Abstract

O câncer de pâncreas é uma neoplasia agressiva que é frequentemente diagnosticado em um avançado palco com mau prognóstico. Aqui, relatamos os efeitos quimioterápicos de proantocianidinas bioativos de sementes de uva (GSPs), avaliada usando

In Vitro

e

In Vivo

modelos. O tratamento de células de cancro pancreático humano (MiaPaCa-2, PANC-1 e AsPC-1) com GSPs

In Vitro

reduziu a viabilidade celular e aumento da G2M prisão /fase do ciclo celular levando à indução de apoptose numa dose e modo dependente do tempo. A apoptose de células de cancro do pâncreas induzidas GSPs-se associada com um decréscimo nos níveis de Bcl-2 e Bcl-XL e um aumento nos níveis de Bax e caspase-3 activada. Tratamento de MiaPaCa-2 e PANC-1 com as células GSPs também diminuiu os níveis de fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e Akt na fosforilação de Ser

473. siRNA knockdown de PI3K a partir de células de cancro do pâncreas, também reduziu a fosforilação de Akt. Além disso, a administração dietética de GSPs (0,5%, w /w), como uma dieta de controlo AIN76A suplementado inibiu significativamente o crescimento de MiaPaCa-2 xenoenxertos de tumores pancreáticos crescidos subcutaneamente em ratinhos nus atímicos, que foi associado com: (

i

) inibição da proliferação de células, (

ii

) indução de apoptose de células tumorais, (

iii) um aumento da expressão da Bax, redução da expressão de proteínas anti-apoptóticas e a activação de caspase-3 células -positivas, e (

IV

) a diminuição da expressão de PI3K e P-Akt em tecidos de tumor de xenoenxerto. Juntos, estes resultados sugerem que GSPs pode ter um efeito quimioterápico potencial no crescimento de células de câncer pancreático

Citation:. Prasad R, Vaid M, Katiyar SK (2012) Grape Proanthocyanidin Cancer Inibição pâncreas celular Crescimento

In Vitro Comprar e

In Vivo

através de indução de apoptose e pela segmentação da via PI3K /Akt. PLoS ONE 7 (8): e43064. doi: 10.1371 /journal.pone.0043064

editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de maio de 2012; Aceito: 16 de julho de 2012; Publicação: 08 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Prasad et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos do Mérito Veterans Administration revisão Award (SKK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é considerado a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. É um tumor maligno agressivo, que é frequentemente diagnosticado numa fase avançada, com mau prognóstico; a taxa de sobrevida global em 5 anos é 5% [1], [2]. Apenas 20% dos pacientes com câncer pancreático são elegíveis para ressecção cirúrgica, que continua a ser a única terapia potencial curativo [3]. Apesar de uma combinação de quimioterapia e terapia de radiação pode melhorar a sobrevivência, a maioria dos doentes morre de progressão da doença, que muitas vezes está associado com resistência adquirida ou intrínseca à quimioterapia [4], [5]. Portanto, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes que podem direcionar as moléculas associadas com o crescimento do tumor pancreático e contornar ou superar a resistência à apoptose pode levar a melhores resultados em pacientes que sofrem de câncer no pâncreas.

fitoquímicos não-tóxicos oferecer promissora opções para o desenvolvimento de estratégias eficazes de quimioterapia para vários tipos de cancro. Alguns estudos epidemiológicos caso-controle apoiar o conceito de que o consumo de fitoquímicos dietéticos bioativos reduz o risco de câncer de pâncreas [6], [7]. proantocianidinas de semente de uva (GSPs) são fitoquímicos bioativos que demonstraram actividade anti-cancerígena em alguns modelos de tumores animais [8], https://carcin.oxfordjournals.org/cgi/content/full/24/8/1379 – B10 # B10and parecem apresentar o mínimo de toxicidade em animais de laboratório [9], [10]. GSPs são facilmente extraídos de sementes de uva-e, são uma mistura de dímeros, trímeros, tetrâmeros, e oligómeros de catequinas monoméricos e /ou (-) – epicatequinas [9], [10]. GSPs foram mostrados para ter anti-inflamatória, anti-oxidantes e anti-metastáticos propriedades tanto em

