Abstract

A instabilidade de microssatélites (MSI) é caracterizada pela expansão ou contração da tratos DNA repetidos em consequência da deficiência de DNA mismatch reparação (MMRD) . detecção precisa de MSI em células cancerosas é importante desde que a MSI está associado a vários subtipos de câncer e pode ajudar a informar decisões terapêuticas. Embora ensaios experimentais foram desenvolvidos para detectar MSI, que normalmente dependem de um pequeno número de genes conhecidos loci microssatélites ou reparação de incompatibilidade e ter confiabilidade limitada. Aqui, nós relatamos uma abordagem de todo o genoma da novela para a detecção MSI baseado na detecção global das inserções e deleções (Indels) em microssatélites encontrados em genes expressos. Nosso grande escala análises de 20 linhas celulares de cancro e 123 indivíduos normais revelou características InDel marcantes associados à MSI: há um aumento significativo de deleções microssatélites curtas em amostras MSI comparado a estabilidade de microssatélites queridos (MSS), sugerindo um viés mecanicista da eficiência do reparo entre inserções e deleções em células humanas normais. Ao incorporar esta observação em nossa MSI marcando métrica, mostramos que a nossa abordagem pode distinguir corretamente entre linhas celulares de cancro MSI e MSS. Além disso, quando nós aplicamos esta abordagem de amostras de tumor primário, a nossa métrica também é bem consistente com o estado MSI diagnosticada. Assim, nosso estudo oferece uma nova visão sobre sistema de DNA mismatch reparação, e também fornece um novo método de diagnóstico MSI para a oncologia clínica com maior confiabilidade

Citation:. Lu Y, Soong TD, Elemento O (2013) Uma nova abordagem para caracterizar instabilidade de microssatélites em células cancerosas. PLoS ONE 8 (5): e63056. doi: 10.1371 /journal.pone.0063056

editor: Yousin Suh, Albert Einstein College of Medicne, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de setembro de 2012; Aceito: 01 de abril de 2013; Publicado em: 06 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. OE seria gostaria de acusar a recepção da National Science Foundation (NSF) Career Grant 1054964. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Em células normais, o sistema de reparo incompatível (MMR) fornece um mecanismo altamente eficiente para corrigir os erros que ocorrem durante a replicação do DNA. Quando alteradas, por exemplo, através de inactivação de genes de reparação de emparelhamentos incorrectos humanos, tais como MLH1, MSH2 e MSH3, deficiência de reparação de emparelhamentos incorrectos leva a não corrigidos inserções /eliminações (indels), particularmente dos microssatélites em que uma unidade de sequência curta (um a seis nucleótidos de comprimento) é repetido várias vezes [1] .

a instabilidade de microssatélites (MSI) refere-se à condição geneticamente aberrante em que microssatélites alelos no ganho de genoma ou perder repetir unidades em muito maior frequência do que em células normais. A condição normal é muitas vezes referida estáveis ​​como microssatélites, ou MSS. Generalizada MSI geralmente indica deficiência de reparação de emparelhamentos incorrectos (MMRD), o que pode causar a acumulação de mutações em genes relacionados com o cancro e levar a carcinogénese e a progressão do tumor. Por conseguinte, a MSI é frequentemente observada em vários tipos de câncer, principalmente no câncer de cólon [2] e câncer de próstata [3]. A presença de MSI pode ser usado como um marcador para a subtipos específicos de tumores e pode prever a sensibilidade à quimioterapia [1]. Além disso, gera MSI significativa heterogeneidade genética e pode ser utilizado para outros fins, tais como o isolamento de clones resistentes ao fármaco e a subsequente caracterização de mecanismos de resistência a drogas [4].

Actualmente, existem vários ensaios para a detecção de MSI , incluindo aqueles que procuram mutações em genes MMR, medindo a sua expressão, ou à procura de alterações de número de unidade em um conjunto de microssatélites frequentemente afectadas pela MSI [5], [6]. No entanto, estes ensaios não são sempre fiáveis. Por exemplo, estudos utilizando dois ensaios diferentes, desde resultados opostos sobre o estado MSI da linha celular de cancro da próstata PC3 [3], [7]. Além disso, os marcadores MSI comumente usados ​​são tipo específico de célula. Por exemplo, tem sido relatado que os marcadores vulgarmente utilizados no cancro do cólon têm baixa sensibilidade na leucemia mielóide aguda [8].

