
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
camundongos mostraram que a maioria de células de tumor são de origem de células basais urotelial. imunocoloração positiva da proteína transgénica AR foi observado na maioria das células tumorais dos murganhos transgénicos, fornecendo uma ligação entre a expressão transgénica AR e transformação oncogénica. Observou-se um aumento das células positivas Ki67 nas lesões UCC de ratos AR transgênicos. Manipulando os níveis de andrógenos endógenos de desenvolvimento do tumor de bexiga castração e suplementação de andrógenos diretamente afetados no masculino e feminino
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
CGE /+
ratos, respectivamente. Tomados em conjunto, os nossos dados demonstram, pela primeira vez que a activação condicional de expressão transgénica AR em urotélio bexiga melhora a formação de tumor da bexiga induzida por carciongen em ratinhos. Esta nova linha de rato transgénico AR imita certas características do câncer de bexiga humana e pode ser usado para estudar tumorigênese bexiga e para o desenvolvimento de drogas
Citation:. Johnson DT, Hooker E, Luong R, Yu EJ, Ele Y, Gonzalgo ML, et al. (2016) expressão condicional do receptor andrógeno aumenta a susceptibilidade de câncer de bexiga em ratos. PLoS ONE 11 (2): e0148851. doi: 10.1371 /journal.pone.0148851
editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos
Recebido: 18 de novembro de 2015; Aceito: 25 de janeiro de 2016; Publicação: 10 de fevereiro de 2016
Direitos de autor: © 2016 Johnson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte Informações
Financiamento:.. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde concede R01CA070297, R01CA151623, R01CA166894, R21CA190021 e R01DK104941
interesses concorrentes: os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
o câncer de bexiga representa uma carga tumoral humana significativa, com mais de 70.000 novos casos de câncer de bexiga diagnosticados no país anualmente, resultando em aproximadamente 16.000 mortes [1]. É responsável por cerca de 7,7% e 2,4% de todos os casos de câncer em homens e mulheres, respectivamente [1]. No entanto, as taxas de mortalidade de pacientes do sexo masculino e do sexo feminino são, aproximadamente, 20,4% e 25,4%, respectivamente [2]. A evidência acima sugere que os homens têm um maior risco de cancro da bexiga, enquanto as mulheres tendem a ter tumores mais agressivos. Atualmente, os mecanismos moleculares subjacentes a estas diferenças de género na tumorigênese da bexiga não são claras.
sinalização de andrógeno desempenha um papel promocional no crescimento do câncer de próstata, e, portanto, a terapia de ablação de androgénios é um tratamento eficaz para pacientes com câncer de próstata naïve [3 ]. Evidências também implicado um papel importante da sinalização de andrógeno na bexiga tumorigênese [4-7]. A expressão do receptor de androgénio (AR) foi detectado em ambos murino, bem como urotélio bexiga humana e submucosa [7, 8]. Estudos anteriores sugeriram que a sinalização de androgénio pode aumentar directa ou indirectamente o desenvolvimento do cancro da bexiga [7]. Diminuição da incidência tumor da bexiga tem sido observada num modelo de rato de abate Ar (ARKO) [5, 7]. No entanto, verifica-se que não existe uma correlação significativa entre os tipos de tumores e os níveis de expressão em amostras de doentes de AR clínicos [8, 9]
Um sistema de modelo de rato induzida por carcinogénico tem sido frequentemente utilizada para investigar o desenvolvimento das células uroteliais carcinoma (UCC). Os ratos expostos a N-butil-N- (4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN) desenvolver um espectro de patologias da bexiga, incluindo os carcinomas do músculo-invasivo, carcinoma de células não-invasivo, carcinoma de células escamosas, e hiperplasia [10, 11]. Curiosamente, neste modelo de ratinho, um dimorfismo sexual clara na carcinogénese da bexiga tem sido observado [7, 10]. A incidência de cancro da bexiga em ratos machos foi cerca de duas vezes maior do que nos ratos do sexo feminino [7]. Além disso, nem homem nem mulher ratos ARKO desenvolveu carcinoma da bexiga após 12 semanas de exposição a BBN [7]. Similar ao de corpo inteiro ratos Ar knockout, ratos do sexo masculino com eliminação condicional de Ar no urotélio da bexiga por uroplakin II (UPII) promotor impulsionado Cre foram menos suscetíveis ao desenvolvimento de carcinoma da bexiga induzida por BBN [5]. Além disso, diminuição da bexiga urothelium proliferação celular foi observada em ambos full-corpo e camundongos knockout Ar-specific uroteliais [5, 7]. Estes estudos implicam um papel para a sinalização promocional androgénio na transformação oncogénica de urotélio bexiga.