in vitro

e

in vivo

modelos [8] – [12]. Inibem por radiação ultravioleta e a carcinogénese da pele induzida por carcinógeno químico em modelos de ratos [9], [13]. Recentemente, mostrámos que a administração dietética de GSPs com dieta de controlo AIN76A resultou numa inibição dependente da dose do crescimento de xenoenxertos de tumor do cancro do pulmão de células não pequenas [14]. GSPs inibir o potencial invasivo do melanoma e cabeça e células carcinoma de células escamosas do pescoço, como avaliadas usando

in vitro

modelos [11], [12]. No entanto, o potencial anti-cancerígeno do GSPs contra o câncer de pâncreas é largamente inexplorado.

A fosfatidilinositol 3′-quinase (PI3K) /Akt é uma via de sinalização fundamental que medeia diversos processos celulares, incluindo proliferação celular, o crescimento , a sobrevivência das células e motilidade [15]. activação e a desregulação dos componentes da via PI3K /Akt Aumento têm sido implicados em muitas doenças malignas e em conferir resistência à quimioterapia [16]. Akt é uma serina /treonina-quinase bem caracterizada. O aumento da actividade de Akt tem sido implicado em vários tipos de cancros, em que promove a sobrevivência celular através de efeitos sobre numerosos alvos a jusante, incluindo a inactivação de proteínas pró-apoptóticas, a activação de genes anti-apoptóticos e a progressão do ciclo celular [17]. Activação da Akt é um evento frequente em câncer de pâncreas e está associada a maus prognósticos variáveis ​​e os resultados [18] – [20]. Um estudo revelou que 59% dos adenocarcinomas pancreáticos mostrou hiperativação da Akt [18]. Alguns estudos indicam que a inibição da via PI3K /Akt sensibiliza células cancerosas pancreáticas para o efeito apoptótica de quimioterapia tanto

in vitro

e

in vivo

[21] – [23].

no presente estudo, avaliou-se o efeito quimioterápico de GSPs sobre o câncer pancreático utilizando as linhas celulares de cancro MiaPaCa-2, PANC-1 e AsPC-1 humanos pancreáticas como

in vitro

modelos de cultura celular. Para verificar o

in vitro

dados, realizamos

In vivo

estudos de xenotransplante tumoral. Os nossos resultados mostram que o tratamento de células de cancro do pâncreas com GSPs resulta na inibição da proliferação celular, indução de apoptose e inibição da via PI3K /Akt.

Materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

Os anticorpos primários foram obtidos como se segue: anticorpos específicos para a proteína Bax, Bcl-2, Bcl-XL, caspase-3 clivada, PI3K, AKT, P-Akt e β-actina foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA); Ciclina B1, CDC25B, Cdc25C, Ki-67, e os anticorpos secundários, que foram horseradishperoxidase-conjugados, foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). O kit de PI3K siARN foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). A Anexina AlexaFluor488 Apoptosis Detection Kit conjugado-V foi adquirido a partir de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). O kit de ensaio de proteína foi de Bio-Rad (Hercules, CA). MTT (3- [4,5-dimetil-2-il] -2,5-difenil tetrazólio) e todos os outros produtos químicos eram de qualidade analítica e foram adquiridos à Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Os GSPs foram obtidos a partir da Kikkoman Corporation (Japão). A composição química e estabilidade de GSPs foram descritos anteriormente [9], [10].

Células e condições de cultura

linhas celulares de cancro pancreático humano, ASPC-1, PANC-1 e MiaPaCa -2, foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como recomendado como monocamadas em DMEM suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor fetal bovino (Hyclone, Logan, UT), 100 ug /ml de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA) numa incubadora humidificada a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera. Os GSPs foram dissolvidos numa pequena quantidade de dimetilsulf óxido (DMSO, 100 uL) antes da adição aos meios de comunicação. A concentração máxima de DMSO na mídia não excedeu 0,1% (v /v). As células tratadas com apenas DMSO serviu como um controlo do veículo.