Muitos outros factores podem afectar negativamente a precisão das técnicas de detecção MSI disponíveis. Métodos que utilizam a perda de expressão ou a mutação de genes conhecidos MMR pode ser dificultada pela complexidade do sistema de MMR, que consiste de múltiplos genes e, possivelmente, outros que não caracterizadas. A baixa sensibilidade do número de abordagens baseadas unidade pode ser explicado pela natureza aleatória da MSI: MMRD pode afetar diferentes conjuntos de microssatélites em diferentes indivíduos. Isso pode explicar porque os conjuntos limitados de marcadores utilizados em ensaios de corrente de detecção MSI às vezes dar falsos negativos.

Para superar tais limitações, foi desenvolvido um novo método que melhora a sensibilidade de detecção MSI, incorporando todos os microssatélites detectáveis ​​em todo o genoma caracterizada por sequenciamento de última geração. Optamos por basear a nossa análise sobre RNA-Seq, pois é uma técnica de sequenciamento de última geração relativamente maduro e já foi amplamente realizada para várias aplicações. Apesar de sequências curtas de leitura constituem desafios para o mapeamento e microssatélites caracterizam, temos que superar esses problemas e demonstrou a confiabilidade da nossa abordagem de varredura do genoma para a detecção MSI. Além de basear a detecção em um muito maior número de indels microssatélites em células MSI, a nossa abordagem explora um fenômeno até agora apenas relatado em levedura, mas que observamos em células humanas neste estudo: distribuições de comprimento INDEL em amostras MSI e MSS são significativamente diferentes [9]. detecção do genoma de indels microssatélites evita deficiências do conjunto marcador limitada e proporciona uma maior sensibilidade para a detecção MSI. Além de ser sensível, a nossa abordagem não requer um controle de linha germinativa combinado do mesmo indivíduo, e pode, portanto, ser aplicado a linhas celulares de cancro.

Materiais e Métodos

Os conjuntos de dados

neste estudo, utilizou-se conjuntos de dados de RNA-seq para as 20 linhas de células de cancro diferentes, a fim de investigar frequências MSI em diferentes tipos de cancro. Todos os conjuntos de dados de linha de células de cancro foram obtidas a partir de estudos publicados, e o estado de MSI de muitas destas linhas de células já foi relatado (embora para algumas linhas celulares de resultados de estudos diferentes conflito). A Tabela 1 mostra as informações de status MSI e fontes de conjuntos de dados de RNA-seq. Nós também utilizamos dois estudos de RNA-seq publicados de amostras linfoblastóides HapMap coletados de 69 Nigerian [10] e 54 indivíduos europeus [11] como controles para definir o status MSI em células humanas normais, como MSI não são esperadas nas amostras. Analisamos também emparelhado tumor de câncer de cólon e amostras normais de RNA-Seq a partir de 14 pacientes diagnosticados com tumores MSI e 14 pacientes diagnosticados com tumores MSS [12].

Detecção microssatélites Indels

primeiro extraído microssatélites em todas as transcrições RefSeq humanos usando Tandem Repeats Finder (TRF) [13]. Neste estudo microssatélites foram definidos como repetições em série com unidades de repetição de 1 a 6 pares de bases. Para cada conjunto de dados RNA-seq, que, em seguida, alinhados a curto lê às transcrições RefSeq usando BWA [14], que permite gapped-alinhamento. Utilizou-se um tamanho máximo de intervalo de 20 pb para todas as análises aqui relatadas. Também testámos tamanhos maiores lacuna, mas não aumentou o número de indels detectados nas análises que se seguem. Para o resto de parâmetros que usamos parâmetros padrão BWA. Em seguida, usamos DINDEL [15] para chamar indels partir alinhados lê. Desde a saída do dindel, nós filtrar indels comuns enumerados no banco de dados de Single Nucleotide Polymorphism (dbSNP; Build 132) [16]. Finalmente, foram comparadas as coordenadas de indels para as coordenadas de microssatélites encontrados por TRF e indels identificados dentro microssatélites (Figura 1A).

