Abstract

Fundo

Adenocarcinoma pulmonar é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer entre homens e as mulheres do mundo. Apesar dos recentes avanços no diagnóstico e tratamento, as taxas de mortalidade com uma sobrevida global em 5 anos de apenas 15%. Esta elevada taxa de mortalidade é provavelmente atribuível à metástase cedo. Apesar de vários marcadores conhecidos correlacionadas com prognóstico reservado /metástase em pacientes de adenocarcinoma de pulmão por imuno-histoquímica foi relatado, os mecanismos moleculares de desenvolvimento de adenocarcinoma de pulmão ainda não são claros. Para explorar novos marcadores moleculares e suas vias de sinalização será crucial para ajudar no tratamento de pacientes com adenocarcinoma de pulmão.

Metodologia /Principais Achados

Para identificar genes de pulmão associada ao adenocarcinoma /metástase novos e esclarecer os mecanismos moleculares subjacentes destes alvos na progressão do cancro do pulmão, criamos um sistema de bioinformática que consiste em integrar três genes conjuntos de dados de perfil de expressão, incluindo adenocarcinoma pares pulmão, tumores metastáticos secundárias vs. tumores benignos, e uma série de linhas de células invasoras. Entre os novos alvos identificados, FLJ10540 foi sobre-expresso em tecidos de cancro do pulmão e está associado com a migração celular e invasão. Além disso, empregamos duas estratégias co-expressão para identificar em que via FLJ10540 estava envolvido. Lung perfis de matriz e adenocarcinoma tissue microarray dados de coloração IHC demonstraram que FLJ10540 e VEGF-A, bem como FLJ10540 e correlações positivas exibem fosfo-AKT, respectivamente. A estimulação de células de cancro do pulmão com VEGF-A resulta em um aumento na expressão da proteína FLJ10540 e melhora a formação de complexo com a PI3K. O tratamento com inibidores de PI3K e VEGFR2 afecta a migração celular e invasão por activação da via PI3K /AKT. Além disso, knockdown de FLJ10540 desestabiliza formação do P110-α /P85-α- (PI3K) complexa, apoiando ainda mais a participação de FLJ10540 na via VEGF-A /PI3K /AKT.

Conclusões /Significado

Este achado definir a fase de testes suplementares de FLJ10540 como um novo alvo terapêutico para o tratamento de cancro do pulmão e pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que são capazes de bloquear a via PI3K /AKT em células de cancro de pulmão.

Citation: Chen CH, Lai JM, Chou TY, Chen CY, Su LJ, Lee YC, et al. (2009) VEGFA regula positivamente FLJ10540 e Migração modula e Invasion of Lung Cancer via PI3K /Akt. PLoS ONE 4 (4): e5052. doi: 10.1371 /journal.pone.0005052

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Dezembro, 2008; Aceito: 12 de fevereiro de 2009; Publicação: 01 de abril de 2009

Direitos de autor: © 2009 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por doações do Gung Hospital Chang (CMRPD140211) e NSC (94-2752-B-010-002-PAE) para Chen-Kung Chou, NSC (Programa Interdisciplinar de Projeto de Pesquisa: NSC97-2627-B-010 -011 a Chi-Ying Huang, NSC97-2627-B-030-001 para J.-M. Lai), e-NSC97-3112-B 010-025-CC1, Taichung Veterano general Hospital (TCVGH-957326D) e o Programa para a Promoção da Excelência Acadêmica de Universidades (Universidade Nacional Yang Ming) para Chi-Ying Huang, e NSC (95-3112-B-075-002 e 96-3112-B-075-001) para Yu-Chung Wu. O Gene Expression Analysis Núcleo Facilidade é apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa de Medicina Genômica (NRPGM), Conselho Nacional de Ciência, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer entre homens e mulheres no mundo [1] – [2]. Apesar dos recentes avanços no diagnóstico e tratamento, as taxas de mortalidade permanecem elevadas, com uma sobrevida global em 5 anos de apenas 15%. A cirurgia continua a ser a primeira escolha de tratamento para o câncer de pulmão de células não-pequenas localizada e oferece a melhor oportunidade para a cura. No entanto, quando diagnosticada pela primeira vez, a maioria dos pacientes já têm doença avançada, e apenas 35% dos pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) são elegíveis para ressecção [3]. marcadores ou alvos moleculares novos auxiliando no diagnóstico e tratamento serão cruciais para melhorar a taxa de mortalidade.

