Abstract

Há um grande corpo de evidências científicas sugerindo que 3,3′-Diindolylmethane (DIM), um composto derivado da digestão de indole-3-carbinol, que é abundante em vegetais crucíferos, abriga actividade anti-tumoral

in vitro

e

in vivo

. Evidências sugerem que a proteína quinase ativada pela AMP (AMPK) desempenha um papel essencial na homeostase energética celular e desenvolvimento do tumor e que a segmentação AMPK pode ser uma opção terapêutica promissora para o tratamento do câncer na clínica. Nós relatado anteriormente que um DIM formulado (BR-DIM; daqui em diante referido como B-DIM) com uma maior biodisponibilidade era capaz de induzir a apoptose e inibem o crescimento celular, angiogénese e invasão de células cancerosas da próstata. No entanto, o mecanismo molecular preciso (s) para os efeitos anti-cancro de B-DIM ainda não foram completamente elucidados. No presente estudo, investigamos se a proteína quinase ativada pela AMP (AMPK) é um alvo molecular de B-DIM em células cancerosas humanas da próstata. Os resultados demonstraram, pela primeira vez, que a B-DIM pode activar a via de sinalização da AMPK, associado com a supressão do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), a sub-regulação do receptor de androgénio (AR) expressão, e na indução de apoptose em ambos células cancerosas C4-2B próstata andrógeno-insensitive andrógeno-sensíveis LNCaP e. B-DIM também ativa a AMPK e para baixo-regula AR em xenoenxertos tumorais C4-2B de próstata andrógeno-independente em ratinhos SCID. Estes resultados sugerem que a B-DIM poderia ser usado como um potencial agente anti-cancro na clínica para a prevenção e /ou tratamento do cancro da próstata independente de androgénio capacidade de resposta, embora AR funcional pode ser necessária

citação:. Chen D, Banerjee S, Cui QC, Kong D, Sarkar FH, Dou QP (2012) ativação da proteína AMP-quinase ativada por 3,3′-Diindolylmethane (DIM) está associada a células cancerosas da próstata humana Morte

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 7 (10): e47186. doi: 10.1371 /journal.pone.0047186

editor: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, China

Recebido: 05 de março de 2012; Aceito: 13 de setembro de 2012; Publicação: 09 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por doações do Instituto Karmanos Cancer (a QPD) Instituto Nacional do Câncer (1R01CA120009, 3R01CA120009-04S1 e 5R01CA127258-05, para QPD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) é expressa em todas as células eucarióticas e é uma enzima importante que desempenha um papel fundamental na homeostase de energia celular, assim como a processos de controlo relacionados com o desenvolvimento do tumor, incluindo a progressão do ciclo celular, células proliferação, síntese de proteínas, e sobrevivência. Portanto, como um alvo de anti-cancro, AMPK tem recebido atenção intensiva nos últimos anos. AMPK de mamífero é uma proteína quinase serina /treonina trimérico composto por uma subunidade catalítica α e duas subunidades reguladoras, β e γ. AMPK é activada através de fosforilação de Thr-172 na subunidade α por uma tensão de empobrecimento de energia, tais como um aumento rácios de AMP /ATP [1] e ADP /ATP [2], ou estimulada por quinases celulares incluindo quinase hepática B1 (LKB1 ) [3] – [4] e dependente de calmodulina cinase de proteína cinase (CaMKK) [5]. Uma vez ativada, a AMPK desempenha duas funções principais, metabólicas e não-metabólicas. Na regulação do metabolismo, a AMPK fosforila porções de serina em muitas proteínas alvo e resulta na activação de vias catabólicas para activar os processos de ATP-gerando incluindo a captação e oxidação de glucose e ácidos gordos, e desligando de vias anabólicas incluindo proteínas, ácidos gordos ácido e de colesterol sínteses, que consomem ATP [6]. No que diz respeito funções não metabólicas da AMPK, activação de AMPK pode induzir a paragem do ciclo celular e inibir a proliferação celular e a síntese de proteínas nas células malignas por meio de vários mecanismos, tais como a acumulação de supressor tumoral p53 e a inibidores de cinase p21 dependente de ciclina e p27 [7 ], bem como a regulação negativa da via mTOR [8] – [9]. A pesquisa extensiva suporta o papel de AMPK na prevenção e na terapêutica do cancro, sugerindo que a segmentação AMPK pode ser uma alternativa promissora para o tratamento do cancro.