Uroplakin 3a (UPK3A) pertence à família uroplakin, um grupo de proteínas de membrana integrais [12]. A expressão de proteínas, incluindo UPK UPK3A, tem sido observada na superfície luminal do urotélio [13, 14]. UPK3A camundongos nulos mostrou os fenótipos de refluxo vesico-ureteral primário (RVU) e hidronefrose [12].
UPK3A
GFP /cre /ERT2 /+
(UPK3A
GCE /+
)
camundongos transgênicos expressar uma (proteína fluorescente verde melhorada e Cre-ERT2) eGFPCreERT2 proteína de fusão sob o controle do mouse
uroplakin 3a
(
UPK3A
) promotor. Nesta estirpe rato, induzida por tamoxifeno atividade recombinase Cre foi detectado no urotélio da bexiga de hemizigotos neonatal [15].
Para avaliar diretamente o papel biológico de sinalização de andrógeno na tumorigênese da bexiga, que recentemente gerou um AR condicional linha de rato transgénico,
R26hAR
LoxP
, em que um ser humano
AR
transgene foi especificamente visada no locus ROSA26,
R26hAR
LoxP /+
[16, 17]. O
AR
transgene neste modelo de ratinho pode ser expressa de forma constitutiva de uma forma específica de tecido através da ativação de
Cre recombinase
[18]. Nós cruzam o
R26hAR
LoxP /+ Comprar e
UPK3A
CGE /+
ratos, a fim de direcionar a expressão indutível da
AR
transgene ao urotélio da bexiga. Ambos os sexos masculino e feminino
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
CGE /+
ratos mostraram aumento da susceptibilidade à BBN- induzida carcinoma urotelial (UCC) desenvolvimento após a expressão condicional do
AR
transgene. A expressão de ambos citoqueratina 5 (CK5) e p63, marcadores celulares de células basais na urotélio da bexiga, é detectado em células tumorais de lesões UCC. Manipulando os níveis de andrógenos endógenos de desenvolvimento do tumor de bexiga castração e suplementação de andrógenos diretamente afetados no masculino e feminino
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
CGE /+
ratos, respectivamente. Tomados em conjunto, os nossos dados demonstram pela primeira vez que a ativação condicional de expressão AR transgênico no urotélio da bexiga aumenta a formação de tumores da bexiga induzida por substância cancerígena em camundongos.
Materiais e Métodos
Experimentos mouse
Os ratos
R26hAR-floxed foram geradas como descrito anteriormente [18]. Para gerar o condicional
AR
camundongos transgênicos, que cruzam
R26hAR
ratinhos loxP /p
com o
UPK3A
GCE /+
estirpe (JAX estoque: 015855). Para genotipagem, pontas da cauda do rato foram isolados entre a idade de 2-3 semanas, e incubadas em tampão de lise (Cat # 102-T, Viagen Biotech, Los Angeles, CA) durante a noite a 55 ° C. As amostras foram brevemente centrifugadas e o ADN genómico foi dissolvido em tampão TE. Três iniciadores que podem distinguir o tipo selvagem de alelo do alvo AR foram usadas para a amplificação de PCR genómico. O iniciador de sentido directo, 5′-CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT-3 ‘, foi utilizado para o tipo selvagem e os alelos alvo, e o iniciador inverso para o alelo de tipo selvagem foi 5′-CGAGGCGGATCACAAGCAATA-3′, e para o alelo alvejado foi 5’-TCAATGGGCGGGGGTCGTT- 3 ‘. Os fragmentos de PCR para a genotipagem foram amplificadas a 94 ° C durante 5 min, em seguida 94 ° C durante 20 seg, 64 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 25 seg durante 30 ciclos, em seguida 72 ° C durante 2 min. Para avaliar a recombinação, o iniciador de sentido directo 5’-TTCGGCTTCTGGCGTGTGAC-3 ‘e o iniciador inverso 5′-GCTGTGATGATGCGGTAGTC-3’ foram utilizados em reacções de PCR genómicos. Os fragmentos de PCR foram amplificados a 95 ° C durante 5 min, em seguida 95 ° C durante 45 seg, 63 ° C durante 50 seg, e 72 ° C durante 2 min durante 40 ciclos, em seguida 72 ° C durante 5 min.