Ensaios

A viabilidade celular e morte celular

O efeito de GSPs sobre a viabilidade das células de carcinoma de pâncreas foi determinada utilizando o ensaio de MTT, tal como descrito anteriormente [24 ]. Resumidamente, as células foram tratadas com ou sem GSPs durante 24 e 48 h. No fim do tempo estipulado, as células foram tratadas com 50 uL de 5 mg /ml de MTT e os cristais de formazano resultantes foram dissolvidos em 150 uL de DMSO. A absorvência da cor foi registada a 540 nm utilizando um leitor de microplacas Bio-Rad 3350. O efeito de GSPs sobre a viabilidade celular foi calculada em termos de percentagem de controlo, que foi arbitrariamente atribuído um valor de 100% de viabilidade. morte celular induzida por GSPs foi determinada utilizando um ensaio de exclusão de azul de tripano de corante, tal como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, as células foram tratadas com ou sem GSPs durante 24 e 48 h. Em seguida, as células foram colhidas, tratou-se com corante azul de tripano a 0,25% e as células que se tinham-se o corante foram contadas sob um microscópio usando um hemocitómetro. A morte celular induzida GSPs-se expressos como a média ± SD percentagem de células mortas em cada grupo de tratamento a partir de três experiências repetidas.

ciclo celular análise

MiaPaCa-2 e células PANC-1 foram tratadas com diferentes concentrações de GSPs (0, 20, 40 e 60 ug /mL) em meio completo durante 48 h. As células foram então colhidas e processadas para análise do ciclo celular, tal como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, a 1 × 10

5 as células foram re-suspensas em 50 uL de PBS frio a que 450 uL de metanol frio foi adicionado e as células foram então incubadas durante 1 h a 4 ° C. Após centrifugação, o sedimento foi incubado com ARNase A (20 ug /ml) durante 30 min. As células foram incubadas com iodeto de propídio (50 ug /mL) em gelo no escuro. A distribuição do ciclo celular das células foi então determinada utilizando um instrumento FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA) equipado com o software 3.3 celular quest no Mecanismo de núcleo da Cancer Center UAB completas.

A morte celular apoptótica a análise por citometria de fluxo

GSPs-induzida morte celular por apoptose em células de cancro do pâncreas foi determinada quantitativamente por citometria de fluxo utilizando anexina Alexa Fluor 488 Apoptosis Detection Kit V conjugada seguindo o protocolo do fabricante, como previamente descrito [24]. Resumidamente, após o tratamento de células com GSPs durante 48 h, as células foram colhidas, lavadas com PBS e incubadas com Anexina V Alexa fluor488 (Alexa488) e iodeto de propídio durante 10 min no escuro. As células marcadas foram então analisadas por triagem de células activadas por fluorescência utilizando o instrumento FACSCalibur (BD Biosciences) e celular quest 3,3 software.

Western blot análise

A seguir ao tratamento de células de cancro do pâncreas com ou sem GSPs as células foram colhidas, lavadas com PBS frio e lisadas com tampão de lise arrefecido em gelo suplementado com inibidores da protease como descrito anteriormente [24]. Para a análise de Western Blot, as proteínas foram resolvidas em géis de 10% Tris-glicina e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Depois de bloquear os sítios de ligação não específicos, a membrana foi incubada com o anticorpo primário a 4 ° C durante a noite. A membrana foi então incubada com o anticorpo secundário adequado peroxidase de rábano conjugada e as bandas proteicas imunorreactivas foram visualizadas utilizando reagentes de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A membrana foi, em seguida, despojado e sondado com anticorpo anti-actina para verificar a β Carga igual de proteína sobre o gel.