Para esse fim, a metformina, uma droga anti-diabética, foi mostrado para ativar a AMPK , levantando a hipótese de que a metformina pode reduzir o risco de cancro em pacientes com diabetes tipo 2, através da activação da via de AMPK [10]. De fato, os relatórios de estudos clínicos demonstraram que os doentes diabéticos tratados com metformina tiveram uma taxa significativamente menor de incidência de câncer e mortalidade relacionada ao câncer em comparação com pacientes expostos a outros medicamentos anti-diabéticos [10] – [12]. Estudos pré-clínicos também têm demonstrado que a metformina não só inibe o crescimento de células cancerosas cultivadas [13] -. [14] e tumores em ratos [15], mas também alveja seletivamente as células-tronco do câncer [16]

Além metformina, alguns compostos naturais, incluindo a quercetina, genisteína [17], a capsaicina, EGCG [18], e curcumina [19], demonstraram ter efeitos anticancerígenos associadas à activação da via de sinalização de AMPK. De facto, os produtos naturais têm sido a fonte mais produtiva de ligações para o desenvolvimento de drogas anti-cancro. De acordo com a literatura, cerca de 73% de fármacos anti-cancerígenos foram descobertos a partir de origens naturais ou derivadas a partir de compostos naturais durante a última metade de um século [20]. O composto natural indole-3-carbinol (I3C), que é encontrado em níveis relativamente elevados em vegetais crucíferos tais como brócolos e couve, e seu dímero 3,3′-diindolylmethane (DIM) têm demonstrado actividade anti-tumoral

In vitro

e

in vivo

[21] – [22]. Recentemente, relatou que um DIM formulado (BR-DIM, obtido a partir bioresposta Nutrientes, LLC., Boulder, Colorado, daqui em diante abreviado como B-DIM), mostrou aproximadamente 50% maior biodisponibilidade

in vivo

[23] comparação com DIM. B-DIM induzidos a apoptose e crescimento celular inibido, angiogénese e invasão de células de cancro da próstata, que está associada com a regulação da Akt, NF-kB, o VEGF e Ar vias de sinalização [24] – [25]. Além disso, resultados recentes demonstraram que o tratamento B-DIM de células do cancro da próstata

in vitro

ou B-DIM intervenção em pacientes com cancro da próstata levou à exclusão nuclear de AR associada com a activação de miR-34a [24 ]. No entanto, o mecanismo molecular preciso (s) pelo qual B-DIM desempenha suas funções anti-cancerosas e câncer preventiva não foram completamente elucidados; mais especificamente, ele não tem sido relatado se a actividade biológica de B-DIM está relacionado com a indução de sinalização de AMPK.

Portanto, no presente estudo, foi investigado o efeito de B-DIM no sinalização AMPK e os seus relacionados alvos a jusante, tanto LNCaP sensível ao andrógeno e células cancerosas C4-2B próstata andrógeno-insensitive contendo AR funcional. Os nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, que a B-DIM poderia funcionar como um ativador de AMPK. A activação da AMPK por B-DIM resultou na diminuição da regulação da expressão de AR e antigénio específico da próstata (PSA), e causou a indução da apoptose das células, a supressão da via mTOR, e inibição de prostasphere formação na próstata humana células cancerosas

in vitro

e

in vivo

. Nossos resultados também demonstraram que a via AMPK é um dos novos alvos moleculares de B-DIM para os seus efeitos anti-câncer contra o câncer de próstata humano.

Métodos

Cultura celular, extração de proteínas e western Blot Assay

C4-2B Humano cancro da próstata (obtido a partir Professor Leland Chung, Emory University, School of Medicine, Atlanta, GA; e atualmente no Cedars-Sinai, Los Angeles, CA) e LNCaP (American Type cultura Colecção Manassas, VA, EUA), as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 ug /ml de estreptomicina, 100 unidades /ml de penicilina, e 2 mM de glutamina, numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 e 95% de ar a 37 ° C. Um extracto celular total foi preparado como previamente descrito [26]. Para a análise de transferência de Western, uma quantidade igual de proteínas de cada extracto celular foi sujeito a electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para membranas de nitrocelulose. membranas individuais foram sondadas com anticorpos indicados. bandas imunorreactivas foram desenvolvidas utilizando peroxidase de rábano conjugada e anticorpos secundários SuperSignal WestPico substrato quimioluminescente (Pierce) e visualizada usando filme de raios-X.