PI refere-se à proporção de inserções dos microssatélites sobre todas as inserções, e refere-se ao DP proporção de eliminações em microssatélites sobre todas as exclusões.

Quantificar MSI utilizando o índice MSI-seq

Foram avaliadas diversas medidas MSI com base no número de indels e microssatélites determinado pelo nosso pipeline análise . Estas medidas incluem a proporção de inserções microssatélites sobre todas as inserções (denotado como PI), e a proporção de deleções microssatélites sobre todas as deleções (indicado como PD; Figura 1b). Também avaliamos PI /PD, uma vez que os nossos resultados, de acordo com um estudo anterior em leveduras [9], sugeriu que MMRD pode alterar as taxas relativas de inserções e deleções. PI /PD é também referido como índice de MSI-seq neste estudo.

Genes Expression Profiling de MMR relacionadas

Para comparar a nossa abordagem com métodos que utilizam o nível de expressão e estado de mutação dos componentes do sistema de MMR , determinou-se o nível de genes MMR (incluindo MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH4, MSH5, MSH6, PMS1 e PMS2) em linhas celulares de cancro a partir dos dados de RNA-seq expressão. Usamos Abotoaduras [17] para calcular os níveis de expressão normalizados medidos em fragmentos por quilobases de transcrição por milhão lê (FPKM). Buscamos também indels em genes MMR utilizando os resultados DINDEL (não restrito a microssatélites). Finalmente, nós olhamos para as variantes de um único nucleotídeo nas mesmas genes MMR usando SNVseeqer [4], [18], [19]. Como fizemos para INDEL vocação, nós só manteve SNVS não mencionados dbSNP para análise posterior.

Resultados

Detecção Indel em dados RNA-seq de MSI /MSS amostras

em primeiro lugar, procurou identificar indels dentro das amostras de RNA-seq utilizados neste estudo (MSI, MSS, HapMap). Após o alinhamento curto lido usando BWA, usamos DINDEL para chamar indels em nossas linhas de células de câncer de 20 e 123 conjuntos de dados HapMap RNA-Seq. A partir das saídas DINDEL, nós filtrado indels listados no banco de dados de Single Nucleotide Polymorphism (dbSNP, construir 132) [16]. Após filtragem, as contagens InDel absolutos variam de cerca de 200 a mais de 2000 (Figura 2).

(a) Amostras de HapMap (b) linhas de células de cancro.

diferentes distribuições de microssatélites Amostras Indel Alterações na MSI /MSS

em seguida, procurou determinar a frequência com que as sequências microssatélites são alterados por indels em cada amostra de RNA-seq. Um total de 505,657 microssatélites foram encontrados em 32,199 sequências de transcrição RefSeq usando TRF. Em seguida, determinou-se a quantidade de microssatélites alterados por, pelo menos, um indel em cada amostra de RNA-seq. Esta quantidade varia 54-482 em amostras HapMap, e 77-1454, em linhas celulares de cancro. Em todas as análises seguintes, só estudar indels dentro de microssatélites. Em cada amostra, em seguida, determinou a proporção de microssatélites alterados por indels localizadas em 5 ‘UTR, sequência codificante, 3’ UTR ou RNAs não-codificantes, e determinar se essas proporções são significativamente diferentes entre MSI e amostras de HapMap e entre MSS e HapMap amostras. Observou-se um aumento significativo na proporção de indels em sequências de codificação de amostras MSI ‘(p = 1E-5, de teste t de Student; Figura 3a) quando comparado com as amostras HapMap, enquanto a proporção permaneceu semelhante em amostras MSS (p = 0,15, teste t de Student). Correspondente a este aumento, a proporção de indels microssatélites em outras regiões foi inferior em amostras MSI comparação com HapMap (UTR 5 ‘: p = 0,0149; UTR 3’: p = 0,0108), enquanto que não há diferença entre as amostras MSS e HapMap (p 0,05; Figura 3b-c). Em RNAs não-codificantes, não observamos diferenças significativas entre HapMap, MSI e MSS (p 0,05; Figura 3D). A prevalência de indels microssatélites em regiões de MSI codificação (e até certo ponto em MSS) células cancerosas sugerem que estas indels pode levar a uma vantagem selectiva às células cancerosas, consistente com os resultados de outros organismos [20].