Para experiências de castração e de inserção da pelota de testosterona, tanto
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
ratos e seus companheiros de ninhada de controlo foram anestesiados por injecção IP com Cetamina e Xilazina. Castrar camundongos machos, ambos os testículos e epidídimos foram removidos através de uma abordagem escrotal. A extremidade distai do cordão espermático foi ligado com sutura de seda, tal como descrito anteriormente [19]. Para inserção da pelota, foram anestesiados ratos do sexo feminino, como descrito acima. O sedimento de testosterona foi inserido por via subcutânea na parte de trás na nuca do pescoço. Todos os experimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Painel Administrativo de Laboratório Animal Care na Universidade de Stanford.
Injection Tamoxifen e Tratamento BBN
Ambos 5 semanas de idade
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
CGE /+
ratos e seus littermates controle foram administrados tamoxifeno em óleo de milho, cerca de 5 mg /25 g de peso corporal, por injecção IP cinco vezes dentro de um período de três semanas. Após a última injecção, com 8 semanas de idade, os ratos receberam água da torneira contendo 0,1% de N-butil-N- nitrosamina (4-hidroxibutil) (BBN) ad libitum (TCI America, Portland, OR) durante 12 semanas, e em seguida, a água normal durante uma semana antes da análise. Os ratinhos foram sacrificados e as bexigas urinárias e outros tecidos anormais foram recolhidas e conservadas em 10% de formalina tamponada neutra. tecidos de rato foram embebidos em parafina, seccionados e corados com hematoxilina e eosina (H E). Pelo menos três slides individuais de cada rato foram preparados e avaliados para anomalias patológicas.
A imuno-histoquímica, imunofluorescência, e análises histológicas
tecidos de camundongos foram fixados em formalina a 10% neutra tamponada e processada em parafina para imuno-histoquímica. As amostras foram cortadas em secções de 5 um, desparafinados em xileno e re-hidratadas utilizando um gradiente decrescente de etanol seguido de PBS. A recuperação de antígenos foi atingida por ebulição secções de tecido em 0,01 M tampão citrato (pH 6,0). Os tecidos foram então bloqueadas com 3% de peróxido de hidrogénio em metanol e proteína bloqueada durante 15 e 30 minutos, respectivamente, para inibir a actividade da peroxidase endógena e a ligação não específica do anticorpo, respectivamente. As amostras foram expostas a uma diluição de anticorpo anti-AR humano (Santa Cruz Biotechnology, sc-7305), 1 1:30: 300 de diluição de anti-rato /AR humano (Santa Cruz, SC-816, N-20), 1 : 300 de diluição de anticorpo anti-p63 (Santa Cruz, sc-8431), 1: 1000 de anticorpo anti Ki67 (Novacastsra, NCL-Ki67), 1: 1000 de anticorpo CK-5 (Covance, PRB-160P), 1: 1000 de anticorpo CK8 (Covance, MMS-162P), em 1% de soro de cabra a 4 ° C durante a noite. As lâminas foram então incubadas com anti-coelho biotinilado, ou um anticorpo secundário anti-rato (Vector Laboratories, BA-1000 ou BA-9200) durante 1 hora e a peroxidase de rábano de estreptavidina (Vector Laboratories, SA-5004) durante 30 minutos à temperatura ambiente, e então visualizadas por kit de DAB (Vector Laboratories, SK-4100). As lâminas foram subsequentemente contrastadas com 5% (w /v) de hematoxilina de Harris. Para análise histológica, cortes seriados 5 mícrons foram processados a partir de xileno à água através de um gradiente de etanol decrescente, corados com hematoxilina e eosina, e processados de volta ao xileno através de um gradiente de etanol a aumentar. Para os ensaios de imunofluorescência, secções 5 mícrons foram fervidas em tampão de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 20 minutos, depois re-xileno a partir de desidratação à água, e bloqueados por soro de cabra a 5%. As secções de tecido foram então incubadas com diluição 1:30 de anticorpo anti-AR humano (Santa Cruz Biotechnology, sc-7305), 1: 300 de diluição de anti-ratinho /AR humano (Santa Cruz, SC-816), ou 1: 100 diluição de anticorpo anti-p63 (Santa Cruz, sc-8343), 1: 1000 de anticorpo CK-5 (Covance, PRB-160P), 1: 1000 de CK8 anticorpo (Covance, MMS-162P), e ou 1: 200 de anti-GFP (Invitrogen, A11122) ou 1: 150 de anti-GFP (Cell Signaling, 2955) em 1% de soro de cabra a 4 ° C durante a noite. De cabra anti-rato Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, A21203), ou de cabra anti-coelho Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A11034) foi incubada a diluição 1: 500 durante 1 hora à temperatura ambiente. As secções foram montadas por meio de montagem Vectashield com DAPI (Vector Laboratories, H-1200). Preparação e análise de amostras de tecido mTmG foi realizada como previamente descrito [20]. Imagens por tudo que ele e imunohistoquímica experimentos deste estudo foram adquiridos em uma Leica microscópio de dissecação (modelo MZ9
5), utilizando software Zeiss Axiovision. imagens de imunofluorescência foram feitas usando um microscópio Olympus BX-52.