Prostasphere Formação Ensaio

Prostasphere ensaio de formação foi realizado para avaliar a capacidade de câncer de células-tronco auto-renovação seguindo o nosso procedimento publicado [27]. Resumidamente, suspensões de células únicas de células C4-2B foram cuidadosamente suspensas e plaqueadas em ultra-baixa aderentes-poços de placas de 6 poços (Corning, Lowell, MA) a 1000 células /poço em 1,5 ml de meio de formação de esfera (01:01 DMEM /F12 suplementado com 50 unidades /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina, 27-B, e N-2). Um mililitro de meio de formação esfera foi adicionado a cada 3 dias. Após 6 dias de incubação com diferentes concentrações de B-DIM ou metformina (como um controlo), as esferas se formaram foram recolhidos por centrifugação a 300 x g durante 5 minutos e prostasphere números foram contados sob um microscópio de contraste de fase invertida. A proporção de células geradoras de esfera foi calculada dividindo o número de células semeadas por o número de prostaspheres.

Animais Experimentais

CB-17 SCID homozigótico

macho (4-5 semanas de idade) foram adquiridos a Taconic Farms (Germantown, NY). Os ratos foram alojados e mantidos em condições estéreis em instalações credenciados pela Associação Americana para o Acreditação do Laboratório Animal Care e de acordo com os regulamentos e as normas do Departamento de Agricultura dos EUA, Departamento de Saúde e Serviços Humanos, e NIH EUA atuais. Os ratos foram utilizados de acordo com Animal Care e Diretrizes uso de Wayne State University sob um protocolo aprovado pelo Comitê Animal Care University e Uso do Estado Wayne. Camundongos receberam dieta Lab 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN).

Osso Humano e Implantação de células tumorais

tecido ósseo fetal masculino humano foi obtido por uma organização sem fins lucrativos terceiro ( avançados de Biociência Resources, Alameda, CA) e consentimento informado por escrito foi obtido a partir da família do doador, de acordo com os regulamentos emitidos por cada estado envolvido eo governo federal. Após uma semana de aclimatação, os ratos foram implantados com um único fragmento de osso fetal humano, tal como descrito anteriormente [28] – [29]. C4-2B células foram colhidas a partir de culturas subconfluentes após uma breve exposição a 0,25% de tripsina e 0,2% de EDTA. A tripsinização foi interrompida pela adição de um meio contendo 10% de FBS. As células foram lavadas uma vez em meio isento de soro e ressuspensas. foram utilizados 90% de viabilidade para as injeções, só suspensões constituídas por uma única célula com 95% em comparação com xenoenxerto de pele em que a taxa de absorção de tumor era comparativamente menos com período de latência prolongado. Assim que a maioria dos implantes ósseos começou a aumentar (agora chamado de “tumor ósseo”), conforme determinado por medições calibradas (dia 30 após a injecção de células de cancro), os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes grupos de tratamento (n = 7): ( a) a ausência de tratamento; (B), apenas B-DIM, 5 mg /ratinhos alimentados todos os dias por via oral por sonda esofágica durante 4 semanas desde o início da terapia. O volume do tumor ósseo em cada grupo foi determinada por medições de calibrador duas vezes por semana. O peso do corpo de ratos em cada grupo foi também medida. Todos os ratinhos foram sacrificados um dia após a última dose de tratamento B-dim (5 semanas), porque grandes tumores foram formadas nos ratinhos de controlo, o que exigia de terminação, e o seu volume final do tumor e do peso corporal foram registados. Na autópsia, o tumor foi cuidadosamente excisado, libertado de qualquer tecido aderente estranhos, e parte do tecido foi fixado em formalina e embebidos em parafina para a imunocoloração e H E de coloração para confirmar a presença de tumor

Resultados.

