Abstract

Fundo

Otto Warburg observou que as células cancerosas são muitas vezes caracterizadas por uma intensa glicólise na presença de oxigénio e uma diminuição concomitante na respiração mitocondrial. A investigação centrou-se principalmente sobre uma possível ligação entre o aumento da glicólise e desenvolvimento do tumor enquanto diminuiu a respiração tem sido largamente deixado sem vigilância. Portanto, uma relação causal entre a diminuição da respiração e tumorigênese não foi demonstrada.

Metodologia /Principais Achados

Para o efeito, as colónias de

Saccharomyces cerevisiae

, que é adequado para manipulação da respiração mitocondrial e mostra a morte celular mediada por mitocôndrias, foram usadas como um modelo. A repressão da respiração, bem como ROS-limpeza através de glutationa inibiu a apoptose e conferiu uma vantagem de sobrevivência durante a semeadura e desenvolvimento inicial desta população de células sólida rápido proliferando. Em contraste, o aumento da respiração desencadeada morte celular

Conclusão /Significado

Assim, o efeito Warburg pode contribuir diretamente para a iniciação da formação de câncer -. Não só pela glicólise aumentada – mas também através de uma diminuição respiração na presença de oxigênio, que suprime a apoptose

Citation:. Ruckenstuhl C, Büttner S, Carmona-Gutierrez D, Eisenberg T, Kroemer G, Sigrist SJ, et al. (2009) O Efeito Warburg Suprime o estresse oxidativo induzido apoptose em um modelo de levedura para o cancro. PLoS ONE 4 (2): e4592. doi: 10.1371 /journal.pone.0004592

editor: Julian Rutherford, Universidade de Newcastle, Reino Unido

Recebido: 26 de agosto de 2008; Aceito: 09 de janeiro de 2009; Publicação: 25 de fevereiro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Ruckenstuhl et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção FWF-FSP S93 FM e conceder STREP UE 511983 (TransDeath) para KU. F .. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

na década de 1920 Otto Warburg descrito o fenótipo bioquímico mais comum de células tumorais:, mesmo na presença de um nível normal de oxigénio, a glicólise é muito elevado e acompanhada pela produção de lactato elevada, bem como uma redução drástica mitocondrial respiração [1] – [3]. Embora este fenótipo é a base para o consumo de diagnóstico de tumor de monitorização de glucose [4], perguntas difíceis permanecem ainda desconhecidos: Por exemplo, como as células tumorais adoptar este fenótipo por diferentes mecanismos [5], [6], se os dois fenómenos (alta glicólise e diminuição da respiração) são causalmente associada [7], [8] e, finalmente, a sua contribuição específica para tumorigênese [7], [9] – [11].

rapidamente leveduras proliferam mostrar valores de fermentação semelhantes às células tumorais [12], permitindo, assim, para estudar a relação entre o metabolismo da energia e proliferação máxima. Notavelmente, a morte celular programada, o qual protege contra a tumorigénese, está intimamente ligada a processos mitocondrial em células de mamífero. As células de levedura também podem ser submetidos a morte celular programada [13], [14] de um modo dependente de mitocôndrias [15], [16], incluindo citocromo c e libertação FIA, a abertura do canal após a expressão do Bax humano [17] – [19], despolarização do potencial de membrana mitocondrial [20], e fragmentação mitocondrial [21].

a habilidade especial de leveduras Crabtree-positivas, como

Saccharomyces cerevisiae

para ligar e desligar a respiração em resposta a mudanças no a fonte de carbono e a possibilidade de produzir estirpes viáveis ​​falta de ADN mitocondrial (rho

0), permitem a avaliação genética rigorosas do papel da mitocôndria durante a morte celular [15], [22]. Aqui, nós avaliamos a possível ligação entre a morte celular suprimida e fosforilação oxidativa inibido, em colônias cultivadas a partir de uma única célula, assemelhando-se o crescimento do tumor.

