Sumário

chemoresistance na terapia do cancro é um fator prognóstico desfavorável no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Elevação do nível de cálcio intracelular em sublinhas resistentes a múltiplas drogas (MDR) leva a sensibilização das sublinhas MDR à morte celular. Foi demonstrado que uma proteína fúngica de

Ganoderma Microsporum

, GMI, eleva o nível de cálcio intracelular e reduz o crescimento da sub-linha MDR através autofagia e apoptose, independentemente da p-glicoproteina (P-gp), a sobre-expressão, de xenoenxerto em murganhos tumores. Além disso, nós examinamos os papéis de autofagia na morte de MDR A549 sublinhas de câncer de pulmão por GMI, thapsigargin (TG) e tunicamicina (TM)

in vitro

. Citotoxicidade de TG foi inibida por sobre-expressos P-gp. No entanto, a morte induzida por TM de sublinhas MDR foi independente do nível P-gp. Combinações de TG e TM, quer com docetaxel ou vincristina não apresentaram efeitos citotóxicos adicionais sobre sublinhas de MDR. apoptose TG- e TM-mediada de sublinhas MDR foi demonstrado em ensaio anexina-V e Western blot e reprimido pelo inibidor pan-caspase (Z-VAD-FMK). Tratamento de sublinhas de MDR com TG e TM também aumentada a autofagia com acúmulo de proteínas LC3-II, quebra de p62 e formação de organelas vesiculares ácidas (avos). A inibição da Atg5 por shRNA silenciamentos reduziu significativamente a autofagia e morte celular, mas não apoptose após TG ou tratamento TM. GMI tratamento inibiu a fosforilação de Akt /S473 e p70S6K /T389. Curiosamente, a fosforilação de ERK, não foi associada com autofagia induzida GMI. Conclui-se que a autofagia desempenha um papel pró-morte em MDR adquiridos e sobre-regulação da autofagia pela GMI via Akt /mTOR inibição fornece uma estratégia potencial para superar a MDR no tratamento dos cancros do pulmão

Citation:. Chiu LY, Hu ME, Yang TY, Hsin IL, Ko JL, Tsai KJ, et al. (2015) Protein imunomoduladora de

Ganoderma microsporum

Induz Pro-Death Autophagy através Akt-mTOR-p70S6K Pathway Inibição em multirresistente células tumorais. PLoS ONE 10 (5): e0125774. doi: 10.1371 /journal.pone.0125774

Editor do Academic: Vladimir Trajkovic, Faculdade de Medicina da Universidade de Belgrado, na Sérvia

Recebido: 18 de junho de 2014; Aceito: 26 de março de 2015; Publicado em: 06 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Chiu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC-100-2320-B-040-005) e do Ministério da Ciência e tecnologia, Taiwan (MOST-103-2320-B-040-015). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é o tumor maligno mais comum entre homens e mulheres. Embora a quimioterapia é o tratamento sugerido para o cancro do pulmão de células não pequenas avançado (CPNPC), a maioria dos pacientes desenvolvem uma resistência cruzada a uma variedade de fármacos quimioterapêuticos (por resistência múltipla da droga, MDR) [1]. P-glicoproteina (P-gp), o produto do humano

MDR-1

gene, é um membro da grande família de cassete de ligação de ATP de proteínas de membrana [2]. P-gp, se sobre-expressos em células de cancro, pode bombear fármacos anti-cancerígenos para fora das células. MDR é um problema crítico em quimioterapia. drogas e estratégias inovadoras são necessárias para superar a MDR obter melhor prognóstico. Para melhorar a eficácia da quimioterapia, uso de ervas medicinais chinesas como MDR invertendo agentes [3], moduladores de MDR do ATP de ligação transportadores de cassete [4] e soluções nanomedical para contornar MDR tem sido amplamente discutido [5].