Análises Estatísticas
Nós apresentados os dados como a média ± SD. Fizemos comparações entre os grupos usando
t
teste de Student dos dois lados. P 0,05 e P 0,01 foram considerados significativos
Resultados
A expressão de UPK3A no mouse bexiga Urotélio
O
UPK3A
GCE /+
, ratinhos transgénicos que foram gerados através da inserção de uma recombinase Cre-tamoxifeno induzível (CreERT2) e o gene de fusão de eGFP sob o controlo do rato
UPK3A
promotor. Como relatado anteriormente,
UPK3A
CGE /+
ratos parecem fenotipicamente normal, sem qualquer anormalidade [15]. Para identificar as células de expressão UPK3A, geramos
Rosa26-MT /MG
(
R26RmT /MG
):
UPK3A
GCE /+
camundongos pelo cruzamento
R26RmT /mG
[20] e
UPK3A
estirpes GCE /+
rato (Fig 1A). Neste modelo de rato, o tamoxifeno (TM) induzida por Cre actividade pode alternar tdTomato ligada à membrana (MT) para expressão ligada à membrana verde proteína fluorescente (mGFP) através de recombinação dos loci floxed repórter em células-alvo. Nós administrada uma dose de tamoxifeno (TM) ou o controle do veículo a 6 semanas de idade
R26RmT /MG
:
UPK3A
CGE /+
ratos e analisou-los duas semanas após a injecção (Fig 1B). Observou-se expressão específica de expressão mGFP no urotélio da bexiga de TM-induzida
R26RmT /MG
:
UPK3A
CGE /+
ratos, mas não em não induzido controlos (Figura 1C-1E ‘). Tem sido sugerido que adulto urotélio roedor bexiga consiste de três populações distintas de células: o guarda-chuva, o intermediário, e células basais. células de guarda-chuva, também conhecidos como células superficiais, Linha do lúmen da bexiga e uroplakins altamente expresso e CK8, mas não p63 ou CK5 [10]. células intermediárias residem debaixo das células guarda-chuva e expressar ambos os uroplakins e p63, mas não CK5. As células basais mentir ao lado da lâmina própria e que cercam tecidos musculares e CK5 expressa e p63 [21-23]. Utilizando ensaios de co-imunofluorescência, que caracterizado pelo facto adicional da identidade celular de células de expressão mGFP em urotélio bexiga com CK5, Ck8, e anticorpos p63 (Fig 1E-1G “). Observou-se a expressão de CK5 (Fig 1E “), p63 (Fig 1F”), e CK8 (Figura 1G “) revestida com mGFP coloração sugerindo que a maioria das células em urotélio da bexiga são alvo de
UPK3A
CGE /+
ratos [21]
(a) rotulagem demonstrando Schematic Cre-mediada de UPK3A
GCE /+ -. células positivas com o sistema repórter mT /mG. (B) Calendário do tamoxifeno (TM) injecção para a indução Cre recombinação de
R26
mTmG /+
:
UPK3A
GCE /+
ratinhos. (C-C ‘) imagens inferiores e superiores de ampliação de mt rotulados, mtd-tomate, (vermelho) ou MG, mGFP, (verde) no urotélio da bexiga de
R26
mTmG /+
:
UPK3A
/+
antes TM injecção GCE (n = 4). (D-D ‘) imagens inferiores e superiores de ampliação de mt marcado (vermelho) ou mGFP (verde) no urotélio da bexiga em
R26
mTmG /+
:
UPK3A
GCE /+
após a injecção TM (n = 6). (EG) imagens de imunofluorescência de urotélio da bexiga de TM injetados
UPK3A
CGE /+
R26
mTmG /+
ratos co-corados com anticorpos contra GFP (EG “) com p63 (E’-e”), CK5 (F ‘, F “), ou CK8 (G’-G”) (n = 6).