Animais e modelo de xenoenxerto de tumor

ratinhos nus atímicos fêmea de 4-5 semanas de idade foram adquiridos a partir do National Cancer Institute (Bethesda, MD) e alojados na Unidade de Recursos animais da Universidade do Alabama em Birmingham, em conformidade com as orientações animal Care Institucional e Comitê Use. O protocolo de origem animal utilizado neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade do Alabama em Birmingham, e o número do protocolo animal é: 101109267. Os ratos foram fornecidos com uma dieta AIN76A esterilizados e água

ad libitum

. Para determinar o

In vivo

eficácia quimioterapêutica da GSPs alimentares contra o crescimento de xenoenxerto de tumor pancreático humano, as células em crescimento exponencial MiaPaCa-2 (5 x 10

6 em 100 ul de PBS) foram injectadas subcutaneamente no flanco direito de cada rato. Um dia após a inoculação de células tumorais, os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos de oito ratinhos por grupo. Um grupo de ratinhos recebeu a dieta de controlo AIN76A, enquanto que o segundo grupo de ratos recebeu uma dieta de controlo AIN76A 0,5% GSPs-suplementado em pastilhas durante todo o período da experiência. O experimento foi encerrado no 11

th semana após a inoculação de células tumorais. O crescimento do tumor e peso corporal por ratinho por semana foi gravado. O tamanho do tumor foi medido utilizando calibradores vernier e os volumes foram calculados utilizando a fórmula modelo hemiellipsoid: volume do tumor = ½ (4π /3) (l /2) (W /2) h, em que L = comprimento, W = largura e H = altura . Com base nas diretrizes IACUC, tamanho do tumor não deve aumentar mais de 1,5 cm

2 ou tamanho de uma moeda de dez centavos. Nesta fase, a experiência foi terminada, os ratinhos foram sacrificados, o tumor de cada ratinho foi excisada e o peso húmido de cada tumor em cada grupo foi registado. Uma porção do tumor foi usado para preparar lisados ​​de tumor para análise por Western blot e a outra porção do tecido foi incluídos em parafina e utilizado para análise imuno-histoquímica.

detecção imuno-histoquímica de Ki-67-positivas, P-Akt células caspase-3-positiva -positivas e ativados

secções de tumor

parafina-incorporados (5 mm de espessura) foram desparafinados e reidratados, como descrito anteriormente [25]. Após reidratação, a recuperação de antigénio foi realizada colocando as lâminas em 10 mmol /L de tampão citrato de sódio (pH 6,0) a 95 ° C durante 20 minutos, seguido por arrefecimento de 20 min. As secções foram então lavadas em sítios de ligação de PBS e não específicos foram bloqueados com 1% de albumina de soro bovino com soro de cabra a 2% em PBS antes da incubação com anticorpo anti-Ki-67, anti-P-Akt ou anti-caspase-3 clivada anticorpo. Após a lavagem, as secções foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado seguido de estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano. As secções foram depois incubadas com substrato 2,4- diaminobenzidina e contrastadas com hematoxilina. Os Ki-67-positivas e células caspase 3-positivas numa secção foram contadas em, pelo menos, 4-5 campos diferentes e fotografadas utilizando um microscópio Olympus (modelo BX40F4, Tóquio, Japão) equipado com um Q-5 cor câmara Olympus.

TUNEL para células em apoptose

o ensaio TUNEL foi realizada utilizando deadend

Kit TM colorimétrico TUNEL System (Promega Corporation, EUA), seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, após a recuperação de antigénios, as secções de tumor (5 um de espessura) foram fixadas por incubação com 4% de paraformaldeído a 4 ° C. As secções permeabilizadas foram incubadas com a mistura de reacção e o nucleótido do terminal desoxinucleotidilo transferase recombinante (IDTE) enzima catalisada durante 60 min a 37 ° C no escuro. Depois da imersão em tampão /lavagem parada durante 15 min à temperatura ambiente, as secções foram lavadas com PBS para remover não incorporada fluoresceína-12-dUTP e os núcleos contrastados com hematoxilina. células positivas TUNEL foram examinados e contados ao microscópio. As células TUNEL positivos são expressos como uma percentagem do total de células no campo do microscópio.