invasão tumoral e metástase são áreas importantes para o estudo a fim de determinar o fenótipo agressivo dos cânceres humanos e são as principais causas de mortes por câncer [4]. O processo de metástase é muito complexo e é considerado um evento tardio na tumorigênese, isto é, as células proliferam, perder o contato com as células vizinhas, migram através da matriz intersticial, invadem o sangue e vasos linfáticos, e depositar os gânglios linfáticos. A migração e a invasão de células parece ser um resultado de uma interacção complexa entre as várias famílias de proteínas que participam neste processo. Os mecanismos de movimentação das células são importantes, não só como parte de processos celulares e de desenvolvimento de base, mas também na patogénese de várias doenças [5]. Para se tornar metastática, as células tumorais devem aumentar a expressão de vários genes de promoção da metástase. No entanto, no cancro do pulmão, as moléculas e os mecanismos envolvidos na migração de células ou invasão permanecem em grande parte desconhecida.

Produção e secreção de VEGF-A é vulgarmente observada em tumores mais agressivos, e a expressão do VEGF-A influencia profundamente o o prognóstico de pacientes com câncer, incluindo aqueles com câncer de pulmão [6] – [8]. O VEGF-A é uma das mais potentes estimuladores de angiogénese identificados até agora, que afecta células endoteliais da permeabilidade vascular, proliferação e motilidade [7]. Apesar de várias vias de sinalização intracelulares foram propostas para mediar as actividades biológicas do VEGF-A em células endoteliais, os eventos de sinalização envolvidos na migração celular e invasão em resposta a VEGF-A estimulação de cancro do pulmão não são completamente compreendidos.

FLJ10540 tem vários nomes, incluindo CEP55 [9], C10orf3 [10], e URCC6. CEP55 marcado com GFP-C localiza no centrossoma em células de interfase, a midzone do fuso durante a anafase e para a secção central durante a citocinese [9], [11] – [12]. Além disso, Cdk1, ERK2, e Plk1 cooperar na fosforilação de CEP55 durante a mitose, o que é necessário para a localização correcta de CEP55 mitótico e a sua função durante a citocinese [9]. FLJ10540 é sobre-expressa durante cólon humano [10] e o carcinoma hepatocelular [13] tumorigénese, sugerindo que pode funcionar como um oncogene no desenvolvimento do tumor. Além disso, nós anteriormente mostraram que a sobre-expressão de FLJ10540 contribui para a transformação celular através da activação da via PI3K /AKT [13]. No entanto, nenhuma análise em larga escala de expressão FLJ10540 e o seu significado clínico-patológico e funcional no cancro do pulmão humano foi realizada.

O comportamento agressivo de células cancerosas malignas é determinado por um complexo conjunto de vias de sinalização que regulam as funções principais , tais como o crescimento, sobrevivência, migração e invasão. A via de sinalização PI3K /AKT tem sido relacionada a todos os quatro dessas respostas. [14] – [17]. Outra evidência da importância da PI3K /AKT sinalização em câncer vem de estudos que tenham detectado a superexpressão e hiperativação do PI3K /AKT em uma ampla gama de tumores humanos, incluindo o cancro do pulmão, e isso é frequentemente associada com mau prognóstico [18]. Evidências acumuladas a partir de relatórios anteriores sugere um potencial papel da PI3K /AKT na migração e invasão de vários tipos de células, incluindo o cancro do pulmão [19], câncer de fígado [20], o cancro da mama [21], e cancro pancreático [22].