Ambos docetaxel (DOC) [6] e vincristina (VCR) [7] são tubulina agentes de ligação (TBA) que foram aplicados clinicamente para vários regimes de quimioterapia do câncer. No entanto, eles são capazes de induzir a MDR. Usamos DOC e videocassete como agentes de seleção para tratar células NSCLC A549. Sob exposição contínua, várias sublinhas resistentes DOC e drogas VCR foram obtidos para uma investigação mais aprofundada. Em um estudo anterior, informamos que, quando combinado com DOC ou VCR, três do tipo L bloqueadores dos canais de cálcio, verapamil (VER), nifedipina e diltiazem, reverter MDR com diferentes eficácias em cumentos e sublinhas VCR resistente independentemente dos níveis de expressão de transportadores de efluxo [8]. Portanto, é lógico supor que a atividade do canal de cálcio bloqueador está associada a reversão da capacidade MDR. dados acumulados indicam que o tratamento do TBA leva a uma perturbação da homeostasia do cálcio [9]. Assim, a baixa do nível do banho de cálcio intracelular pode permitir células MDR-positiva para sustentar danos induzidos por radicais livres em associação com outros fatores, não identificados. Tomados em conjunto, alteração do nível de cálcio intracelular ([Ca

2 +]

cit) em sublinhas de câncer de pulmão TBA resistentes podem modular chemoresistance e ([Ca

2 +]

cit) vias mediadas são alvos potenciais para superar a MDR.

o retículo endoplasmático (ER) é uma partição de armazenamento de cálcio intracelular, que desempenha um papel na preservação da homeostase do cálcio celular [10]. Perturbações na homeostase ER afetar proteína dobrar para gerar a resposta proteína se desdobrar (UPR), também chamado de ER estresse [11]. ER stress pode ser garantido por agentes farmacológicos incluindo thapsigargin (TG) [12] e tunicamicina (TM) [13]. Quando as células são tratadas com TG, [Ca

2 +]

cyt aumentos de [14] para gerar autofagia [15] e a apoptose [16]. O tratamento com TM leva à indução de estresse ER com o aumento da [Ca

2 +]

cit e também está associada com apoptose [17] e autofagia [15,16]. Três factores de stress do ER, TM, ditiotreitol (DTT) e MG132 inibidor do proteassoma, foram testados em fibroblastos de embrião de ratinho (MEFs) e verificou-se induzir a autofagia, regulando negativamente Akt /target da rapamicina em mamíferos (mTOR) via [18]. No entanto, uma clara evidência de um mecanismo pelo qual a autofagia regula a morte celular em cancros MDR ainda está faltando.

A morte celular programada é classificado como apoptose, necrose ou autofagia [19,20]. vias apoptóticas incluem aqueles que são extrínseca e aqueles que são intrínseca. Cada caminho converge em cisteína proteases específicas de aspartato conhecidas como caspases de iniciação (8, 9, 10 e executor 3, 6, 7) [20]. Estas caspases clivar e ativar proteínas apoptóticos jusante, regulando assim a morte celular. A apoptose é um efeito importante do tratamento medicamentoso anti-câncer. Autophagy tem também sido extensivamente estudadas em terapia do cancro. Autophagy é controlado por um grupo de proteínas relacionadas com o gene autophagy evolutivamente conservada de proteínas (ATG) em um processo que inclui: (i) indução ou de iniciação, que se correlaciona com a formação de phagophore; (Ii) a nucleação; (Iii) o alongamento, Atg12-Atg5 e LC3 /Atg8 controlada passo crítico na formação dos autofagossomas; e (iv) maturação e degradação, em que os endossomas se fundem com autofagossomas-lisossomas para formar autolysosomes com a degradação do conteúdo luminais [21]. O nível adequado de autofagia que incentiva a sobrevivência da célula tumoral tem sido discutido como parte do papel pró-sobrevivência de autofagia em tumores estabelecidos [22,23]. Autophagy tem sido sugerido como um alvo para induzir a morte de células de cancro [24,25] e inibição da autofagia foi encontrada para melhorar os resultados na terapia do cancro [26]. No entanto, o estresse persistente pode promover extensa autofagia, levando à morte celular. Portanto, tanto a inibição autofágica [27] e indução têm sido considerados nas estratégias terapêuticas [24] e têm sido aplicados aos tratamentos anti-câncer. Se autofagia desempenha um pró-morte ou papel pró-sobrevivência após a resistência induzida pela quimioterapia permanece obscuro. É necessária mais investigação para resolver este problema e para melhor gerir chemoresistance adquirido.