A análise estatística

A significância estatística da diferença entre os valores dos grupos de controlo e de tratamento foi determinada por qualquer estudante

t

teste ou simples one-way ANOVA seguido de

post hoc

teste de Tukey para comparações múltiplas utilizando GraphPad Prism versão 4.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA, www. graphpad.com. Em cada caso,

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

GSPs inibir a viabilidade e induzir a morte de células cancerígenas pancreáticas

O antiproliferativa. efeitos de GSPs sobre linhas de células de cancro do pâncreas, MiaPaCa-2, PANC-1 e AsPC-1, foram determinadas utilizando um ensaio MTT. As células foram tratadas com diferentes concentrações de GSPs (0, 10, 20, 40 e 60 ug /ml) durante 24 e 48 h. Observou-se uma redução dependente da dose na viabilidade das células MiaPaCa-2, que variou de 2 a 35% (

P

0,05) após 24 h, e 20 a 60% (

P

0,01) após 48 h de tratamento com GSPs, como mostrado na Figura 1A. Sob condições idênticas, foram observados efeitos semelhantes de GSPs no tratamento de PANC-1 e células ASPC-1 (Figura 1B e 1C, painéis esquerdos) com excepção de que a redução da viabilidade das células ASPC-1 induziu GSPs-se menos do que a observada para as outras linhas celulares. Determinou-se também o efeito citotóxico dos GSPs sobre as linhas de células do cancro do pâncreas em termos de morte celular utilizando o ensaio de exclusão de corante azul de tripano. Como mostrado na Figura 1A (painéis da direita), quando comparados com os não-tratados GSPs células de controlo, o tratamento de MiaPaCa-2 com células GSPs resultou em um aumento significativo e dependente da dose da morte celular. O tratamento durante 24 h resultou numa 5-28% (

P

0,05) aumento na morte celular, enquanto que o tratamento durante 48 h resultou em 9-38% (

P

0,05 -0.001) morte celular. Utilizando condições idênticas, foram observados efeitos citotóxicos semelhantes no tratamento de células PANC-1 e AsPC-1 com GSPs (Figura 1B e 1C, painéis direitos).

(A) células MiaPaCa-2, (B) PANC -1 células, e células (C) AsPC-1 foram tratadas com as concentrações indicadas de GSPs para os períodos de tempo indicados. painéis da esquerda: A viabilidade das células foi determinada utilizando o ensaio de MTT, tal como descrito nos Materiais e Métodos. Os dados são expressos em termos de percentagem de células de controlo (não-tratado GSPs) como a média ± SD de 8 repetições. painéis da direita: O efeito citotóxico da GSPs em células de cancro do pâncreas foi determinada usando o ensaio de exclusão de azul de tripano de corante tal como descrito em Materiais e Métodos. Os dados de morte celular são apresentados como a percentagem média de células mortas de três experiências ± desvio padrão

vs. Grupo de controlo

(-tratadas não-GSPs). diferença significativa

vs

grupo controle,

*

P

. 0,001;

**

P

. 0,05

GSPs induzir G2-M parada do ciclo celular fase em células de câncer de pâncreas

A ruptura do cell- normais a progressão do ciclo e divisão são eventos importantes no desenvolvimento do cancro. Para determinar os possíveis mecanismos dos efeitos anti-proliferativos de GSPs, análise do ciclo celular foi realizado utilizando linhas celulares MiaPaCa-2 e PANC-1 tratadas com 20, 40 ou 60 ug /mL de SPG. Como mostrado na Figura 2A, após o tratamento de MiaPaCa 2-células com GSPs durante 48 horas houve um número significativamente mais elevado número de células na fase G2-M em todas as concentrações utilizadas: 20 ug /mL (15,5%,

P

0,05), 40 ug /mL (23,9%,

P

0,01) e 60 ug /mL (29,4%,

P

0,001), em comparação com o não-GSPs-tratados controles (5,9%). No ponto de tempo de 24 h, o efeito de GSPs em G2 /M do ciclo celular foi parada significativamente menor do que a observada após o tratamento durante 48 h. Efeitos semelhantes de GSPs sobre prisão fase G2 /M foram encontrados utilizando a linha celular PANC-1 (Figura 2B). A seguir, determinou-se a efeito de GSPs em proteínas reguladoras do ciclo celular envolvidas na fase G2 /M do ciclo celular. Os resultados da transferência de Western revelou que o tratamento de células de MiaPaCa-2 e PANC-1 com várias concentrações de GSPs durante 48 h resultou numa diminuição dependente da dose, na expressão B1 ciclina, bem como uma redução dos níveis de CDC25B e Cdc25C expressão proteínas que regulam a fase G2 /M do ciclo celular (Figura 2C).