neste estudo, mostramos que FLJ10540 é sobre-expresso em adenocarcinoma de pulmão e que a expressão ectópica de FLJ10540 promove migração e invasão celular. Em amostras de adenocarcinoma de pulmão humano, FLJ10540 positivamente correlacionada com a expressão de VEGF-A, conforme determinado pelo perfil de expressão de genes e coloração IHC de micromatrizes de tecidos. Além disso, a estimulação com VEGF-A resultou num aumento na expressão da proteína FLJ10540 de um modo dependente da dose na CL

1-0 células de cancro do pulmão. Além disso, FLJ10540 parcialmente transloca desde o citoplasma para a membrana do plasma e aumenta a formação do complexo com a PI3K nos termos do VEGF-A estimulação. Finalmente, VEGF-A afecta a migração celular e invasão por activação do /PI3K /AKT via FLJ10540. Estes achados sugerem que FLJ10540 superexpressão está associada a um potencial metastático reforçada e pode servir como um potencial novo alvo terapêutico para adenocarcinoma de pulmão.

Resultados

expressão elevada FLJ10540 em adenocarcinomas do pulmão e cancro do pulmão de células invasiva linhas

Um desafio significativo na era pós-genômica é determinar como priorizar alvos diferencialmente expressos e mal caracterizados em estudos microarray de perfis relacionados com o cancro. Aqui, montamos uma plataforma de bioinformática, integrando três conjuntos de dados de microarranjos diferentes para revelar os reguladores-chave envolvidos na metástase de câncer de pulmão. A Figura 1 mostra as abordagens de integração de dados esquemáticos e dados de expressão de FLJ10540 em diferentes categorias. Primeiro, amostras de 26 pacientes com adenocarcinoma de pulmão, confirmado por exame histopatológico, foram submetidos a Affymetrix microarrays profiling. Com base nos 26 espécimes de adenocarcinoma de pulmão primário, 826 fora de 22.283 transcritos diferencialmente expressos entre as áreas não tumorais e tumorais adjacentes foram agrupados pelo teste de Wilcoxon (

p Art 0,01), com base em duas vertentes diferenças e testado usando o falsa correlação taxa de descoberta Benjamini e Hochberg (

p Art 0,01). Estes retratos moleculares, contendo 192 up-regulada e 634 transcrições regulada para baixo, podia distinguir com sucesso áreas não tumorais e tumorais adjacentes dos pacientes por agrupamento hierárquico (Figura S1A). Em segundo lugar, os dados de microarranjos acessíveis públicos (baixados da GEO) foram utilizados para adquirir diferentes conjuntos de dados de microarrays, que foram normalizados pela Quantile Normalização usando R configurar potencial de uma plataforma de identificação de biomarcadores metastático. Nós comparamos 225 tumores metastáticos secundários (incluindo 20 metástases tumorais para o nó de linfa e tumores metastáticos 200) e 30 tumores benignos para obter conjuntos de oncogenes potenciais metastáticos (871) e os genes supressores de metastáticas (1042). Finalmente, para priorizar as metas e validar os nossos genes relacionados a metástases em linhas celulares, uma série de linhas de células de adenocarcinoma de pulmão, incluindo CL

1-0, CL

1-1, CL

1-5 e CL

1-5-F4, com graus crescentes de invasão [23], também foi submetida a profiling microarray. Um total de 6.238 transcrições tinham níveis mais elevados de expressão na linha de células de alta capacidade de invasão CL

1-5-F4 que o CL parental

1-0 células. A intersecção desses três conjuntos de dados revela muitos novos alvos. Foram caracterizados os genes que são conservadas apenas em vertebrados, mas não em invertebrados, para revelar algumas anormalidades específicas do cancro humanos novos. Como resultado, nós nos concentramos no gene pouco caracterizados

FLJ10540

.