expressão condicional da AR Transgene no mouse bexiga Urotélio
Embora o efeito potencial do Ar foi avaliado anteriormente usando um modelo de camundongo knockout Ar específico do tecido conduzido por modelo UPII-Cre [5], transformação oncogénica mediada por AR na tumorigênese bexiga permanece obscuro. Para abordar diretamente o papel promocional do AR no início e progressão do cancro de bexiga, geramos
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
camundongos (Fig 2A). Como demonstrado no
R26RmT /MG
:
UPK3A
CGE /+
camundongos, a expressão da proteína transgênica AR pode ser induzida em urotélio da bexiga após administração TM. Nós administrada TM para
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
e R26hAR
LoxP /+
controles a partir de 5 semanas de idade (Fig 2B). Usando abordagens de PCR genómicos, que confirmou a actividade de
creer
nos tecidos da bexiga, resultando em um fragmento de PCR de 300 pb correspondente à exclusão da
LSL
cassete através de
loxP /Cre
recombinação nos tecidos da bexiga de
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
ratos com indução TM , mas não naqueles de
R26hAR
LoxP /+
ratinhos com 8 semanas de idade (Fig 2C). Confirmou-se a expressão da proteína AR transgénicos através de imuno-histoquímica com quer um anticorpo (441, Santa Cruz, sc-7305) específico para a proteína transgénica humano AR Har, ou um anticorpo (N-20, Santa Cruz, sc-816) contra ambas humana e proteínas do rato AR, m hAR. Usando estes dois anticorpos diferentes nos permitiu distinguir AR humana transgênica a partir do mouse endógena Ar em tecidos do rato da bexiga. coloração AR Nuclear com a m anticorpo hAR é detectado no urotélio da bexiga de ambos
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
(Fig 2F e 2F) e
R26hAR
LoxP
ratos de controle (Fig 2D e 2D ‘), embora a intensidade do primeiro é mais forte do que o último. Como esperado, a coloração nuclear positiva com o anticorpo específico AR humana, hAR, só foi observada nos tecidos da bexiga urothelial isoladas de
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
camundongos (Fig 2E e 2E). Estes dados indicam que a expressão do
AR
transgene no urotélio da bexiga é um resultado da
LoxP /Cre
recombinação através da MT-activada
Cre
transgene impulsionado pelo
UPK3A
promotor.
(a) Esquema representando o /a recombinação mediada por Cre LoxP, resultando na exclusão da cassete STOP proveniente do
R26AR transgene
alelo. (B) Experimental set-up para
AR
expressão do transgene humano induzidas tamoxifeno-. (C) analisa Genomic PCR de eventos de recombinação com primers específicos para o ser humano
AR
alelo transgene (ver Fig 2A) com amostras de tecido da bexiga urotélio de
R26AR
LoxP /+
UPK3A
CGE /+
e
R26AR
LoxP /+
ratos. O alelo AR trangene foi detectada nas amostras de ambos
R26AR
LoxP /+
UPK3A
GCE /+ Comprar e
R26AR
LoxP /+
ratos (seta preta), mas TM recombinação induzida sobre o alelo AR transgene só foi observado em
R26AR
LoxP /+
UPK3A
GCE /+
ratos (seta branca). coloração imuno-histoquímica (D-F ‘) do urotélio da bexiga de TM injetados
R26AR
LoxP /+
camundongos, usando tanto o anticorpo que é reactivo a ambos mouse e proteína AR humana ( m hAR), ou o anticorpo que é reactivo a única AR humano (hAR) (n = 9). (F-G ‘) coloração imuno-histoquímica do urotélio da bexiga com os dois anticorpos AR diferentes, conforme descrito acima, usando as amostras de TM-injetados
R26AR
LoxP /+
UPK3A
GCE /+
ratos (n = 12). (HK “) de canal único e fundiu imagens de imunofluorescência de tecidos da bexiga de TM-injetados
R26AR
LoxP /+ Comprar e
R26AR
LoxP /+
UPK3A
GCE /+
ratos corados com anticorpos contra p63 CK5, eo AR humana (em vermelho) (n = 6).