MiaPaCa-2 e PANC-1 foram tratados quer com veículo (0,1% DMSO) ou GSPs (20, 40 e 60 ug /mL) em meio completo. Após 48 h de tratamento, as células foram colhidas e digerido com RNase. O ADN celular foi corado com iodeto de propídio e análise de citometria de fluxo foi realizada para analisar a distribuição do ciclo celular, tal como descrito nos Materiais e Métodos. Os histogramas do ciclo celular representativos de duas experiências independentes em MiaPaCa-2 (A) e PANC-1 (B) células após tratamento com diferentes doses de GSPs são mostrados. (C) Efeito de GSPs em G2 /M do ciclo celular fase proteínas reguladoras em MiaPaCa-2 e células PANC-1. As células foram tratadas com quer veículo ou GSPs (20, 40, 60 ug /ml em DMSO) durante 48 h e em seguida colhidas, lisados ​​celulares preparados e então sujeitos a SDS-PAGE seguido por análises de Western blot para várias proteínas. β-actina foi utilizada para verificar a carga igual das amostras. borrões representativos de três experiências individuais são mostrados.

GSPs induzir a apoptose de células de câncer de pâncreas

Para examinar se /M detenção fase da redução da viabilidade celular e indução de G2 no pancreático humano células cancerosas por tratamento GSPs estava relacionado com a indução de apoptose, as células MiaPaCa-2 e PANC-1 foram tratadas com várias concentrações de SPG e a percentagem de células apoptóticas foram avaliadas utilizando o Kit de Detecção de apoptose Alexa488. morte celular por apoptose foi determinada em termos de células em apoptose precoce ou em estágio final, que são mostrados, respectivamente, no quadrantes superior direito (UR) do FACS histogramas (Figura 3A) inferior direito (LR) e. O tratamento das células MiaPaCa-2 e PANC-1 com GSPs durante 48 h resultou numa indução significativa da apoptose em ambas as linhas celulares. As percentagens de células apoptóticas total (em quadrantes UR + LR) em MiaPaCa-2 células após os tratamentos GSPs foram as seguintes: 5,2% (controlo tratado com veículo), 16,6% (20 ug /mL,

P 0,05), 25,9% (40 ug /mL,

P

0,01), e 35,8% (60 ug /mL,

P

0,001), conforme resumido no Painel B foi observada. GSPs similares-indução de apoptose quando células PANC-1 foram tratados com GSPs durante 48 h, como mostrado na Figura 3A e 3B

.

MiaPaCa-2 e células (a) PANC-1 foram tratados com diferentes concentrações de GSPs (0, 20, 40 e 60 ug /mL) em meio completo durante 48 h, em seguida, colhidas para análise de células apoptóticas por análise de FACS utilizando o Anexina V-Alexa Fluor488 apoptose Vybrant Assay Kit (Alexa488) seguindo o o protocolo do fabricante. O quadrante inferior direito (LR) dos histogramas FACS indica a percentagem de células início apoptóticos (células Alexa488 coradas) e quadrante superior direito (UR) indica a porcentagem de células em apoptose tardia (Alexa488 + propídio as células marcadas com iodeto). (B) Número total de percentagens de células apoptóticas em cada grupo de tratamento ao fim de 48 horas estão resumidas com os dados apresentados como a média ± DP de duas experiências. diferença significativa

vs

grupo controle (não-GSPs-tratado), *

P

. 0,001; **

P Art 0,05. (C) Tratamento de MiaPaCa-2 e PANC-1 de células com concentrações variáveis ​​de GSPs durante 48 horas resulta em uma redução dependente da dose nos níveis das proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 e Bcl-XL), enquanto o aumento da expressão a expressão da proteína Bax pró-apoptótico. GSPs também aumentar o nível de activação de caspase-3 em células.