recombinante proteína imunomoduladora fúngica, GMI, clonada a partir de

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e purificado, tem sido demonstrado que apresentam um efeito inibidor sobre migração induzida por EGF e invasão [28]. Esta proteína regula negativamente a expressão induzida por factor de necrose tumoral alfa de metaloproteinase de matriz 9 via NF-kappaB pathway [29] e induz autofagia através de uma via de sinalização mediada por cálcio em células A549 do cancro do pulmão humano [30]. A administração oral de GMI foi demonstrada para inibir significativamente o crescimento do tumor e induzir autofagia em ratinhos nus com tumor de xenoenxerto de células A549 [30]. Além disso, a acumulação autophagosome foi mostrado para induzir a morte celular por meio de autophagic Akt /mTOR em um modelo de células do cancro do pulmão tratadas GMI [31]. Para testar ainda mais a função anti-tumoral de GMI na quimiorresistência, tumores de origem animal xenoenxerto de A549 sub-linha resistente docetaxel foram tratados com GMI e analisados. Nós caracterizado ainda mais os papéis de apoptose e autofagia no MDR, comparando os efeitos de dois indutores de stress ER clássicos, TG e TM, com GMI em A549 sublinhas de câncer de pulmão docetaxel- e selecionou-vincristina.

Neste estudo, demonstramos os efeitos e limitações de autofagia sobre a morte de sublinhas de MDR com estressores ER, TG e TM, bem como um estressor novela, GMI, para compreender melhor os papéis de apoptose e autofagia na terapia do câncer anti-MDR. Induzida pelo GMI /inibição da via mTOR Akt na morte celular associada a autofagia é proposto como um método para contornar MDR.

Materiais e Métodos

Drogas e produtos químicos

DOC foi obtido da Aventis Pharmaceuticals Inc. (Bridgewater, NJ). VCR, VER, cloroquina e TM foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Z-VAD-FMK foi adquirido de Bachem (Torrance, CA). TG foi adquirido a Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido) e U0126 foi adquirido a Cell Signaling (Danvers, MA). GMI, fabricado pela Mycomagic Biotecnologia Co., Ltd. (Taipei, Taiwan), foi gerado e melhorados a partir de

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[28].

Flow-03:00 ensaio

aproximadamente 2 x 10

4 culas por po foram semeadas em placas de 24 poços. Após 24 h de incubação, as células foram expostas a VER em meio fresco durante 2 h. Após isso, as células foram expostas a DOC, VCR ou GMI. No final do período de exposição, as células foram tratadas com tripsina e incubadas durante 30 min em solução salina tamponada de Hank (HBSS) com 3 uM de Fluxo-03:00 (Invitrogen). Após a coloração, as células foram lavadas duas vezes com HBSS, colocados em HBSS contendo FBS a 5%, e analisadas por citometria de fluxo.

linhas de células e ensaio de citotoxicidade (ensaio de MTT)

células A549 do adenocarcinoma humano eram mantida como previamente descrito [8]. Os DOC e VCR sublinhas resistentes foram estabelecidas a partir de células parentais de forma gradual pela exposição a concentrações crescentes de DOC ou VCR. Resumidamente, para a sub-linha DOC, células A549 em baixa densidade celular foram semeadas em 10 cm de placa de Petri e tratados com 0,5 nM DOC até que as células sobreviventes cresceu a uma colónia óbvia. A colónia seleccionada foi amplificado na presença de 0,5 nM de DOC até confluência antes da dose do fármaco foi aumentado em múltiplos de dois para a ronda seguinte de selecção. A sub-linha resistente DOC mantida em 16 nM de DOC foi denotado A549 /D16. Uma designação semelhante, A549 /V16, foi dado a um VCR estavelmente sublinha resistente. As células foram expostas a várias concentrações de DOC, VCR ou GMI em meio fresco durante 48 h. sensibilidades droga para DOC, videocassete e GMI foram determinados em ensaio colorimétrico MTT. As etapas detalhadas de ensaio de MTT foram previamente descritos [8]. Os valores médios foram calculados a partir de três experimentos independentes.

análise de Western blot

Os procedimentos relevantes foram descritos em um relatório anterior [8]. Fizeram-se reagir as proteínas com um dos seguintes: anti-LC3A (# 4599), anti-LC3B (# 3868), anti-PARP (# 5625), anti-GADD153 (# 2895), anti-GRP78 (# 3177), anti -t-Akt (# 9272), anti-P-Akt Ser473 (# 9271), anti-p-ERK (# 4370), anti-P-p70S6K Thr389 (# 9234) adquirido a Cell Signaling (Danvers, MA), anti-p62 (GTX100685) obtido a partir de GeneTex (Irvine, CA) ou anti-β-actina monoclonal (Sigma, CA-40). A imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada com policlonal anti P-gp, seguido de anti-IgG de cabra (Santa Cruz Biotechnology) conjugado com peroxidase de rábano. Hematoxilina foi usada para contracoloração.