expressão
Usando abordagens de imunofluorescência, nós ainda confirmada de proteína AR transgênico no urotélio da bexiga através induzida por TM
LoxP /Cre
recombinação em
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
camundongos (Fig 2J ‘e 2K’), mas não no
R26hAR
LoxP /+ apenas os ratinhos de controlo (Fig 2H ‘e 2I’). Em linha com nossa observação em
R26RmT /MG
:
UPK3A
CGE /+
ratos, observou-se uma clara sobreposição de expressão AR transgénicos com tanto CK5 e expressão p63 em células uroteliais de
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
CGE /+
camundongos (Fig 2J ” e 2K “), sugerindo que a expressão transgénica AR está presente em basais e células intermediária populações na bexiga urothelium [21].
expressão condicional de transgênicos AR no mouse bexiga urotélio Aumenta Susceptibilidade à substância cancerígena Induzida por formação de tumores
N-butil-N- (4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN) é cancerígena bem estabelecido que tem sido frequentemente utilizada em roedores para induzir cancro da bexiga urinária [24], que tem semelhanças histopatológicas e moleculares significativas para o doença humana [25]. Portanto, avaliamos se a expressão transgênica AR no urotélio da bexiga altera a susceptibilidade à tumorigênese induzida BBN. Ambos
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
e R26hAR
LoxP /+
ratinhos foram administrados TM com 5 semanas de idade, e foram, em seguida, tratada com 0,1% BBN na sua água potável a partir de 8 semanas de idade, durante 12 semanas. Os ratos foram sacrificados uma semana após o término do tratamento BBN (Fig 3A). As análises macroscópica e histológica revelou um espectro de alterações patológicas no urotélio da bexiga, que incluíram hiperplasia, carcinoma
In situ
, carcinoma urotelial não invasivo e carcinoma de células uroteliais invasiva (figura 3B-3E ‘). Curiosamente, oito dos doze masculino
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
ratinhos desenvolveram urotelial invasivo carcinoma de células (67%), tendo os fenótipos de tumor mais graves, em comparação com ratinhos de outros genótipos (Figura 3F). Em contraste, apenas três de treze anos de idade combinado masculino
R26hAR
LoxP /+
ninhada de controle desenvolvido carcinoma urotelial invasivo (23%). Além disso, cinco dos treze feminino
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
CGE /+
camundongos também desenvolveram invasiva carcinomas urothelial (39%), enquanto nenhuma mulher com a mesma idade
R26hAR
ninhada LoxP /+
controle desenvolvidos tanto carcinomas uroteliais não-invasivas ou invasivas (Fig 3F). Estes dados demonstram que a expressão condicional de AR transgênica em células de bexiga Urotélio aumenta a suscetibilidade à transformação oncogénica e agressividade do tumor em ambos os sexos masculino e feminino
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+
camundongos com a indução BBN.
(a) O delineamento experimental para induzir a expressão do transgene e carcinogênese da bexiga em
R26AR
LoxP /+ Comprar e
R26AR
LoxP /+
UPK3A
GCE /+
. (BE) Baixo (BE) e alta (B’-E ‘) imagens de ampliação de H E coloração que descreve a gama de alterações patológicas em
R26AR
LoxP /+
UPK3A
CGE /+
ratos após injecção TM e tratamento BBN descrito em (a) (Hiperplasia: n = 30, carcinoma in situ n = 5, carcinoma não-invasivo: n = 1, O carcinoma invasivo: n = 17). (F) Análise da incidência de hiperplasia ou carcinoma de células uroteliais desenvolvimento em ratos com diferentes genótipos.