B-DIM Ativa AMPK sinalização na próstata células cancerosas humanas

Foi avaliado se a via de sinalização AMPK pode ser um dos alvos moleculares de B-DIM em ambos C4-2B andrógeno-insensitive ( Fig. 1A) e células de cancro da próstata sensível a-andrógenos LNCaP (Fig. 1B). Ambas as linhas celulares foram tratadas com diferentes concentrações de B-DIM durante 3 horas, e lisados ​​de células de células tratadas foram analisadas por transferência de Western para medir os níveis de fósforo-AMPKα (T172), uma forma activa da proteína AMPK, bem como algumas proteínas alvo a jusante. Os resultados mostraram que o nível de fósforo-AMPKα em ambas as linhas de células de cancro da próstata tratados com B-DIM aumentou de uma forma dependente da dose (Fig. 1A, B). Como um controlo, os níveis totais de proteína AMPK permaneceu relativamente inalterado (Fig. 1A, B). Tanto a proteína reguladora associada de mTOR (rapina) e acetil-CoA carboxilase (ACC) são substratos a jusante directos de AMPK, como AMPK activado é capaz de fosforilar a proteína rapina no resíduo serina 792 [8] e proteína ACC no resíduo serina 79 [30 ] – [31]. O tratamento com B-DIM resultou no aumento dos níveis de fósforo-rapina (S792) e fósforo-ACC (S79) nas células tratadas (Fig. 1A, B), apoiando ainda mais que a B-DIM é um activador de AMPK. mTOR é uma via de sinalização a jusante de AMPK, e activação de AMPK pode inibir a via de sinalização de mTOR [32]. Os nossos dados também revelado que a activação de AMPK por B-DIM poderia suprimir a via mTOR, tal como medido pela diminuição do nível de proteína de fósforo-mTOR (Fig. 1A, B), o que demonstra, pela primeira vez, a funcionalidade de B-Dim um activador de AMPK em ambas as linhas de células de próstata AR-AR-sensíveis e insensíveis. A inativação do mTOR por B-DIM é consistente com nosso relatório publicado anteriormente [33].

C4-2B cancro da próstata humana (A) ou LNCaP células (B) foram tratadas com concentrações indicadas de B-DIM para 3 horas para medir os níveis de proteína de fósforo-AMPKα, AMPKα, fósforo-rapina, fósforo-ACC, fósforo-mTOR, ou durante 24 horas para medir os níveis de proteína de AR, PSA ou a clivagem de PARP por análise de Western blot. Medição de β-actina serviram como controlos de carga. Os números por baixo os resultados ocidentais de fósforo-AMPKα indicam quantificados índices normalizados de fósforo-AMPKα e p-actina.

A ativação da AMPK por B-DIM em horários precoce está associada com Subseqüente Down-regulação da AR e Expressão PSA Proteínas e indução de apoptose em células cancerosas humanas da próstata

Os resultados apresentados acima mostram que B-DIM abriga propriedade de ativação da AMPK. Em seguida, investigou se a activação da AMPK por B-DIM pode resultar em morte celular por apoptose e inibir a expressão de proteínas de assinatura cancro da próstata, tais como a AR e PSA. Nós mostramos anteriormente que a activação da sinalização de AMPK por B-DIM é um evento precoce que ocorre tão cedo quanto três horas-tratamento (painel superior da Fig. 1A, B). Descobrimos que o tratamento posterior das células LNCaP e C4-2B com B-DIM para até 24 horas reduziu significativamente os níveis de PSA AR e de expressão de um modo dependente da dose, e também resultou na morte celular por apoptose tal como medido por clivagem de PARP ( o painel inferior da Fig. 1A, B). Estes dados sugerem que a activação da via de sinalização da AMPK é um dos principais alvos da B-DIM que conduzem à indução da morte celular por apoptose de células cancerosas da próstata.