Resultados e Discussão

Em uma máxima proliferando população de células sólida , respiração aumenta a produção de ROS e apoptose

S. cervevisiae

células herdam um sistema de repressão por glicose única que sobre o crescimento da glicose suprime drasticamente a respiração de forma independente da disponibilidade de oxigênio [23]. Modelando o crescimento do tumor, testamos se a célula-sobrevivência influências respiração reprimida durante o crescimento de populações de células a partir de uma única célula em mídia glicose. Três estirpes diferentes incapazes de respiração em conjunto com isogênico do tipo selvagem

S. cerevisiae

foram usadas num ensaio de colónia em colónias isoladas foram cultivadas a partir de células individuais. As células removidas a partir de colónias durante o desenvolvimento precoce de uma Rho

0 estirpe colónia exposição aumentou significativamente a sobrevivência em comparação com a estirpe de tipo selvagem (Fig. 1A). Consistentemente, a geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS), um processo firmemente ligado a e muitas vezes causador da morte celular programada, é diminuída (Fig. 1B).

(A) colónias isoladas foram cultivadas a partir de células individuais, manipulado em placas de agar. ensaio clonogênica de células retiradas de colónias da estirpe do tipo selvagem, ró

0 (sem DNA mitocondrial) e duas cepas único gene-exclusão (

mgm1

e

oxa1

), cresceu em SCGlu. Após 3 dias de 500 células de colónias inteiros, depois de 5 dias foram analisadas 500 células da colónia-região central (média ± SEM,

N

= 2). significância estatística de p 0,006 compara unidades formadoras de colónias (ufc) de cepas mutantes a estirpe de tipo selvagem nas respectivas pontos temporais. (B) As células de toda a colónia (3 dias), bem como a partir da região central (5 dias) foram coradas para as espécies de oxigénio reactivas (ROS) com dihydroethidium e analisadas por FACSAria citometria de fluxo (média ± SEM,

N

= 2; ** p 0,01, *** p 0,001 em comparação com estirpes de deleção em respectivos pontos de tempo). (C) cerca de 50 (2 dias) e 10 (3 dias) colónias que cresceram em placas de SCGlu foram eliminados por lavagem e ensaios clonogénicos foram realizados com as células recolhidas (média ± SEM,

N

= 5; ** p 0,01, *** p 0,001). (D) cerca de 50 colónias que cresceram em placas de SCGlu durante 2 dias foram coradas para a exposição de fosfatidilserina (AnnV) e quebra do ADN (TUNEL) e analisadas por citometria de fluxo FACSAria (média ± SEM,

N

= 3; ** p 0,01, *** p 0,001). células de colónias de tipo selvagem de idade (E) microscopia de fluorescência da região central e exterior de 5 dias, o plasmídeo abrigando dsRed-MLS.

Para excluir Rho

0 estirpe efeitos específicos não contabilização de deficiências respiratórias , duas outras estirpes de insuficiência respiratória foram investigados. estirpes individuais deleção do gene de ambos,

MGM1

(homólogo para humano

OPA1

) – uma GTPase localizado no espaço intermembranar mitocondrial [24] – e

oxa1

(um insertase da membrana mitocondrial interna – altamente conservada de procariontes aos mamíferos [25], [26]) comportou-se como o (tipo selvagem) rho

0 tensão. Depois de 3 e 5 dias,

mgm1

bem como

oxa1

células excluídas recuperados a partir de toda a colónia (3 dias) ou a região central (5 dias), e as células mais velhas, assim, principalmente, mostrou aumentou significativamente a sobrevivência (Fig. 1A), bem como a inibição da produção de ROS em comparação com amostras da estirpe de tipo selvagem (Fig. 1B). É de notar, ao contrário de outros respiração deficiente estirpes mutantes (incluindo rho

0 e Δ

mgm1

) do Δ

oxa1

cepa mostrou mesmas taxas de crescimento como a estirpe do tipo selvagem em culturas líquidas e durante o crescimento da colônia, respectivamente (Fig. 2 a e B). as curvas de crescimento

(a) de um

oxa1

estirpe eliminação e a correspondente estirpe de tipo selvagem. O experimento foi realizado em triplicado. O eixo y é escalada de forma logarítmica. (B) Tamanho das colônias isoladas das estirpes indicadas cultivadas para 3 e 5 dias em placas SCGlu, respectivamente. Diâmetros foram avaliados por processar as fotos com Metamorph Imagiologia (média ± SEM,

n

= 2).