Anexina V ensaio

As células foram tratadas com tripsina e incubadas durante 30 min em tampão de ligação com iodeto de propídio (PI) e anexina V (FITC anexina V de detecção da apoptose Kit 1, BD Biosciences, San Jose, CA), seguido de análise com citometria de fluxo.

Medição do potencial de membrana mitocondrial por JC-1 Ensaio

Foi utilizado JC-1 (5 ‘, 6,6 ‘-tetrachloro-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodeto) e uma membrana disruptor de potencial mitocondrial, CCCP (carbonil cianeto de 3-clorofenilhidrazona), para o estudo do potencial de membrana mitocondrial (JC-1, Molecular Probes, Eugene, OU). mitocôndrias polarizadas aparecem mitocôndrias como vermelho e despolarizadas como verde. A apoptose foi indicado por um aumento na proporção verde /vermelho intensidade de fluorescência. Para cada amostra, as células (5 × 10

5 células /ml) foram suspensas em 1 ml de tampão PBS e JC-1 (concentração final, 2,5 ug /ml) foi adicionada à amostra, a qual foi incubada durante 10 min a 37 ° C. As células marcadas foram então centrifugadas a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente e o sobrenadante foi removido cuidadosamente. O sedimento foi, em seguida, lavou-se com 1-2 mL de PBS. As células foram analisadas imediatamente com citometria de fluxo (BD FACSCalibur).

Detecção e quantificação de organelas vesiculares ácidas (avos)

As etapas detalhadas de análise de AVO foram previamente descritos [30]. Resumidamente, após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes com HBSS, seguido por coloração com 1 g /mL de acridina laranja (Sigma, A 6014) e diluição em HBSS contendo FBS a 5% durante 15 min. Após a coloração, as células foram lavadas com HBSS e suspensas em HBSS contendo 5% de FBS. As células foram observadas ao microscópio de fluorescência filtro vermelho. Para quantificar a formação de AVO, células coradas de laranja de acridina foram colhidas e lavadas duas vezes com HBSS, ressuspensas em HBSS contendo FBS a 5% e analisadas com citometria de fluxo e o software CellQuest.

Atg5 silenciamento por lentivírus shRNA expressar

infecção Lentivirus de A549 /D16 e sublinhas A549 /V16 foi realizado para integrar de forma estável e expressar curto RNA hairpin (shRNA) visando seqüências de mRNA Atg5. As etapas detalhadas de produção lentivírus foram previamente descritos [30].

modelo animal de tumores de xenoenxerto

Para

in vivo

ensaio de crescimento tumoral, macho de 4 semanas de idade ratinhos imunodeficientes (NOD.CB17-Prkdcscid /IcrCrlBltw) foram adquiridos de BioLASCO Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). procedimentos experimentais e manipulação foram conduzidos de acordo com as directrizes internacionais para estudos com animais de laboratório. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados Chung Shan Medical University Animal (Permit Number: 1238) e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Para estabelecer xenoenxertos de tumor A549, os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 5 x 10 células

6 A549 /D16 (100 ul), mais 100 ul de Matrigel (BD Biosciences, 354234). Seis animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos constituídos por três animais cada. Sete dias após o implante celular, os ratinhos no grupo PBS foram tratados com 100 ul de PBS por gavagem uma vez por dia e serviu como controlos. O grupo foi administrado GMI GMI (160 ug por ratinho diluído em 100 ul de PBS) por gavagem uma vez por dia. Os tamanhos dos tumores foram medidos a cada 3 dias começando no dia 16 após a injecção de células e o volume do tumor foi calculado pela fórmula: 0,5 x diâmetro maior (mm) x diâmetro pequeno

2 (mm). Devido a variabilidade do tamanho do tumor e do tamanho pequeno dos grupos, um teste não paramétrico de Mann-Whitney foi aplicado com p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Após os animais foram sacrificados, os pesos dos tumores foram medidos na microbalança e os lisados ​​de tumor (10-50 ug) foram analisados ​​em Western blot que utiliza tecido de proteína Tampão de Extracção (FIVEphoton Biochemicals, San Diego, CA) para preparação de proteína.

