Abstract

câncer de próstata células estaminais-like (PCSCs) estão sendo intensamente investigado em grande parte devido às suas contribuições para tumorigênese prostática, no entanto, nossa compreensão da biologia PCSC, incluindo os seus caminhos críticos, permanece incompletamente compreendida. Embora o factor de crescimento epidérmico (EGF) é amplamente utilizado na manutenção de células PCSC in vitro, a importância da sinalização dependentes de EGF e suas vias a jusante em PCSC auto-renovação não estão bem caracterizados. Ao investigar as células DU145 esfera, uma população de células de cancro da próstata com propriedades estaminais semelhante, relatamos aqui que o receptor do factor de crescimento epidérmico de sinalização (EGFR), desempenha um papel crítico na propagação de PCSCs DU145. A activação da via de sinalização de EGFR adição de EGF e a expressão ectópica de um mutante de EGFR constitutivamente activo (EGFRvIII) aumento da formação de esfera. Por outro lado, a inibição da sinalização de EGFR usando inibidores de EGFR (AG1478 e PD168393) e knockdown de EGFR inibiu significativamente PCSC auto-renovação. Consistente com a via de MEK-ERK sendo um dos principais alvos de sinalização de EGFR, a activação da via de MEK-ERK contribuiu para propagação PCSC facilitada-EGFR. A modulação da sinalização do EGFR quinase afectada activação (ERK) relacionado com o sinal extracelular. A inibição da activação de ERK através de várias abordagens, incluindo o tratamento com o inibidor de MEK U0126, a expressão ectópica de MEK1 dominante-negativa (K97M), e knockdown de qualquer ERK1 ou ERK2 resultou numa redução robusta na propagação PCSC. Colectivamente, o presente estudo fornece evidências de que a sinalização EGFR promove PCSC auto-renovação, em parte, pela ativação da via MEK-ERK

Citation:. Rybak AP, Ingram AJ, Tang D (2013) Propagação da próstata humana câncer de células estaminais-Como ocorre através da ativação ERK mediada pelo EGFR. PLoS ONE 8 (4): e61716. doi: 10.1371 /journal.pone.0061716

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de novembro de 2012; Aceito: 17 de março de 2013; Publicação: 19 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Rybak et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por uma bolsa (RMS 79-71) dos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde para DT e pelo apoio financeiro da HealthCare de St. Joseph em Hamilton, ON, Canadá, para o Centro de Hamilton para Kidney Research (Hckr). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o tumor maligno mais comum do sexo masculino ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em homens nos países ocidentais [1], [2]. Durante o processo de desenvolvimento de neoplasias de próstata, vias de sinalização oncogênicas promover a progressão de carcinomas hormono-dependentes ao hormônio de câncer de próstata refratário (HRPC), o principal fator que contribui para mortes por câncer de próstata [3], [4]. Embora os mecanismos exatos responsáveis ​​pela iniciação e progressão do câncer de próstata permanecem largamente desconhecidos, cancro da próstata células estaminais-like (PCSCs) são amplamente considerados como sendo crítico na tumorigênese de próstata e seu desenvolvimento para a doença HRPC [5] – [7].

Apesar da crescente evidência sugerindo a existência de PCSCs, identificação de PCSCs humanos in vivo pareceu ser uma tarefa desafiadora. Este desafio é em grande parte devido à natureza heterogénea de câncer de próstata e as amostras limitados disponíveis a partir de fontes clínicas. A nossa compreensão limitada de PCSCs também contribuiu para a incapacidade de isolar e propagar PCSCs de carcinomas primários humanos. Para avançar o nosso conhecimento de PCSCs, vários grupos de pesquisa, incluindo o nosso, têm enriquecido para PCSCs de linhas celulares de cancro da próstata humano. Esta é em grande parte à demonstração de que as células-tronco cancerosas (CSCs) pode ser estudada usando o ensaio de cultura esfera sob condições (SF) meios isentos de soro. Este ensaio tem sido usado para derivar e propagar CSCs de cérebro de [8], da mama [9], do cólon [10] e células de cancro da próstata [11] – [16], in vitro. Mais importante ainda, a abordagem esfera cultura permitiu a propagação do câncer de próstata células-tronco, como que apresentam propriedades CSC de auto-renovação e a capacidade de iniciar a formação de tumor in vivo [11], [12], [15], [17] .

cultura

Esfera geralmente envolve a propagação de células estaminais do tipo em meio SF suplementado com factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) [8] – [13]. Embora a presença de ambos EGF e bFGF permite a geração de esferas a partir de células DU145 [11], [12], [17], se esta é a condição ideal para a geração e manutenção esfera PCSC por um período de tempo prolongado, permanece obscura. Na nossa investigação recente, que demonstraram que o EGF desempenha um papel crítico na propagação de longo prazo de DU145 PCSCs, e que estas células estaminais semelhantes foram capazes de iniciar tumores com uma capacidade significativamente melhorada em não-obesos, diabéticos imunodeficiente combinado /grave (NOD /SCID) [11]. No entanto, o papel da sinalização de EGFR, juntamente com as suas vias a jusante que são necessárias para a propagação DU145 PCSC continuam a ser caracterizado.

No nosso esforço para fazer avançar esse conhecimento, demonstramos aqui que a ligação de EGFR-ERK desempenha um papel importante na propagação de PCSCs DU145. Embora estes PCSCs são capazes de se propagar na ausência de EGF exógeno, a activação da sinalização do EGFR é crítica para a manutenção da DU145 PCSCs como manipulação experimental de sinalização de EGFR afectada propagação PCSC DU145. Além disso, a modulação da sinalização de EGFR em PCSCs DU145 afetou profundamente a ativação ERK. Além disso, a inibição da activação de ERK através do uso de um inibidor da MEK, a expressão ectópica de MEK1 dominante-negativa (K97M), e knockdown de ERK1 endógena ou ERK2, colectivamente reduzida a propagação de PCSCs DU145. Tomados em conjunto, estes resultados destacam a contribuição de sinalização MEK-ERK para PCSCs mediada por EGFR auto-renovação.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e Propagação de DU145 PCSCs

DU145 células de cancro da próstata humano e células embrionárias de rim humano 293T foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA), e foram cultivadas de acordo com as instruções da ATCC.

DU145 células estaminais do tipo de cancro da próstata humanas foram isolados e propagados como publicado anteriormente [11]. Resumidamente, as células em monocamada DU145 foram enzimaticamente dissociada em células individuais utilizando solução livre de vermelho de fenol TrypLE Express (Life Technologies, Calsbad, CA, EUA) e 40