A activação da AMPK por B-DIM pode ser bloqueada pela um

AMPK inibidor

Composto C foi desenvolvido como um inibidor selectivo da AMPK [34]. Nossa hipótese é que se AMPK é um alvo molecular essencial da B-DIM, co-tratamento com Composto C devem atenuar ou bloquear os efeitos da B-DIM sobre as células cancerosas da próstata. Para testar esta hipótese, C4-2B cancro da próstata e células LNCaP foram pré-tratadas com 20? M de Composto ou DMSO C durante 6 horas e, em seguida, co-tratados com B-DIM em duas concentrações durante 3 horas adicionais. Os resultados de imunotransferência mostrou que em ambas as linhas de células de cancro da próstata tratados apenas com B-DIM, sinalização AMPK foi activado tal como medido por um aumento dependente da dose na fosforilação de AMPKα (T172) e a fosforilação da Ser79-ACC (Fig. 2) , um substrato directo de AMPK que é amplamente usado como um detector de activação AMPK [35] – [37]. No entanto, os níveis de proteína de fósforo-AMPKα e fósforo-ACC foram drasticamente diminuída em células pré-tratadas e co-tratados com o Composto C (Fig. 2), sugerindo que a AMPK B-activado-DIM pode ser bloqueado por um inibidor de AMPK.

C4-2B cancro da próstata e células LNCaP foram pré-tratadas com 20? M de Composto inibidor da AMPK C (CC) durante 6 horas, seguido por co-tratamento com concentrações indicadas de B-DIM durante 3 horas. Os extractos celulares das células tratadas foram coradas imunologicamente para anti-fósforo-AMPKα, fósforo-ACC ou anticorpos p-actina.

B-DIM Melhora AR Suprimindo-efeito da Anti-AR Drogas Casodex

Uma das estratégias atuais de tratamento para câncer de próstata avançado é o de suprimir a função da AR pela castração e anti-andrógenos. Casodex é uma droga anti-androgénio utilizado clinicamente em doentes com cancro da próstata metastático fase /avançado, e funciona através da ligação e prevenindo a activação de AR. Os nossos estudos anteriores mostraram que a B-DIM é capaz de inibir a expressão de AR nas células cancerosas da próstata [24]. Nós ainda mais a hipótese de que a combinação de B-DIM com Casodex pode ter um efeito sinergético na inibição da expressão de AR e a indução da apoptose em células de cancro da próstata, que pode estar associada com a activação de AMPK. Para testar esta hipótese, foi co-tratadas ambas as linhas de células de cancro da próstata com 100 uM de Casodex e 40 uM de B-DIM durante 24 horas, e o tratamento com cada agente sozinho serviram como controlos. Os dados mostram que a co-tratamento de células C4-2B e LNCaP com Casodex e B-DIM diminuiu significativamente o nível de clivagem de PARP-associado apoptose AR e o aumento da expressão em comparação com cada tratamento por si só, e o sinergético ou aditivo efeito foi acompanhado por um aumento activação AMPK (Fig. 3).

C4-2B cancro da próstata e células LNCaP foram tratadas com 100 uM de Casodex, 40 uM de B-DIM sozinho ou uma combinação de Casodex e B-DIM durante 24 horas, seguido por análise de Western blot utilizando anticorpos anti-fósforo-AMPKα, AR, PARP ou p-actina.

Ambos B-DIM e metformina Significativamente inibe a formação Prostasphere

células-tronco tumorais as características de tumorspheres moldagem. Tem sido mostrado que a metformina poderia inibir o crescimento de células estaminais do cancro, associada com a activação da AMPK [16]. A fim de testar se B-DIM, que funciona como um activador de AMPK (Fig. 1, 2, 3) poderiam ter como alvo as células estaminais cancerosas semelhante e inibir a formação prostasphere, células C4-2B foram tratadas com diferentes concentrações de B-Dim 6 dias em poços de ultra-baixa aderentes de placas de 6 poços. O tratamento com metformina serviu como um controlo. Os resultados mostraram que a B-DIM prostasphere inibiu a formação de 29% e 90% em concentrações de tratamento de 10 uM e 25 uM, respectivamente (Fig. 4), o que é consistente com as nossas descobertas anteriores [27]. Os dados demonstram que a B-DIM podem possuir a capacidade de suprimir o tumor células-tronco como no cancro da próstata através da activação da via de AMPK.