a análise estatística

Todos os valores são apresentados como média ± SD. Os dados foram comparados entre os grupos utilizando t-teste e * p . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

níveis intracelular baixos de cálcio ([Ca

2 +]

cit) de células A549 quimiorresistentes são regulada pela TBA combinação e tratamento verapamil ou GMI

Anteriormente, mostramos que MDR de A549 /D16 sublinha é mediada pela ABC transportadores (MDR típico) e MDR de A549 /sublinha V16 é mediada por não-ABC fatores associados com os transportadores (MDR atípica) [8]. P-gp é regulada na sub-linha A549 /D16 e reprimidos na sub-linha A549 /V16. Ambas as sublinhas são resistência cruzada ao DOC e videocassete. Colocámos a hipótese de que o mecanismo de tipo L bloqueadores dos canais de cálcio em reverter a sensibilidade do TBA de células resistentes a fármacos está associada à alteração da homeostase do cálcio intracelular. Para determinar ainda mais os níveis de cálcio intracelular ([Ca

2 +]

cit) de células cancerosas parentais e sublinhas resistentes a múltiplas drogas, Fluo-03:00 serviu como o indicador fluorescente de cálcio intracelular em citometria de fluxo. Além disso, combinado foi determinada VER e tratamento TBA a alteração da [Ca

2 +]

cit seguinte. Os resultados mostraram que [Ca

2 +]

cyt de multi-resistente, que sobre-expressam P-gp, A549 /sub-linha D16 (Fig 1A) é mantida tal como demonstrado por um nível de fluorescência mais baixos do que as células parentais A549. Curiosamente, em resistente à quimioterapia e P-gp subregulado A549 /V16 sublinha inferior [Ca

2 +]

cit também foi mantida (Fig 1B). Os dados mostraram que a [Ca

2 +]

cit em sublinhas quimiorresistentes é menor do que nas células parentais A549. Quando a A549 /D16 (Fig 1C) e o A549 /V16 células (Fig 1D) foram pré-tratados com c seguido de TBA, o nível de fluorescência detectada significativamente aumentado, o que implica que a [Ca

2 +]

cit sublinhas de quimiorresistentes é elevada quando VER re-sensibilização de células quimiorresistentes são expostos a citotoxicidade TBA. Regulação positiva de [Ca

2 +]

CYT por tratamentos VER e TBA combinados foi independente do nível de expressão P-gp. Para testar o efeito de GMI na [Ca

2 +]

cit, ambas as sub-linhas foram tratadas com GMI (1,2 uM) durante 24 h ou 48 h, seguida de análise em ensaio Fluo-03:00. O sinal de fluorescência em-tratada GMI sub-linha A549 /D16 aumentada após 24 h (Fig 1E) e aumentou ainda mais depois de 48 h de tratamento GMI (Figura 1G) Resultados semelhantes foram observados em sub-linha A549 /V16 tratada com GMI durante 24 h (Figura 1F ) e 48 h (Fig 1H). Os dados suportados nossa hipótese de que fez subir a [Ca

2 +]

cit desempenha um papel significativo na sensibilização de células de cancro de pulmão resistente à quimioterapia, à morte. Além disso, GMI é capaz de induzir [Ca

2 +]

elevação cit em sublinhas de MDR.

Para examinar a [Ca

2 +]

cit, o corante fluorescente Fluo -3AM foi incubado com (A) A549 parental e células A549 /D16, células A549 e A549 parental /V16 durante 30 min (B). linha fina representa fluorescência de fundo, sem Fluo-03:00 incubação. A linha grossa representa a fluorescência medida por citometria de fluxo. Para medir VER modulação de [Ca

2 +]

cit, (C) A549 células /D16 e células A549 /V16 (D) foram pré-tratados com c (10? M) durante 2 h, seguida de DOC ( 16 nM) e VCR (16 nM) durante 48 h de tratamento, respectivamente. O [Ca

2 +]

cyt de células A549 /D16 tratados com GMI (1,2 uM) durante 24 h (E) ou 48 h (g) foram regulados positivamente. O [Ca

2 +]

cyt de células A549 /V16 tratados com GMI (1,2 uM) durante 24 h (F) ou 48 h (H) também foram regulados positivamente. Depois de Fluo-03:00 de incubação, as células foram visualizadas por citometria de fluxo. A contagem do número de células (contagem) é indicado pelo eixo Y e a intensidade de Fluo-03:00 (FL1-H) é indicado pelo eixo X.