(a) sequências codificadoras (b) 3’UTR (c) 5’UTR (d) RNA não codificante.

em um estudo anterior em levedura, verificou-se que, depois de mutação do DNA de reparo incompatível proteínas, houve um aumento significativo no número de delecções curtas em microssatélites, enquanto que o número de inserções em microsatélites não se alterou significativamente [9]. Inspirado por esses resultados, nós também estudou a distribuição de comprimentos de microssatélites InDel detectados em amostras MSI /MSS. Notamos que as supressões curtos de 1 pb são mais frequentes linhas celulares MSI do que eles estão em HapMap amostras (Figura 4a). Para investigar adicionalmente esta observação, foram comparadas as distribuições de inserção e deleções obtidos a partir de cada uma das 7 linhas celulares de cancro da MSI e 5 linhas de células de MSS, para as distribuições globais da inserção ou deleção de todos os 123 controlos HapMap. teste de Kolmogorov-Smirnov mostrou que as distribuições de comprimento de microssatélites deleções em amostras MSI foram significativamente diferente das amostras HapMap (p 0,05). Em contraste, todos excepto um MSS amostras não mostram nenhuma diferença significativa nos comprimentos de deleção (p 0,05). As distribuições de comprimentos de inserção, por outro lado, não foram significativamente diferentes entre os 3 grupos (Figura 4B). Estas observações sugerem que a deficiência com a maquinaria de reparo incompatível que está associado com instabilidade de microssatélites preferencialmente dar origem a eliminações curtas.

(a) eliminações microssatélites (b) inserções microssatélites.

O índice MSI-seq corretamente prediz MMRD linhas celulares

O nosso objectivo inicial era identificar um índice de todo o genoma ou medida que o distingue de forma confiável amostras MSI a partir de amostras de MSS. Inicialmente investigou duas medidas possíveis: a proporção de inserções microssatélites sobre todas as inserções (denotado como PI), e a proporção de eliminações microssatélites sobre todas as supressões (indicado como PD; Figura 1b). A análise da secção anterior revelou que em comparação com células humanas normais, o número de eliminações curtas aumentou significativamente em linhas celulares MSI, mas não linhas celulares de cancro no estábulo de microssatélites (MSS). Devido a esta diferença, PD discriminação entre amostras MSI e MSS, embora não perfeitamente (dados não mostrados). Em contraste, embora a PI é incapaz de distinguir entre os dois tipos de células, ainda que reflete o número absoluto de indels microssatélites. Como resultado, normalizando PD com PI pode fazer status MSI de diferentes amostras mais comparáveis. Nós, portanto, investigou a relação entre duas proporções, como um índice alternativo para discriminar entre linhas celulares MSI e MSS. Quando calculada PI /PD para linhas celulares de cancro MSI e MSS, observamos diferenças significativas entre os dois grupos (p = 2.4e-5, t-teste), com MSI mostrando menor PI /PD (Figura 5a). Como esperado, os valores de PI /PD também foram significativamente diferentes entre MSI e HapMap (p = 1.5e-10, t-teste). O fato de que as amostras MSI e MSS têm estatisticamente diferentes valores de PI /PD não significa que PI /PD é altamente confiável em discriminar MSI e MSS. No entanto, observou-se ainda que a PI /PD separa claramente linhas celulares MSI e MSS em dois grupos distintos (Figura 5A). Com efeito, todas as linhas celulares que foram identificadas como MSI (Tabela 1) exibem PI /rácios DP menor do que 1. Em contraste, linhas celulares de MSS todos têm proporções maiores do que 1, semelhante às amostras HapMap (Figura 5a). Esses resultados demonstram que a relação PI /PD, o que nos referimos como índice MSI-seq, pode prever com precisão o status MSI em linhas celulares de cancro, mesmo abrangendo vários tipos de câncer.

(a) Comparação entre o PI /rácios DP de amostras de HapMap, linhas celulares de cancro MSI e linhas celulares de cancro MSS (b) os rácios PI /PD para todas as amostras HapMap e linhas celulares de cancro. rácios PI /PD HapMap amostras ‘são representados pela curva de densidade de distribuição empírica. As proporções para as linhas celulares conhecidas são traçados em linhas verticais vermelhas. Conhecidas linhas celulares MSS são plotados em azul, e todas as outras linhas de células são plotadas em roxo.