Em uma abordagem complementar, colônias semeadas (10 e 50 por placa) de de tipo selvagem e Δ

oxa1

estirpes, respectivamente, foram lavadas a partir de placas SCGlu após 2 e 3 dias e a sobrevivência clonogénica foi avaliada. Novamente, a estirpe incapaz de respiração mostrou melhor sobrevivência do que o respiring estirpe de tipo selvagem (Fig. 1C). Além disso, a vantagem de sobrevivência do Δ

oxa1

estirpe já ocorreu após 2 dias, que é em boa conformidade com os dados anteriores que do tipo selvagem colônias cultivadas nos meios habituais de glicose onde mostrado para deixar a fase de crescimento logarítmica depois cerca de 36 horas [27].

para avaliar o tipo de morte celular induzida por nós examinado para marcadores apoptóticos usando ensaios AnnexinV e TUNEL. A apoptose foi significativamente diminuído em uma respiração deficiente

oxa1

mutante de deleção em comparação com o controlo de tipo selvagem (Fig. 1D). Deve notar-se que a digestão da parede celular de células do tipo selvagem foi menos eficiente. Por conseguinte, quantidades mais baixas de células coradas positivamente foram obtidos, em comparação com a sobrevivência celular observada em ensaios clonogénicos após 2 dias. Isto significa que a supressão observada de marcadores apoptóticos no

oxa1

estirpe eliminada é provavelmente ainda maior do que mostrado na 1D. Nesta linha, quando tratada com 30% mais mistura de enzimas para melhorar a digestão da parede celular, aproximadamente 37% de células do tipo selvagem apresentaram uma coloração positiva de TUNEL (dados não mostrados). fragmentação mitocondrial é um pré-requisito para a apoptose em leveduras. Portanto, a morfologia mitocondrial de células a partir de colónias de tipo selvagem (e não para a Rho

0 células, porque lhes falta a respiração) foi monitorizada utilizando DsRed carregando uma sequência de localização mitocondrial. Após 5 dias, as células a partir da região central (células assim mais velhas) mostraram um aumento drástico fragmentação das estruturas mitocondriais e, mais recentemente perfurados enquanto que as células mais jovens alimentada a partir da borda exterior exibida uma estrutura tubular normal das mitocôndrias (Fig 1E).

Nós concluímos que a revogação da respiração suprime apoptose e produção de ROS em uma população de células fortemente proliferando em meios sólidos.

valorização forçada da respiração provoca a morte celular durante a semeadura de uma população de células