C4-2B células foram tratadas com as doses indicadas de B-dim (A, B) durante 6 dias. O tratamento com diferentes concentrações de metformina serviram como controlos (C, D). Após 6 dias, os números prostasphere foram contados sob o microscópio e a proporção de células geradoras de esfera foi calculada dividindo o número de células semeadas por o número de prostaspheres (A, C). Prostaspheres de células C4-2B tratados com B-dim (B) ou metformina (D) foram fotografadas e os resultados mostraram que 10 e 25 uM de B-DIM significativamente reduzido tamanho e número de prostaspheres. n = 6, * P 0,05, ** P . 0,01

B-DIM Ativa AMPK e Down-regula AR em xenoenxertos de tumores andrógeno-independente C4-2B de próstata em ratos SCID

os resultados anteriores a partir de nosso

in vitro

estudos mostraram claramente que a via de sinalização da AMPK é um dos novos alvos moleculares da B-DIM em células de cancro da próstata. Para confirmar esta conclusão

in vivo

, nós projetamos e usou o modelo animal metástase óssea experimental (ver Materiais e Métodos) que a metástase óssea imita de câncer de próstata humano. Descobrimos que o tratamento B-DIM

In vivo

o crescimento do tumor inibido C4-2B dentro do microambiente do osso até certo ponto (20%; dados não mostrados). Os tecidos tumorais foram removidas e analisadas por imuno-histoquímica utilizando anticorpos anti-fósforo-AMPKα, fósforo-ACC e anticorpos de AR. Os resultados mostraram que as populações de células P-ACC-positivos P-AMPK- e aumentaram significativamente, enquanto as células RA-positiva diminuiu significativamente nos tumores tratados com B-DIM em comparação com o controlo (Fig. 5). Esses achados confirmam que B-DIM é capaz de activar a via AMPK

in vivo

, associados à sua actividade anti-câncer.

ratinhos ICR SCID foram implantados com células C4-2B e tratada com 5 mg /rato de B-DIM por gavagem orais por dia durante 4 semanas. Os tecidos tumorais foram analisados ​​por imuno-histoquímica utilizando anticorpos anti-fósforo-AMPKα (T172), fósforo-ACC (S79) ou anticorpos de AR. As secções coradas foram visualizadas sob a (amplificação × 400) do microscópio. Ao contrário de controlo tratado com solvente, os ratos tratados com B-DIM apresentados com ativação da AMPK e perda significativa da AR nas secções tumorais.

Discussão

A busca por novos fármacos antitumorais de naturais fontes é uma das abordagens mais promissoras para a prevenção e terapia do cancro. Nós temos estudado formulado 3,3′-Diindolylmethane (B-DIM) e mostrou que B-DIM podem induzir apoptose e inibir o crescimento celular, angiogênese e invasão de células cancerosas da próstata através do controlo do NF-kB, Akt e Ar vias de sinalização [ ,,,0],24] – [25]. No entanto, o mecanismo molecular preciso (s) pelo qual B-DIM induzir os seus efeitos anti-cancro da próstata no cancro humano ainda não foram completamente elucidados. Neste estudo, descobrimos que a AMPK é um dos alvos moleculares diretos de B-DIM na próstata células cancerosas

in vitro

e

in vivo

.

A sinalização AMPK via tornou-se recentemente um importante foco de interesse na prevenção e tratamento do câncer. Bowker

et al

. investigaram a incidência de cancro em 10.309 doentes diabéticos tratados com insulina, a metformina ou as sulfonilureias durante um período de 5 anos. Eles relataram que os pacientes tratados com metformina tiveram uma taxa significativamente menor de mortalidade relacionada ao câncer em comparação com pacientes expostos a outros medicamentos anti-diabéticos [12]. O mecanismo principal de anti-cancro da metformina foi associada com a activação de sinalização AMPK [34]. A activação de AMPK inibe as vias de consumo de energia, a síntese de proteína e proliferação celular, com a supressão da via mTOR

através

tuberosa proteína esclerose 2 (TSC-2) [38]. Hirsch H

et al

. relataram que a metformina direcciona selectivamente a células estaminais cancerosas e inibe o crescimento tumoral em modelos de ratinho mediadas por activação da via AMPK [16]. Tem sido relatado que alguns compostos naturais, incluindo a genisteína (rica em soja), EGCG (abundante no chá verde), e capsaicina (a partir de pimenta quente) são capazes de activar a via AMPK [17]. Descoberta de mais ativadores de AMPK de fontes naturais está se tornando uma abordagem atraente para a prevenção e terapia do cancro.