(A, painel esquerdo) Os padrões de expressão microarray de

FLJ10540

em pacientes de adenocarcinoma de pulmão foram normalizados contra os padrões de expressão em chips HG_U133A. N: tecidos não tumorais adjacentes; tecidos tumorais: T. O boxplot mostra a distribuição de dados como uma classificação de agrupamento e indica que há uma diferença estatisticamente significativa (

P

0,0001) entre os tecidos de tumor e os tecidos nont-umor adjacentes do mesmo doente com cancro de pulmão. (A, painel direito) Os níveis de ARNm de

FLJ10540

em amostras de doentes com cancro de pulmão foram 16 determinados por Q-RT-PCR. Os resultados foram normalizados contra os níveis de expressão de

GAPDH

mRNA em cada amostra pareada e plotados com boxplot. (B) Os padrões de expressão de microarranjo de

FLJ10540

foram comparados entre os 30 tumores benignos, 20 metástases tumorais para o linfonodo, e 200 tumores metastáticos, e foram mostrou com boxplot. (C, painel esquerdo) Os níveis de ARNm de

FLJ10540

foram determinados por Q-RT-PCR em linhas celulares de cancro do pulmão. Os resultados foram normalizados contra o nível de

GAPDH

mRNA em cada linha de células. As experiências foram realizadas em triplicado. (C, painel da direita) A proteína total foi extraída de CL

1-0 e CL

células 1-5-F4 e submetido a análise de imunotransf erência com anticorpos anti-FLJ10540. β-actina foi utilizado um controle de carga interno.

FLJ10540

exposições sobre-regulada padrões de expressão em adenocarcinomas do pulmão (Figura 1A, painel esquerdo) e assinaturas metastáticos (Figura 1B). Para validar a expressão do gene de perfil de dados para

FLJ10540

, Q-RT-PCR foi realizada em tumor de adenocarcinoma do pulmão de 16 amostras aos pares e não tumorais adjacentes. Figura S1B mostra que a sobre-expressão de

FLJ10540

era observável em nossas amostras de pacientes de pulmão, com 15 dos 16 tumores de pacientes de pulmão (94%), mostrando um sinal de maior após a normalização para

GAPDH Compra de igual modelo Carregando. O nível médio de expressão de

FLJ10540

em adenocarcinomas do pulmão foi de 8 vezes mais elevada do que em amostras de tecido de pulmão não tumorais adjacentes, tal como analisado por boxplot (Figura 1A, o painel direito). Nós próxima verificada a expressão de FLJ10540 em adenocarcinoma de pulmão representante e recém congelado e amostras não tumorais adjacentes por coloração imuno-histoquímica utilizando anticorpos FLJ10540 anti-humanos. Os nossos dados indicam que o nível de FLJ10540 foi aumentada nas amostras de tumor, em comparação com o que nos tecidos não tumorais adjacentes (dados não mostrados).

A expressão de FLJ10540 em uma série de adenocarcinoma do pulmão humano invasiva linhas celulares

Durante o desenvolvimento do tumor de pulmão, uma das transições mais críticos é a progressão de

in situ

a carcinoma invasivo. Para explorar o possível papel da FLJ10540 na capacidade de invasão de células de adenocarcinoma de pulmão, primeiro analisou a expressão de

FLJ10540

em um painel de linhas celulares, CL

1-0, CL

1-1 , CL

1-5, e CL

1-5-F4, com capacidades invasivas quer baixas ou altas, conforme descrito anteriormente [23] por Q-RT-PCR. Os dados indicaram que os níveis de

FLJ10540

mRNA eram elevados em CL

1-5 e CL

células 1-5-F4 que têm altas habilidades invasivos e metastáticos, mas foram menores no baixo invasiva CL

1-0 células (Figura 1C, painel esquerdo). Os níveis de proteína FLJ10540 também foram significativamente mais elevados no altamente invasivo CL

sub células do que na baixa CL invasiva

1-0 células, como mostrado por análise de Western blot (Figura 1C, painel direito). Os resultados indicaram que a sobre-regulação de ARNm de FLJ10540 e a expressão da proteína foi positivamente correlacionada com a capacidade invasiva das células do cancro do pulmão, levantando a possibilidade de que a sobre-regulação de

FLJ10540

pode levar a algumas das anormalidades encontrado no adenocarcinoma de pulmão humano .