GMI inibe a P-gp que sobre-expressam o crescimento tumoral em ratinhos modelo de xenoenxerto

Anteriormente, demonstrou-se que, após pré-tratamento com o quelante de cálcio BAPTA-AM, a morte celular induzida por GMI é bloqueado. Aparentemente, GMI induz a morte celular do cancro do pulmão através de uma via de sinalização dependente de cálcio [30]. Portanto, testou-se a sensibilidade de células cancerosas para o tratamento GMI quimiorresistentes no ensaio de MTT (Fig 2A). Os resultados mostraram que tanto a A549 /A549 e D16 /V16 sublinhas responder aos GMI (0,3 a 1,2 ^ M) de um modo dependente da dose. As sensibilidades GMI de A549, A549 /A549 e as células D16 /V16 com IC calculado

50 estão listadas na Tabela 1. Além disso, os ratinhos foram inoculados subcutaneamente com a sub-linha A549 /D16 expressando alta P-gp. Os fardos de tumores em ratinhos tratados com PBS ou GMI são mostrados na Fig 2B. Quando comparado com o grupo de murganhos administrados com PBS, o crescimento de tumores no grupo de GMI foi significativamente inibida. Embora o volume do tumor calculado era comparável à P1 e P3, a necrose significativa do tumor P2 resultou no menor tamanho do tumor P2 recuperado. Para assegurar a proliferação de células cancerosas implantados, foi testada a eficácia GMI quando os tumores atingiram um volume de 200 mm

3 no dia 40 após a implantação (Fig 2C). O efeito anti-tumoral de GMI não foi restringida em tumores grandes.

(a) a análise dos efeitos de GMI (0,3, 0,6, 0,9 e 1,2 uM) sobre a viabilidade das células em A549, A549 /A549 e D16 /células V16 no ensaio MTT. (B) Sete dias após a implantação de células A549 /D16, os ratinhos no grupo PBS foram tratados com PBS ou GMI por gavagem uma vez por dia. Os tamanhos dos tumores do grupo de PBS e o grupo de GMI foram medidos após os ratinhos foram sacrificados no dia 64. (C) Os ratinhos foram injectados por via subcutânea para a implantação de células A549 /D16. Quando o volume do tumor atingiu 200 milímetros

3 no dia 40, os ratinhos no grupo PBS foram tratados com PBS ou GMI por gavagem uma vez por dia. Os resultados são apresentados como média ± DP. um teste não paramétrico de Mann-Whitney foi aplicado com p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. (E) Os níveis de c-PARP, LC3A e LC3B em seis tumores de xenoenxerto foram determinados por Western blotting com análise estatística dos LC3A-II e expressões LC3B-II. (D) os resultados de positividade representativos de P-gp em tumores de pulmão de A549, A549 /D16 tratados com PBS (P1) e A549 /D16 tratado com GMI (G1) foram obtidos por IHC.

clivagem apoptose mediada de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP-1) por Capase-3 produziu um fragmento de 89 kDa C-terminal (C-PARP, contendo o domínio catalítico) que serviu como o marcador molecular em imunoblots. Para elucidar o ER autofagia regulada por stress, foi analisada a proteína da cadeia leve da proteína associada ao microtúbulo (LC3). LC3 tem três isoformas (LC3A, LC3B e LC3C) [32] dos quais LC3A e LC3B foram examinados. Os tumores tratados com GMI expressa níveis elevados de C-PARP, LC3A-II e proteínas LC3B-II, o que indica maior autophagic e actividades apoptóticas do que nos tumores de controlo tratados com PBS (Figura 2D). Para demonstrar a expressão elevada da P-gp em tumores de xenoenxerto, IHC da P-gp foi aplicado aos tumores representativos de P1, G1 e células A549 parentais (Figura 2E). Os tumores P1 e G1 apresentou forte expressão da P-gp em contraste com os tumores de células A549. Os dados destas experiências de tumor ratos de xenotransplante demonstrou que GMI inibe o crescimento de P-gp superexpressão células quimiorresistentes e induz a apoptose e autofagia.