câncer Novel terapias são baseados no pressuposto de que a reconstituição ou aumento de respiração forçada no interior de tumores sólidos pode conduzir à inibição do crescimento e a morte das células [10], [28], [29]. Para testar se a aplicação genético da morte celular influências de respiração durante a sementeira de uma população de células (que é o passo cronológica antes de uma colónia estabelece), experiências de meios-de deslocamento, utilizando a glicose (SCGlu), galactose (SCGal), e glicerol (SCGly) meios quanto alternando únicas fontes de carbono foram realizadas. Desse modo, a respiração ou é suprimido (SCGlu), em cooperação activa com a fermentação (SCGal), ou ele representa a fonte de energia eléctrica exclusiva (SCGly). Quando estacionário (não proliferantes) populações de líquidos de células de levedura de tipo selvagem cultivadas em SCGlu foram transferidas para SCGal sólido ou SCGly, apenas 65% ou 44%, respectivamente, das células semeadas foram capazes de formar uma colónia (Fig. 3A). Utilizando culturas altamente proliferativas de tipo selvagem BY4741 tensão (a partir da fase de crescimento exponencial), este efeito foi ainda mais pronunciada com quase nenhuma sobrevivência em ambos os meios respiratória (Fig. 3A). Foram obtidos resultados comparáveis ​​com culturas altamente proliferativas de outras estirpes de tipo selvagem, tais como AH22, TB50, e DBY746 (dados não mostrados) sob as nossas condições. Mesmo uma transferência na mesma alta media respiratória (de líquido SCGly para SCGly sólida) levou a uma formação de colónias diminuída de ~ 70% (em comparação com uma mudança de líquido SCGly para SCGlu sólida), sublinhando que, especificamente, o início do crescimento da colônia é negativa afectados por reforçada respiração (Fig. 3B).

(a) ensaio clonogênica das culturas pré-cultivada em SCGlu líquido. 500 células foram plaqueadas em SCGlu, SCGal, e SCGly placas de agar, respectivamente (média ± SEM,

N

= 3; *** p 0,001). (B) Ensaio clonogênica de culturas pré-cultivada em líquido SCGly. 500 células foram plaqueadas em placas de meio SCGly e SCGlu, respectivamente (média ± SEM,

N

= 2; ** p 0,01). (C) Células de toda a colónia (3 dias), bem como a partir da região central (5 dias) foram coradas para as espécies de oxigénio reactivas (ROS) com dihydroethidium (DHE). Valores de unidades fluorescentes relativas (RFU) foram normalizados para os valores estirpe de tipo selvagem (média ± SEM,

N

= 2; ** p 0,01, *** p 0,001). (D) Tamanho da isoladas do tipo selvagem colônias cultivadas em placas de meio SCGlu e SCGal foram monitoradas por tirar fotos em intervalos de tempo indicados. Diâmetros foram avaliados por processar as fotos com Metamorph Imagem (barra branca representa 1 cm) (média ± SEM,

n

= 3; * p 0,05, ** p 0,01).

valorização forçada da respiração suprime o crescimento e aumenta a produção de ROS de colônias

os efeitos observados de semeadura colónia suprimida quando a respiração é alta, também foram reflectidos na continuação do crescimento da população de células: Depois de dois dias de crescimento em sólida SCGal, as colónias exibido apenas metade do tamanho daquelas cultivadas em SCGlu sólida, embora ainda aumento de tamanho (após o atraso inicial) é comparável (Fig. 3D). O atraso inicial poderia ser associada a um ROS imediata estourar, como também confirmada pelos elevados drasticamente os níveis de ROS em colônias cultivadas em SCGal ou SCGly (Fig. 3C, também ver abaixo e Fig. 4C).

(A) cerca de 100 colónias foram cultivadas durante 36 horas em placas de SCGlu com ou sem 5 mM de GSH, lavada e ensaios clonogénicos foram realizados com as células recolhidas (média ± sEM,

N

= 3; ** p 0,01) . Além disso quantidades iguais de células foram coradas para espécies reactivas de oxigénio (ROS) com dihydroethidium (DHE) e quantificada utilizando um leitor de microplacas de fluorescência (Genios-Pro). Valores de unidades fluorescentes relativas (RFU) são exibidos (média ± SEM,

N

= 3; ** p 0,01) (B). (C) Ensaio clonogênica das culturas pré-cultivada em SCGlu líquido. 500 células foram plaqueadas em SCGlu, SCGal, ou SCGly placas de agar, respectivamente, com ou sem a GSH 1 mM (média ± EPM,

N

= 2; *** p 0,001).