a superexpressão de FLJ10540 promove migração e invasão celular

Desde FLJ10540 é sobre-expresso em adenocarcinoma de pulmão e uma linha de células de cancro do pulmão altamente invasivo, parecia possível que a sua expressão pode afetar a motilidade celular. Para clarificar o papel de FLJ10540 em motilidade em células de mamíferos, nós examinamos se a sobre-expressão de FLJ10540 foi capaz de afectar a migração celular e invasão. Dois tipos de células diferentes foram utilizadas para avaliar esta possibilidade. Em primeiro lugar, CL

1-0 células que expressam de forma estável a hemaglutinina (HA) tagged FLJ10540 foram estabelecidos. Vários transfectantes estáveis ​​com o aumento dos níveis da proteína FLJ10540 foram selecionados (Figura 2A, painel da esquerda) para estudos posteriores. Curiosamente, FLJ10540 superexpressão em CL

1-0 células foi associado com morfologia celular notavelmente alterado. FLJ10540 clones sobre-expressos foram reduzidos em tamanho celular e parecia ser mais em forma de fuso-e aumentou a separação intercelular comparação com clones de controlo do veículo, que foram round-shaped (Figura 2A, painel do meio). No entanto, a taxa de proliferação celular, tal como determinado pelo ensaio de MTT, não foi significativamente diferente daquela do controlo do veículo ou células expressando FLJ10540 durante 24 horas (Figura 2A, painel da direita). Para examinar o efeito de FLJ10540 sobre a migração de células de cancro de pulmão humano, linhas de células estáveis ​​que expressam HA-FLJ10540 ou controlo de veículo foram semeadas em câmaras Transwell. Os resultados mostraram que FLJ10540 CL

1-0-estável transfectantes poderia aumentar a sua migração, como medido pelo ensaio de migração Transwell; esta foi comparada com o controlo do veículo, onde muito poucas células migradas (Figura 2B, painel superior esquerdo). Em termos quantitativos, a capacidade de migração de FLJ10540 CL

1-0-transfectantes estáveis ​​foi de aproximadamente 6-7 vezes mais elevada do que a do controlo com veículo (Figura 2B, painel superior direito). A seguir, realizou uma

in vitro

ensaio de invasão usando um filtro de barreira Matrigel revestido. Após uma incubação de 24 horas numa câmara de Matrigel Transwell revestida, FLJ10540 CL

1-0-transfectantes estáveis ​​invadiram o material de membrana basal e passou através dos poros para alcançar a parte inferior do filtro (Figura 2B, painel inferior esquerdo) . Da mesma forma, FLJ10540 CL

1-0 células que expressam mostrou uma dobra maior capacidade de 10-12 invasão do que as células de controlo do veículo (Figura 2B, painel inferior direito).

(A, painel esquerdo) marcada com HA -FLJ10540 clones estáveis ​​de CL

1-0 células foram estabelecidos. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de immunoblot com anticorpo anti-HA. (A, painel do meio) imagens de contraste de fase de culturas em monocamada de células CL

1-0 expressam FLJ10540 e controle do veículo foram mostrados. (A, painel direito) para medir as taxas de crescimento de células, 5 × 10

3 células de veículo de CL

1-0 e CL

1-0-FLJ10540 clones estáveis ​​foram semeadas no dia 0 em 96- bem placas com 10% de FBS. As células foram contadas em pontos de tempo indicado pelo ensaio de MTT (OD

570) para quantificar o crescimento das células. Os dados foram normalizados contra o valor OD

570 valor no dia 0. A taxa de crescimento de CL

1-0 células é mostrada como a média ± D.P.. de três experiências independentes. (B, painel superior) Para o ensaio de migração, 5 × 10

3 células de veículo-CL

1-0 e CL

1-0-FLJ10540 clones estáveis ​​foram semeadas em cima de um inserto Transwell . Após 24 horas, as células no lado superior foram raspadas, e as células que migraram para o fundo foram fixadas e coradas com Giemsa. A migração relativa vezes de veículo-CL

1-0 e CL clones estáveis ​​

1-0-FLJ10540 foi normalizada com o controle do veículo e apresentado esquematicamente. (B, painel inferior) Para o ensaio de invasão, 1 × 10

4 células foram semeadas depois Matrigel foi adicionado. A invasão relativa vezes de clone estável foi normalizado contra células de veículos e representado esquematicamente. Todos os dados representam a média ± D.P.. de três experiências independentes.