Os resultados acima mostram que o índice MSI-seq pode prever com segurança o status MSI. Nós, portanto, aplicado a nossa análise de linhas celulares cujo estado MSI não tinham sido caracterizados. No nosso estudo, todas essas linhas celulares caiu na gama de amostras HapMap (Figura 5B). Portanto, pelos nossos critérios, eles são susceptíveis de ser linhas celulares MSS. Previsões para algumas linhas celulares foram apoiados por provas adicionais. Por exemplo, todas as linhas celulares de cancro da mama três MSI-descaracterizados são categorizados como MSS. Este resultado é consistente com estudos anteriores que sugerem que a MSI só pode desempenhar um papel menor na oncogênese dos tumores de mama em comparação com outros tipos de tumor [21].

Expression ou mutação de genes MMR conhecidos não consegue prever com segurança MSI Estado

em seguida, procurou determinar se outras abordagens mais simples com base na expressão ou mutação de genes MMR conhecidos poderia prever o estado de MSI. descobertas anteriores de facto sugerido que a inactivação de genes de MMR pode causar MMRD [1]. Portanto, em princípio, o perfil dos genes relacionados com a MMR expressão também poderia prever MMRD e MSI. Olhamos para 7 linhas celulares MSI e 5 linhas celulares MSS com status MSI validadas por estudos anteriores

Os níveis de expressão de genes MMR conhecidos não se correlacionam com o estado MSI (Figura 6;. Os valores FPKM normalizados pelo valor médio de cada coluna). Por exemplo, a expressão é reprimida MLH1 em duas linhas celulares, e HCT116 DU145. Tal perda é acompanhada pela perda de expressão MLH3 em DU145 e perda de expressão MSH3 em HCT116, como relatado anteriormente [22]. Numa outra linha de células de LNCaP MSI, no entanto, todos estes genes são expressos em níveis normais, enquanto que a expressão do Msh2 reprimido pode ser responsável pela MSI [3], [23]. Análise de mutações pontuais e indels também mostrou falta de correlação com o estado MSI, com amostras MSS mostrando variantes missense nos genes MMR, enquanto muitas células MSI não têm variantes (Tabela 2). Portanto, ao contrário do índice MSI-seq, nem MMR níveis de expressão de genes nem mutações são verdadeiramente confiável para detecção MSI.

Os valores são normalizados pelo valor médio de cada coluna.

Aplicação de amostras clínicas

em seguida, testamos se a nossa abordagem pode prever o estado de MSI em tumores primários. Analisamos emparelhado tumor de câncer de cólon e amostras normais de RNA-Seq a partir de 14 pacientes diagnosticados com tumores MSI e 14 pacientes diagnosticados com tumores MSS [12]. As proporções para as amostras de tumor MSI variam 0,630-0,814, enquanto que as proporções para amostras de tumor MSS variar 0,986-1,573. Por conseguinte, um limiar de cerca de 0,9 será capaz de produzir previsões precisas de estado MSI, que é semelhante ao que temos observado em linhas celulares de cancro. Além disso, os rácios de amostras de tumores MSI mostrou uma diferença significativa em comparação com amostras normais emparelhados (p = 5.57e-11; t-teste), enquanto não há nenhuma diferença entre tumor MSS e amostras normais (p = 0,6438; t-teste) (Figura 7). Este resultado indica que o nosso método não funciona apenas em linhas celulares de cancro, mas também é eficaz para detectar o estado do MSI em tumores primários.

14 são diagnosticados como MSI e 14 são diagnosticados como MSS.