Assim, o estabelecimento de uma população de células sólida fortemente proliferando exige a respiração ser reprimido.

a respiração mediada morte celular em colônias e células recém-semeadas é suprimido eficazmente via ROS limpeza

para demonstrar ainda mais que a respiração e que acompanha a produção de ROS é uma das principais causas da apoptose durante o desenvolvimento de colónias foi utilizado glutationa reduzida (GSH) como um reagente de eliminação: colónias de tipo selvagem e

oxa1

estirpes de eliminação foram cultivadas em placas de agar com SCGlu ou sem GSH e célula de sobrevivência foi determinada após 36 horas em um ensaio clonogênica. Considerando que o

oxa1

estirpe supressão não mostraram sobrevivência alterado após adição de GSH, a sobrevivência de células do tipo selvagem foi drasticamente melhorada (Figura 4A). Isto foi acompanhado por níveis de ROS diminuiu significativamente (Figura 4B). Curiosamente, que se prolonga a fase de crescimento fermentativo por duplicação da concentração de glucose nas placas de meio conduziu a um ligeiro aumento na sobrevivência das células (dados não apresentados).

Além disso, o efeito da glutationa como eliminador de ROS foi testado num teste de desvio, onde as células do tipo selvagem altamente proliferativas pregrown em meios líquidos SCGlu foram semeadas em placas de SCGly SCGal e com ou sem GSH. Surpreendentemente, a sobrevivência foi aumentada para 50% e 55%, respectivamente, em comparação com 1% de sobrevivência em placas sem GSH (Figura 4C.). Um deslocamento similar de células estacionárias obteve-se um aumento da sobrevivência de 50% e de 60% para 75% e 77%, respectivamente, em placas de GSH contendo (dados não mostrados). Conclui-se que ROS varrimento através de glutationa aumenta a sobrevivência das células durante o desenvolvimento de colónias, bem como durante a semeadura em meios altamente respiratórias. Curiosamente, tem sido relatado recentemente que em células de cancro e em neurónios (que também mostram o efeito Warburg), citocromo

C

é reduzido e mantido inactivo pela GSH [30].

Até agora , a investigação sobre o efeito Warburg tem se concentrado principalmente na alta fluxo glicolítico, enquanto a repressão de acompanhamento da respiração mitocondrial foi muitas vezes deixados sozinhos [8], [9]. Nossos dados demonstram que a respiração desencadeia a apoptose durante a semeadura e desenvolvimento de uma população de células, proporcionando evidência experimental direta em apoio à hipótese de Warburg durante o início da tumorigênese. A forte diminuição da capacidade respiratória pode ser crucial para a malignidade do tumor [12] e para a resistência contra a oxigenação flutuante inevitável em tumores [31], [32]. Interessantemente, demonstrou-se que a levedura rho

0 estirpes exibem aumento da resistência em relação a certos estímulos apoptóticos externos, tais como o ácido acético, o que desencadeia a morte através da via mitocondrial [15], [17]. Uma resistência contra a morte celular semelhante também podem desempenhar um papel para células tumorais numa envolvente ácida. Nós especulamos que a reprogramação de células de câncer segue um mecanismo antigo presente no

S. cerevisiae

colónias de tipo selvagem: alta glicólise na presença de oxigênio

Materiais e Métodos

Cepas e mídia

Os experimentos foram realizados em BY4741 (MATa

his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0

) e respectivos mutantes nulos de

mgm1

e

oxa1

, respectivamente, obtidos a partir de Euroscarf. A estirpe BY4741 Rho

0 foi construído por vários ciclos de tratamento de brometo de etídio como descrito anteriormente [33]. Para realizar a microscopia de fluorescência das estruturas mitocondriais o plasmídeo DsRED-MLS (DsRed carregando uma sequência de localização mitocondrial) [34] foi transformada em estirpe BY4741. Para chapeamentos sobrevivência YEPD (1% de extracto de levedura, 2% de peptona, e 2% de glucose) o meio foi suplementado com 2% de agar. Para todos os ensaios, as estirpes foram cultivadas em meio SC contendo 0,17% de base de azoto de levedura (Disco), 0,5% (NH