BBN Induzida celular urotelial carcinomas em
R26hAR
LoxP /+
:
UPK3A
GCE /+ Quais são urotelial Intermediário e basocelular Origem
tem sido demonstrado que a BBN induziu o desenvolvimento de urotelial da bexiga carcinoma de células em ratinhos [6, 22]. Para definir melhor a origem dos tumores de bexiga em
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ratos , foi realizada imuno-histoquímica para examinar uma série de marcadores celulares em tecidos tumorais. Como mostrado na Fig 4A-4D ‘, as células tumorais apresentaram imunocoloração positiva com o anticorpo AR humana (Fig 4A e 4A’), sugerindo uma ligação entre a expressão transgénica AR e transformação oncogénica induzida BBN. As células tumorais mostraram forte coloração positiva para CK5 (Figura 4B e 4B ‘), que é uma característica marcante de patologias decorrentes das células basais [22]. coloração ligeira de CK8 foi também observada em células de tumor (Fig 4C e 4c ‘). A maioria das células tumorais também foram reagentes ao anticorpo p63 (Fig 4D e 4D ‘). Utilizando abordagens de co-imunofluorescência, que caracterizado pelo facto adicional da identidade celular de células de tumor. coloração nuclear da AR transgênica sobreposta uniformemente com coloração da membrana citoplasmática da CK5 nas células tumorais de
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camundongos (Fig 4F-4F “). Além disso, a maioria das células tumorais positivas para CK5 isoladas de ambos
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ratos também foram reagentes para anticorpos p63 (Fig 4G-4H “). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a origem do carcinoma urotelial da bexiga induzida por BBN é essencialmente derivada de células basais em
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ratos e
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controles.
(AD) Baixo (AD) e elevado (A’-D ‘) a ampliação das imagens de coloração imuno-histoquímica com o anticorpo contra a AR humana, hAR (a-a’) e CK5 (B-B ‘), CK8 (C-C’), ou a p63 (D- D ‘) em tumores de bexiga de
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ratos (n = 3 ). (EF “) imunofluorescência análises de tecidos tumorais de bexiga isoladas de
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ratos. canal único e imagens fundidas mostrando CK5 (verde) e AR humana (vermelho) co-localização em tumores de bexiga em tecidos de camundongos (n = 3). (GH “) Análises semelhantes, como descrito acima, foram realizadas utilizando o anticorpo contra a CK5 (verde) ou p63 (vermelho) em tumores de bexiga de
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ratos (n = 4). analisa (IL) imuno-histoquímica de tecidos tumorais de bexiga isoladas do sexo masculino ou feminino
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murganhos com um anticorpo contra o marcador de proliferação, Ki67 (n = 3). (M) Quantificação de-positivos Ki67 células detectadas em carcinomas de ambos os genótipos em machos e fêmeas de camundongos (n = 3).
Transgênicos AR Expressão promove a proliferação do tumor celular na bexiga de
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Um papel promocional da AR na proliferação celular foi previamente demonstrado na próstata [26-28]. Nós investigamos o efeito potencial de expressão AR transgênica na promoção da proliferação celular em bexigas de BBN-tratados
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ratos. Foi realizada imuno-histoquímica para corar lâminas de tecido da bexiga com o anticorpo Ki67 de ambos os sexos masculino e feminino R
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camundongos (Fig 4I-4L). Ki67 imunocoloração foi quantificada através da contagem de células uroteliais de bexiga 1000 de cinco campos de alta potência em cada amostra. Três ratos de cada sexo e genótipo foram analisados, de dados representativo é mostrado (Figura 4I-4L). O índice proliferativo no masculino
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grupo foi de aproximadamente um- vezes maior do que no masculino
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ratos de controle, e feminino
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camundongos (Fig 4M). Estes resultados implicam um papel promocional de transgênicos
expressão AR
na proliferação celular de tumores uroteliais da bexiga induzida por BBN.
Os andrógenos desempenham um papel dominante na aumentam a susceptibilidade à BBN Induced urotelial Carcinoma Desenvolvimento em
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neste estudo, nós observada a maior incidência de carcinomas de células induzidas BBN invasivos uroteliais no sexo masculino
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ratos em comparação com outros ratos do sexo e genotípicas. Além disso, as células tumorais de
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ratos pareceram ser mais proliferativa do que aqueles de outros grupos de ratinhos. A AR é um membro da superfamília de receptores de esteróide hormonal [29], e a sua actividade é regulada por meio de androgénios em geral. Para caracterizar ainda mais o papel do eixo andrógeno no
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ratos , nós manipulamos os níveis de andrógenos por qualquer castrar camundongos machos ou completando camundongos fêmeas com pelotas de andrógenos. Em seguida, avaliou-tumorigénese bexiga induzida nos ratinhos BBN acima (Fig 5A). masculino Curiosamente, castrados
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ratos de controle só desenvolveram hiperplasia urotelial de bexiga (Fig 5B). No entanto, 2 out of 5 (40%) castrados
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ratinhos desenvolveram carcinomas uroteliais. Como observamos anteriormente, machos inteiros
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ratos apresentaram o maior