A apoptose e autofagia são diferencialmente reforçada pela GMI, TG e TM em MDR sublinhas de câncer de pulmão

Para determinar se os efeitos de GMI, TG e TM na apoptose e autofagia é dependente da dose, nos tratados sublinhas de MDR com diferentes concentrações de GMI, TG e TM seguindo-se a caracterização dos marcadores moleculares nos imunoblots. Um dos componentes da via de apoptose mediada por ER stress é C /EBP proteína homóloga (CHOP), também conhecido como gene danos induzível arrest- crescimento e de ADN 153 (GADD153). Outra proteína de stress é mediada por ER GRP78, também conhecido como Bip [11]. ER stress relacionado com GRP78 GADD153 e proteínas foram detectadas na A549 /D16 (Fig 3A) e sublinhas A549 /V16 (Fig 3B) a seguir ao tratamento GMI. A proteína c-PARP mediada por apoptose foi regulada positivamente após tratamento GMI como foram os marcadores de proteínas autofágicos LC3A-II e LC3B-II.

células A549 /D16 (a) (2 × 10

5 células) foram tratados com várias concentrações de GMI, durante 48 h. Níveis de GADD153, GRP78, C-PARP, LC3A-I, LC3B-I, II-LC3A, LC3B-II e p62 foram detectadas por Western blotting. Condições semelhantes foram aplicados a células (B) A549 /V16 tratados com GMI. (C) Análise de Western blot dos níveis de proteína em A549 sublinha /D16 e sublinha (D) A549 /V16 induzidas pelo TG. As células A549 /D16 (E) foram tratados com várias concentrações de TM, durante 48 h. Condições semelhantes foram aplicados a células A549 /V16 (F). (G e H) Ambas as sublinhas foram tratados com concentração GMI indicado com o ausente ou presente da cloroquina. A expressão de β-actina serviu como um controlo de carregamento.

GADD153 proteína não foi detectada em A549 /D16 sub-linha (figura 3C), mas foi induzida por TG em A549 /V16 sub-linha (Fig 3D). As proteínas de GRP78 poderia ser detectado fracamente com o tempo de exposição mais longo (Fig 3C). Eles foram encontradas em quantidades significativamente mais elevadas em A549 /V16 sub-linha (Fig 3D) no imunoblot. Houve uma indução dependente da dose de GADD153 por TM na A549 /D16 (Fig 3E) e a A549 /V16 (Fig 3F) sublinhas. Os níveis de proteínas C-PARP bem coordenados com os níveis de proteína GADD153 em ambas as sub-linhas (Fig 3D, 3E, 3F) e. Os nossos dados também mostraram que LC3A-II é expressa no A549 sub-linha /D16 e aumentos seguinte 200 tratamento nM TG, enquanto que o nível de LC3B-II não aumenta mesmo no âmbito da dose elevada (200 nM) tratamento TG (Fig 3C) e um maior tempo de exposição no immunoblot. Curiosamente, sob selecção de TBA, ambos A549 /A549 sublinhas D16 e /V16 mostraram níveis baixos de expressão LC3B-II (Fig 3A, 3C, 3E, 3B, 3D e 3F, 0 nM, respectivamente). TG e TM aumentou a acumulação de proteínas LC3-II de um modo dependente da dose em A549 /sub-linha MDR V16 mas não em sub-linha A549 /D16, que expressa elevado nível de P-gp a seguir ao tratamento TG (Fig 3C). Curiosamente, quando a p62, o indicador de fluxo autofagia que se degrada no autolysosomes [33], foi monitorizado em sublinhas MDR após o tratamento GMI, a sua expressão não foi reduzida quando LC3-II aumentou (Figura 3A e 3B). Em contraste, os níveis de proteína de p62 diminuiu em TG (Fig 3D) e sublinhas TM-tratados (figura 3E e 3F). A formação de LC3-II e quebra significativa de p62 indicar o início e conclusão do fluxo autofágica seguinte TG e tratamento TM em sublinhas de MDR (Fig 3D, 3E e 3F). No nosso relatório anterior, demonstramos que GMI-induzida resultados de acumulação autophagosome na morte autofágica em células A549 [31]. Isto pode explicar o nível estável de p62 em sublinhas-tratados GMI (Figura 3A e 3B). Nós ainda testado se o fluxo autophagic induzida GMI pode ser observada com um inibidor lisossomal, cloroquina que inibiu o volume LC3-II endógeno [24]. Quando comparado com o tratamento GMI, acumulação significativa de proteínas LC3A-II em sublinhas que co-tratados com cloroquina foram demonstrados (Fig 3G e 3H). Estes dados demonstraram que o fluxo induzido GMI autophagic em células cancerosas MDR. A partir destes resultados, o stress ER aumentada promove as expressões de autofagia e apoptose proteínas reguladas em sublinhas de MDR. Os dados indicaram que os graus de apoptose e autofagia são dependentes das concentrações de GMI, TG e TM. GMI induz estresse ER, apoptose e autofagia em MDR sublinhas semelhante a actividades TG e TM, mas com eficácia diferente.