4)

2SO

4, e 30 mg /l de todos os aminoácidos (excepto 80 mg /l de histidina, 200 mg /l de leucina (sem leucina quando se trabalha com plasmídeo DsRED-MLS)), 30 mg /L de adenina, e 320 mg /L de uracilo com 2% de glucose (SCGlu), 2% de galactose (SCGal), e 3% de glicerol (SCGly), respectivamente, suplementado com 2% de agar, onde for necessário. A glutationa reduzida (GSH; Sigma-Aldrich) foi adicionada em concentrações de 1 mM ou 5, onde necessário

Isolado monocolony ensaio

Seis placas de Petri centímetro, fornecidos com 13 ml de meio SC sólido (. com ou sem leucina) foram usadas. células individuais de 16 a 20 horas culturas durante a noite foram colocadas em placas de mídia SC sólidas usando um micromanipulador (Série 200, Cantor Instruments). Para minimizar a desidratação das placas sólidas, a incubação foi realizada a 28 ° C numa câmara fechada, humidificada de reprodução (KBF115, Binder). Para a determinação de diâmetro, fotos foram tiradas nos pontos de tempo indicados (Microbiologia-Colônia-counter, LemnaTec) e processados ​​usando imagens Metamorph.

Curvas

Survival chapeamento, as experiências de mídia-shift, e crescimento

Para determinar a sobrevivência de células no interior da colónia, integrais quer colónias isoladas (no caso de 3 dias) e as amostras a partir das regiões centrais das colónias isoladas (no caso de 5 dias) foram removidas em intervalos de tempo indicados, ou SCGlu placas com cerca de 100 colónias (após 36 horas), 50 colónias (após 2 dias) ou 10 colónias (após 3 dias) foram eliminados por lavagem. As contagens celulares foram determinadas por um dispositivo de contagem de células (CASY Sistemas Scharfe) e de 500 células foram plaqueadas em placas de agar de YEPD. unidades formadoras de colônia (UFC) foram determinados após 2 ou 3 dias (no caso da respiração estirpes deficientes rho

0 e Δ

mgm1

) com um Microbiologia-Colônia-Counter (LemnaTec) e processados ​​usando SAWmicrobio versão 3.1.

para as experiências de meios improvisados, as culturas foram cultivadas em SCGlu e SCGly meios líquidos para logarítmica (6 h) e fixo (24 h) de fase, respectivamente, e 500 células foram plaqueadas em placas de meio sólido respectivos bem como em placas SCGlu em qualquer caso.

Para a avaliação das taxas de crescimento em meios líquidos, culturas durante a noite foram cultivadas em SCGlu. As culturas foram inoculadas a 5 × 10

5 células em SCGlu e crescimento celular foi monitorada durante 12 horas utilizando um dispositivo contador de células CASY.

A coloração para marcadores apoptóticos e microscopia de fluorescência

Coloração de espécies de oxigénio reactivas (ROS) com dihydroethidium (DHE), a Anexina V-coloração e TUNEL-coloração foi realizada como descrito anteriormente [34]. Em cada amostra de 30.000 células foram avaliadas utilizando citometria de fluxo (FACS Aria, BD) e processados ​​usando software FACSDiva. Alternativamente quantidades iguais de células coradas DHE foram medidos em um leitor de microplacas de fluorescência (Genios Pro-, Tecan).

morfologia mitocondrial foi inspeccionado por microscopia de fluorescência utilizando um filtro de DsRed num microscópio Zeiss Axioskop. As células da central, bem como a região externa do monocolonies isoladas de células do tipo selvagem que abrigam plasmídeo dsRed-MLS foram monitorados após 5 dias.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Estudantes T-Test (unilateral, não pareado), com * p 0,05, ** p 0,01 e *** p . 0.001, respectivamente

Reconhecimentos

Agradecemos Ulrike Potocnik para assistência técnica.