Em segundo lugar, para evitar efeitos clonais, um FLJ10540 retroviral à base de Flag-marcado foi infectado em uma linha de células RK3E (Figura S2A), que anteriormente tinha sido usado com sucesso para avaliar a migração ou invasão induzida por diferentes genes e vias de sinalização, como o factor de crescimento de fibroblastos 9 (FGF9) [24], k-ras [25], e caracol [26]. RK3E células exibem várias funções do epitélio, tal como um cariótipo quase normal e um baixo fundo da migração celular e invasão. piscinas mista de células RK3E infectados foram usados ​​para os ensaios de migração e invasão. Mais uma vez, as células que expressam FLJ10540 mostrou uma dobra maior capacidade 4-5 migração do que as células de controlo do veículo (Figura S2B) e uma dobra maior capacidade de 7 invasão do que as células de controlo do veículo (Figura S2C). Tomados em conjunto, estes resultados suportam a hipótese de que FLJ10540 pode promover a migração e invasão celular em células de mamíferos.

Knock-down de FLJ10540 endógeno, através de siRNA suprime a migração de células do cancro do pulmão e da invasão

Para confirmar que FLJ10540 afeta migração e invasão celular em células de câncer de pulmão humanos, usamos uma abordagem siRNA para inibir a expressão endógena de FLJ10540 e então testado as habilidades de migração e invasão de CL

1-5 e H1299 células. Em primeiro lugar, para examinar a especificidade de ARNsi, uma construção de expressão FLJ10540 marcada com HA foi co-transfectadas com ARNsi três diferentes; Estes consistiram de dois siRNAs quimicamente sintetizados específicos para FLJ10540 (siFLJ10540-1 e siFLJ10540-2) e um controlo negativo siARN, que foram cada um transf ectados para células HEK293T. Ambos os siRNAs FLJ10540 demonstrou inibição quase completa da expressão FLJ10540 marcada com HA, como mostrado por análise de Western blot utilizando um anticorpo anti-HA, enquanto o nível de FLJ10540 marcada com HA permaneceu elevada com o ARNsi de controlo negativo (dados não mostrados). Em segundo lugar, para examinar se os siRNAs específicos FLJ10540 poderia inibir a expressão endógena FLJ10540 em CL

5/1 e H1299 células, transfectadas que ARNic em CL

5/1 e H1299 células durante 24 horas, seguido por análise de Western blot utilizando um anticorpo contra FLJ10540. Os dados mostram uma redução dramática dos níveis de proteína com tanto FLJ10540 FLJ10540 siRNAs, e não houve uma redução significativa de FLJ10540 quando o siARN negativo foi usado (Figura 3A e B, painel esquerdo). No entanto, a taxa de proliferação celular, tal como determinado pelo ensaio de MTT, não foi significativamente diferente entre as células de controlo negativo e as células que expressam os siRNAs FLJ10540 durante 24 horas (Figura 3A e B, painel do meio). Em terceiro lugar, para estudar o efeito de siRNA FLJ10540 transfecção sobre a migração, controle negativo e siRNA FLJ10540-transf CL

1-5 ou H1299 células foram semeadas separadamente em câmaras Transwell com filtros não revestidos. Após 24 horas de incubação, o potencial da motilidade das células de siRNA FLJ10540 foi encontrada para ter sido fortemente inibida pelos ARNsi (Figura 3A e B, painel da direita). Finalmente, os mesmos painéis de células transfectadas ou negativos FLJ10540 siRNA foram semeadas numa câmara de Matrigel Transwell revestida. Após 24 horas de incubação, o potencial invasivo das células siARN FLJ10540 parecia ser significativamente reduzida (Figura 3A e B, painel da direita). Estes resultados suportam a idéia de que FLJ10540 desempenha um papel na migração e invasão celular em células de câncer de pulmão humano.