Efeito do GSPs sobre as proteínas da família Bcl-2 em células de cancro do pâncreas

Os membros da família Bcl-2 de proteínas desempenham papéis cruciais na regulação de apoptose por funcionando como promotores ou inibidores da morte celular [26] – [28]. A análise por Western blot revelou que o tratamento de células de MiaPaCa-2 com GSPs (20, 40, 60 ug /mL) durante 48 h resultou numa redução dependente da dose, na expressão da proteína Bcl-2 e Bcl-xl (Figura 3C), enquanto que a expressão de Bax foi acentuadamente regulada para cima com concentrações crescentes de GSPs (Figura 3C). Efeito semelhante de GSPs sobre as proteínas da família Bcl-2 foi também encontrado quando as células PANC-1 foram tratados com GSPs durante 48 h. Como caspase clivada 3 é considerada como sendo uma marca distintiva da apoptose, também determinado o efeito de GSPs na caspase-3 clivada nestas amostras e confirmou que os GSPs aumentou a activação ou a clivagem de caspase-3 em ambos MiaPaCa-2 e PANC -1 células (Figura 3C).

GSPs inibem PI3K /Akt expressão em células de cancro

Como a via PI3K /Akt sinalização desempenha um papel crítico na sobrevivência de células de cancro e desenvolvimento de cancros, nós examinaram os efeitos do GSPs neste percurso de sobrevivência celular. células MiaPaCa-2 e PANC-1 foram tratados com GSPs durante 48 h, os lisados ​​celulares preparados e os níveis de PI3K e fosforilação de Akt em Ser

473 determinado por análise de Western blot. Os resultados revelaram que o tratamento destas linhas celulares com GSPs durante 48 h diminuiu os níveis tanto do regulador (p85) e (p110) subunidades catalíticas de PI3K e também reduziu a fosforilação de Akt em Ser

473 numa concentração dependente modo (Figura 4A). Como é bem conhecido que a actividade de Akt é geralmente regulada por PI3K activada, que ainda verificado que a AKT é regulada por PI3K em células de cancro pancreático. Para este fim, bateu-se PI3K em MiaPaCa-2 e células PANC-1, utilizando o kit de PI3K siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) seguindo o protocolo do fabricante. Como mostrado na Figura 4B, análise de Western blot revelou que o siRNA knockdown de PI3K resultou em redução acentuada nos níveis de P-Akt em ambas as células MiaPaCa-2 e PANC-1. No entanto, não foi observado o efeito na expressão Akt total nestes linhas celulares em siRNA knockdown de PI3K. Knockdown de proteínas PI3K também foi verificada utilizando transferência de Western.

(A) Tratamento de MiaPaCa-2 e PANC-1 com as células GSPs diminui o nível de expressão de PI3Kp85 (regulador) e PI3Kp110 (catalítico), e fosforilação de Akt de uma forma dependente da dose. Após tratamento durante 48 h, as células foram colhidas, e os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot para determinar a expressão de proteínas diferentes. β-actina foi utilizada para verificar a carga igual das amostras de proteína. (B) knockdown siRNA de PI3K em células de cancro do pâncreas resultou na redução de níveis de P-Akt em relação ao grupo de controlo de siRNA.

GSPs dietéticos inibir o crescimento de xenoenxertos de tumores pancreáticos em ratinhos nus atímicos

Como estes

in vitro

estudos indicaram que o tratamento de células de câncer de pâncreas com GSPs reduz a viabilidade e induz a apoptose dessas células, procurou-se determinar se a administração dietética de inibe GSPs

in vivo

crescimento do tumor utilizando um modelo de rato de xenotransplante. À medida que o efeito terapêutico de GSPs em MiaPaCa-2 e linhas de células PANC-1 eram idênticas, selecionou-se a linha de células de MiaPaCa-2 por estes