TM e TG induzir a morte de MDR sublinhas de câncer de pulmão, mas a eficácia TG é restringida por superexpressão P-gp

Foram examinados ainda mais a regulação do crescimento de ambas as sublinhas MDR por TG e TM em ensaio MTT. Para as células A549 parentais, havia aproximadamente 32% a sobrevivência das células após o tratamento com 200 nM de TG. A citotoxicidade foi aumentada quando as células A549 foram cotreated com TG e DOC (16 nM), o que resulta em sobrevivência de células de 19% a 200 nm TG. A viabilidade da sub-linha A549 /D16 não foi afetada pela TG ou TG co-tratamento com DOC (Fig 4A). Em contraste, quando as células A549 /V16 foram tratados com TG (200 nM), 41% das células sobreviveram (Figura 4B). Combinação de videocassete (16 nM) e TG não teve nenhum efeito citotóxico adicional sobre a sub-linha A549 /V16. Tem sido relatado que o ED é um substrato de P-gp [29]. Por isso, foi aplicado o inibidor de P-gp, Ver, para determinar se a citotoxicidade de TG pode ser recuperada na sub-linha A549 /D16. Os resultados mostraram que quando 4 uM VER foi adicionado, a viabilidade da sub-linha A549 /D16 foi reduzida para 42% a 200 nm TG (Fig 4E).

(A), A549 e A549 parental /células D16 (2 × 10

4 células /cavidade) foram tratados com várias concentrações de TG com DOC (16 nM) ou sem DOC durante 48 h para as medições de sensibilidade aos fármacos. Condições semelhantes foram aplicados a células (B) A549 e A549 /V16 com videocassete (16 nM). As células A549 e A549 /D16 parental (C) foram tratadas com várias concentrações de TM com DOC ou sem DOC durante 48 h para as medições de sensibilidade aos fármacos. Condições semelhantes foram aplicadas a (D) A549 e células A549 /V16. As células A549 /D16 (E) foram pré-tratados com c (0, 0,5, 1, 2 e 4 uM) durante 2 h, seguida de várias concentrações de TG durante 48 h. A viabilidade celular foi analisada no ensaio MTT.

As células A549 parentais foram também sensíveis à TM citotoxicidade de uma forma dependente da dose. Quando as células A549 foram tratados com TM (2,5? M), aproximadamente 33% sobreviveram. Quando DOC foi combinado com TM, 18% das células A549 permaneceram parentais. A sub-linha A549 /D16 também respondeu a TM citotoxicidade mas com menor sensibilidade do que as células parentais. DOC co-tratamento com TM não mostraram nenhuma citotoxicidade adicional em células A549 /D16 (Fig 4C). A sub-linha A549 /V16 foi menos sensível ao TM do que a sub-linha A549 /D16 células sobreviventes com 70% a 2,5 uM TM. Co-tratamento com VCR não teve nenhum efeito significativo sobre a viabilidade de células A549 /V16 (Fig 4D). Estes dados demonstraram que as células A549 parentais são sensibilizados para TG /TM com citotoxicidades adicionais quando DOC ou VCR é combinado com TG ou TM. No entanto, A549 /A549 e D16 /V16 sublinhas são menos sensíveis do que as células TM de parentais. As sensibilidades de drogas de A549, A549 /D16 e as células A549 /V16 para TG e TM com calculada IC

50 estão listadas na Tabela 1. A partir da análise dos dados, apenas o A549 /células V16 foram mais sensíveis ao TG do que parental As células A549 (Figura 4B). As sublinhas MDR eram insensíveis à TG (Fig 4A) e menos sensíveis a TM, quando comparado com células A549 parentais (Fig 4C e 4D).

apoptose Quantificação de TG- e TM-induzida e autofagia

Além de examinar os marcadores de proteínas da apoptose, usamos ensaio JC-1 e anexina-V para quantificar a apoptose em sublinhas TG e TM-tratados.