(A e B, painel esquerdo) Um siRNA controle negativo com dois diferentes FLJ10540 siRNAs (siFLJ10540-1 e siFLJ10540-2) foram transfectados em células CL

5/1 e H1299 durante 24 horas. Após a transfecção, transferência de Western foi efectuada utilizando anti-FLJ10540 e anticorpos anti-p-actina. (A e B, painel do meio) para medir as taxas de crescimento de células, 5 × 10

3 células de controlo negativo-CL

1-5, CL

1-5-FLJ10540 siRNAs, negativo control-H1299, e H1299-FLJ10540 siRNAs foram plaqueadas no dia 0 em placas de 96 poços com 10% de FBS. As células foram contadas em pontos de tempo indicado pelo ensaio de MTT (OD

570) para quantificar o crescimento das células. Os dados foram normalizados contra o valor OD

570 valor no dia 0 de cada tratamento. A taxa de crescimento de CL

células H1299 1-5 e são apresentados como a média ± D.P.. de três experiências independentes. (A e B, painel da direita) A relação vezes a migração e a invasão relativa vezes de CL

5/1 e H1299 foram normalizados contra as células de controlo negativo e representado esquematicamente. Os resultados representam a média ± D.P.. de três experiências independentes.

Usando o conceito de sin-expressão de descobrir VEGF-A, mas não o VEGF-B, tal como o regulador a montante de FLJ10540

Os genes pertencem à mesma via frequentemente apresentam os mesmos perfis de expressão, que é referido como sin-expressão [27]. Assim, para mapear a via de sinalização potencial ou regulador a montante (s) participando de FLJ10540-induzidos características migração e invasão, empregamos nosso conjunto de dados microarray câncer de pulmão, como descrito anteriormente, para obter insights sobre a concordância funcional de genes co-expressa. Para testar essa hipótese, primeiro analisou se o perfil do

FLJ10540

expressão de mRNA correlaciona-se com qualquer ligando ou receptor em nosso banco de dados microarray do cancro do pulmão (Figura 1). Destes genes co-expresso, o candidato principal é

VEGF-A

, que foi altamente correlacionada positivamente com o nível de expressão de ARNm de

FLJ10540

em pacientes com cancro do pulmão emparelhados (R = 0,7 P 0,001) (Figura 4A). VEGF-A é conhecido por ser um factor crítico pró-angiogénica, com capacidade para regular muitos passos no processo angiogénico, incluindo proliferação, migração, invasão e sobrevivência [28], [29]. Na verdade, o VEGF-A é altamente expressa em muitos tumores malignos, incluindo o cancro do pulmão [30], [31], [32], e a expressão do VEGF-A está associado com prognóstico pobre [33], [34] e o presença de metástase ganglionar [35], levantando a possibilidade de que os papéis biológicos de FLJ10540 e VEGF-a pode ser funcionalmente ligadas em adenocarcinoma de pulmão.

(a) os padrões de

VEGF-a expressão microarray Comprar e

FLJ10540

em pacientes de adenocarcinoma de pulmão foram mostrados. Os resultados foram normalizados contra os padrões de fichas (56) HG_U133A expressão. N: tecidos não tumorais adjacentes; tecidos tumorais: T. (B, painel esquerdo) do VEGF-A induzida por um aumento nos níveis de proteína FLJ10540 de uma forma dependente da dose. Após o tratamento com várias concentrações de VEGF-A (painel da esquerda) ou VEGF-B (painel da direita) durante 10 min em CL

1-0 células, as proteínas totais foram extraídos a partir de CL

1-0 células e sondadas com anticorpo contra FLJ10540. (B, painel do meio) privadas de soro CL

1-0 células foram pré-tratadas com ou sem várias concentrações de SU5416 para 2 horas; As células foram então estimuladas com 20 ng /ml de VEGF-A durante 10 min. β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna. (C) privadas de soro CL