In vivo

estudos. Em estudos anteriores também descobriram que GSPs alimentares na dose de 0,5% efeitos inibidores de crescimento significativas induzidas em tumores [9], [29], selecionamos esta dose de GSPs para mais

in vivo

estudo. Os ratos receberam a dieta de controlo AIN76A sozinho ou a mesma dieta suplementada com GSPs (0,5%, w /w). Os pesos médios corporais dos ratinhos GSPs-tratados e não tratados com GSPs foram comparáveis ​​durante o período experimental (dados não mostrados). De modo semelhante, os ratinhos que foram dadas GSPs na sua dieta não exibiram qualquer sinal de toxicidade física ou comportamento anormal (dados não mostrados). Estes dados sugerem que a administração de GSPs na dieta para a concentração utilizada nestes estudos não está associado com toxicidade bruta aparente.

medição semanal do volume do tumor indicaram que o crescimento médio do tumor em termos de volume total do tumor /rato foi maior nos ratos não-tratados com GSPs do que os grupos tratados com GSPs. Como mostrado na Figura 5A, em ratinhos que receberam GSPs na dose de 0,5% na sua dieta, o volume de tumor no final da experiência foi de 64% (

P

0,005) inferior. O experimento foi encerrado no dia 11

th semana após o implante de células tumorais. Nesta altura, os ratos foram sacrificados, os tumores colhidos, e o peso húmido do tumor /ratinho em cada grupo de tratamento foi registado. Como mostrado na Figura 5A (painel da direita), o peso húmido de tumores foi de 68% mais baixo (

P

0,005) em murganhos administrados com 0,5% GSPs na dieta, em comparação com os tumores de não-GSPs tenha sido tratada com ratinhos.

(a) a administração dietética de GSPs (0,5%, w /w) inibe o crescimento de MiaPaCa-2 as células cultivadas como xenoenxertos em ratinhos nus atímicos. O volume médio do tumor ± SD /ratinho (mm3) em cada grupo de tratamento foi medido semanalmente. tecidos xenoenxerto de tumor foram colhidas no final da experiência às 11 semanas e o peso húmido do tumor /ratinho em cada grupo é expresso em gramas como a média ± DP. A significância estatística da diferença entre controle e grupos tratados com GSPs foi analisada por ANOVA de uma via seguida pelo Bonferroni

t

teste, n = 8. significância estatística

vs

tumores de não-GSPs- controle camundongos tratados, *

P Art 0,005. (B) A detecção imuno-histoquímica de células positivas TÚNEL nos tecidos de xenoenxerto de tumor de ratinhos GSPs na dieta e ratos não receberam GSPs são mostrados, e os dados resultantes administrada em células de TUNEL-positivos estão resumidos. (C) Detecção imunohistoquímica de células de caspase-3-positivos activados em tecidos de xenoenxerto de tumor de ratinhos GSPs-tratados e não tratados com SPG. dados de imuno-histoquímica em termos de percentagem de células positivas são apresentados como a média ± DP de 5-6 amostras de tumor de cada grupo. células positivas TUNEL ou caspase-3-positivas foram contadas em quatro a cinco campos diferentes, e os dados são resumidos em termos de células positivas por cento a partir de amostras de xenoenxerto de tumor de 5-6. micrografias representativas são mostrados. (D) GSPs dietéticos inibir a expressão de proteínas anti-apoptóticas e aumentar a expressão de proteína pro-apoptótica, Bax, e os níveis de caspases-3 activada em tecidos de tumor de xenoenxerto. Os lisados ​​de tumor foram preparados a partir de xenoenxertos de tumores recolhidos no fim da experiência descrita na Figura 5A e sujeitas a análise de Western Blot, tal como descrito em Materiais e Métodos. borrões representativos são mostrados a partir de experimentos independentes de, pelo menos, cinco tumores de cinco ratos diferentes por grupo com observações idênticas.

GSPs dietéticos melhorar a morte celular por apoptose das células tumorais pancreáticas em xenoenxertos

Para determinar se a inibição do crescimento do tumor por GSPs dietética é causada pela morte de células tumorais em tecidos de xenoenxerto, foi avaliado o efeito de GSPs no índice apoptótico das células de tumor de xenoenxerto em amostras utilizando um ensaio de TUNEL.