Discussão

neste estudo, nós introduzimos um romance e índice de confiança (MSI-seq) para a detecção de instabilidade de microssatélites usando dados de transcriptoma de sequenciamento. Ao contrário de outras abordagens que estão limitados a pesquisa de um pequeno número de genes ou regiões microssatélites, o nosso método integra dados InDel a partir de um grande número de microssatélites expressas. A nossa abordagem não depende de ADN da linha germinal e é, portanto, igualmente aplicável a linhas celulares de cancro e amostras primárias. Nós mostramos que a nossa abordagem é mais preciso do que as abordagens baseadas na detecção de mutação ou expressão mudanças pontuais em genes de reparo. Outra vantagem da nossa abordagem é que o índice MSI-seq fornece uma medida contínua da MSI. Em estudos anteriores, a MSI foi muitas vezes tratado como um evento tudo-ou-nada. Os ensaios tradicionais só podia dizer se uma amostra é MSI ou MSS. No entanto, em casos biologicamente relevantes, o estado de MSI amostras são susceptíveis de abranger um espectro contínuo, e a extensão da MSI pode ter implicações terapêuticas. Por conseguinte, o índice de MSI-SEQ (PI rácio /PD) usado neste estudo pode ser um candidato promissor para quantificar o grau MSI relativa de uma amostra.

No decurso das nossas investigações sobre indels em linhas celulares de cancro , temos feito uma série de observações interessantes. Descobrimos que as supressões curtas em regiões microssatélites, especialmente 1 eliminações pb, são consistentemente altamente sobre-representados em linhas celulares de cancro do MSI em comparação com linhas celulares de cancro MSS e imortalizado mas amostras HapMap não malignas. Por outro lado, nós não encontrou qualquer aumento consistente na eliminações mais longos ou inserções em amostras MSI. Uma observação semelhante foi feita em leveduras [9], no entanto, o melhor do nosso conhecimento, é a primeira vez que este fenómeno é relatado em células humanas. Esta observação confirma que vários mecanismos de reparação de ADN estão em jogo nas células normais, e que dentro de microssatélites, deleções e inserções acidentais de diferentes comprimentos são reparados através de mecanismos distintos.

Outra observação é que que há mais indels microssatélites na codificação regiões em células cancerosas e especialmente em células cancerosas MSI-positivos. Esta descoberta é surpreendente, pois uma fração substancial desses indels são esperados para causar quadro de leitura internas, non-sense mediada decadência e, portanto, a inactivação do gene. Os nossos resultados sobre o outro lado sugerem que as células cancerosas com o aumento indels microssatélites de codificação pode ser seleccionado de forma positiva e, por conseguinte, que codificam indels microssatélites poderia contribuir para os fenótipos de tumor. Alternativamente, estes indels pode gerar diversidade funcional que permite a adaptação rápida das células tumorais a mudança de ambientes, talvez semelhante ao que foi observado em levedura [20].

O método baseia-se na sequenciação transcriptoma, que tem alguma limitações quando usados ​​para a caracterização MSI. Por exemplo, ele irá perder microssatélites alterados localizados em sequências reguladoras, os quais também podem desempenhar papéis importantes na oncogénese. Além disso, como a detecção indel requer cobertura de leitura adequado, pode ser difícil de detectar indels microssatélites em transcritos de baixa abundância. Apesar desvantagens acima, a inspeção de transcritos expressos ainda fornece informações significativas sobre MMRD. Como experimentos RNA-seq são amplamente realizada e o preço para amostras de câncer de sequenciamento está a diminuir rapidamente, no futuro método de diagnóstico baseado RNA-seq vai se tornar rentável para aplicações clínicas. Além disso, um ensaio de RNA-Seq única é capaz de fornecer um diagnóstico preciso MSI junto com ricas informações sobre os muitos outros aspectos do tumor, incluindo mutações funcionais, perfis de expressão gênica, caminhos ativos e fusões de genes, etc, fazendo ensaios de PCR especializados para MSI desnecessária .

em conclusão, nosso método é o primeiro a permitir a caracterização do genoma do estado MMRD na célula humana através da integração de dados de sequenciamento de alto rendimento. Consistente com os resultados anteriores, temos observado um aumento significativo de deleções curtas em células MSI comparação com os MSS. Com base nesta observação, que mostrou que a proporção PI /PD (que também definem como MSI-SEQ) pode ser usada para quantificar o grau MSI em ambas as linhas celulares de cancro e amostras de tumor primário a partir de pacientes, e tem várias vantagens em relação aos ensaios tradicionais. Por isso, o nosso método tem o potencial de servir como uma nova ferramenta de diagnóstico de instabilidade genómica relativamente a amostras de cancro diferentes.