Os nossos resultados atuais mostram que B-DIM pode ativar a AMPK sinalização logo aos três horas em ambos os LNCaP sensível ao andrógeno e andrógeno células de cancro da próstata -insensitive C4-2B, medidos por: (i) aumento dos níveis de proteína de fósforo-AMPKα (T172), (ii) aumento dos níveis de ACC fosforilada no resíduo serina 79 [30] – [31], (iii) aumento Os níveis de proteína de fósforo-rapina (S792), que é um alvo directo de AMPK e um parceiro de ligação de mTOR e de inibidor [8], e (iv) diminuição dos níveis de fósforo-mTOR (Fig. 1). Consequências da ativação da AMPK por B-DIM parece ser mediado através da inibição da expressão de AR e PSA, levando à indução de apoptose após tratamento adicional durante um adicional de 21 horas (Figs. 1, 6). AMPK activação por B-DIM pode ser bloqueada pelo pré-tratamento com o Composto C, um inibidor de AMPK, em que as células de cancro da próstata (Fig. 2).

O receptor de androgénio (AR) é uma crítica factor de desenvolvimento e progressão do câncer de próstata. O cancro da próstata é dependente da estimulação de androgénio mediada por AR, AR e ainda desempenha um papel importante no desenvolvimento do cancro e de resistência a drogas em células de cancro de próstata independente de androgénios. Mecanismos alternativos de activação de AR no cancro da próstata independente de androgénios são propostas por meio de outras vias de sinalização, incluindo ERK, Akt, β-catenina e caveolin [39] – [41]. Portanto supressão de AR é uma das estratégias terapêuticas para doentes com cancro da próstata. Casodex é uma droga anti-andrógeno clinicamente utilizada para pacientes em fase metastático /avançado. Quaisquer compostos naturais que poderiam melhorar a eficácia de Casodex tem benefício terapêutico potencial na clínica. Mostrámos no presente estudo que a co-tratamento de células com Casodex e B-DIM conduziu a um aumento significativo no fósforo-AMPKα e suprimiu a expressão de AR nas células cancerosas da próstata (Fig. 3), o que demonstra um novo mecanismo para a sinergia de anti- terapia de AR.

tecido de câncer de próstata contém uma população rara de células-tronco cancerosas multi-potentes com a capacidade de auto-renovação. Estas células estaminais do cancro da próstata podia ser enriquecida e medido por um ensaio de formação de colónia em culturas tridimensionais, referido como prostasphere formação. células de cancro da próstata com características de células estaminais possuem a capacidade de formar prostaspheres a partir de células individuais, tal como uma condição de auto-renovação da cultura, em condições não-aderentes [42]. Para determinar se B-DIM poderia alvo estaminais da próstata /células-tronco como, testou-o em ensaios de formação de prostasphere. O resultado mostrou que, após seis dias de incubação de células C4-2B com diferentes doses de B-DIM, não apenas eram números de prostaspheres formados diminuiu significativamente, mas o tamanho do prostaspheres também foi reduzido (Fig. 4). Os resultados do

in vitro

estudos foram confirmados pelos resultados de imuno-histoquímica de tecidos tumorais de xenoenxertos de cancro da próstata tratados com B-DIM (Fig. 5). populações de células positivas coradas com fósforo-AMPK ou fósforo-ACC foram significativamente aumentada, enquanto as células RA-positivas foram reduzidos no B-DIM tratada tecido do tumor (Fig. 5).

Em resumo, o presente estudo prevê a primeira evidência de que a via de sinalização da AMPK é um dos alvos moleculares de B-DIM para a sua actividade anti-cancro. A activação da AMPK por resultados B-DIM na supressão do seu alvo a jusante de mTOR, a infra-regulação da expressão de AR e a indução da apoptose em ambas as células LNCaP sensíveis ao androgénio e células de cancro de próstata de androgénio C4-2B-insensível (Fig. 6). A activação da AMPK por B-DIM foi também observada em tumores da próstata tratados. Os nossos resultados demonstram que a B-DIM poderia ser usado como um agente potencial na clínica para a prevenção e /ou tratamento do cancro da próstata independente de androgénio responsividade das células.

Reconhecimento

Agradecemos Ms. Sara Schmitt para a leitura crítica do manuscrito.