1-0 células foram pré-tratadas com ou sem SU5416 durante 2 horas; As células foram então estimuladas com VEGF-A (na concentração de 20 ng /ml) durante 3 horas. A relativa dobras migração e invasão foram normalizados contra células de veículos. (D, à esquerda, painel superior) Para o ensaio de migração, 5 × 10

3 células de veículo-CL

1-0 e CL

1-0-FLJ10540 clones estáveis ​​foram semeados na parte superior de um Transwell inserir e deixou-se aderir durante 12 horas, e foram então incubadas com ou sem VEGF-a (20 ng /ml) durante 3 horas. No final do ensaio, as células no lado superior foram raspadas, e as células que migraram para o fundo foram fixadas e coradas com Giemsa. (D, à esquerda, painel inferior) Para o ensaio de invasão, 1 × 10

4 células foram semeadas depois Matrigel foi adicionado, e foram então incubadas com ou sem VEGF-A (20 ng /ml) durante 3 horas. Todos os dados representam a média ± D.P.. de três experiências independentes. (E) Análise de imunofluorescência indirecta de FLJ10540 em células VEGF-A-tratada. A expressão da proteína e a localização subcelular de FLJ10540 foram analisadas na presença ou ausência do VEGF-A (20 ng /ml) em CL

1-0 células por microscopia de imunofluorescência. Após ser incubada com ou sem VEGF-A durante 30 min ou 180 min, as células foram fixadas com formaldeído a 3,7% e processados ​​para a microscopia de imunofluorescência indirecta. FLJ10540 translocado para a membrana celular após tratamento VEGF-A (ponta de seta). Bar:. 10 um

Dado o importante papel do VEGF-A na regulação da migração e invasão, fomos os primeiros interessados ​​em saber se VEGF-A pode modular a expressão da proteína FLJ10540. Os resultados mostraram que o nível de expressão da proteína de FLJ10540 foi regulada positivamente em A-A VEGF modo dependente da dose em CL

1-0 células de cancro de pulmão (Figura 4B, painel esquerdo). A seguir, perguntado se o efeito antagonista de SU5416, uma tirosina de VEGFR-2 inibidor de cinase, sobre as actividades biológicas do VEGF-A pode ser atribuída à inibição da sobreexpressão de proteína FLJ10540 induzida pelo VEGF-A em células do cancro do pulmão. Os resultados demonstraram que a sobre-regulação de FLJ10540 na presença de VEGF-A foi inibida por adição simultânea de SU5416 de um modo dependente da dose (Figura 4B, painel do meio). Pelo contrário, o nível de proteína de FLJ10540 não foi afectada pelo tratamento com VEGF-B (Figura 4B, painel da direita). Na verdade,

FLJ10540

não compartilha padrões de expressão semelhantes com

VEGF-B

, pelo menos não no nosso microarray do cancro do pulmão, apoiando a ideia de que os padrões synexpression poderia ser usado para inferir a função de genes desconhecidos [27].

superexpressão FLJ10540 e translocação induzida por VEGF-a aumenta a migração de células de cancro do pulmão e invasão através de uma via independente de EMT-

Para testar a significância biológica do VEGF-A- supra-regulação induzida de FLJ10540, foi examinada a influência de FLJ10540 em migração e invasão na presença ou na ausência de VEGF-a. Em primeiro lugar, examinamos se

1-0 células CL parentais poderia exibir motilidade celular, após estimulação por VEGF-A. Na figura 4C, CL

1-0 células exibiram mais migração e capacidades invasivas na presença de VEGF-A sozinho de VEGF-A combinados com SU5416 ou veículo sozinho, sugerindo que o aumento da adição de VEGF-A e significativamente a migração invasão de CL

1-0 células, a qual foi acompanhada por um aumento nos níveis de FLJ10540. Resultados semelhantes foram encontrados em FLJ10540 CL

transfectantes 1-0 estáveis, com ou sem VEGF-A estimulação (Figura 4D).

Para testar se a localização subcelular de FLJ10540 poderiam ser alterados em células de câncer de pulmão upon VEGF-a estimulação, adotamos a abordagem de imunofluorescência indireta de observar FLJ10540 localização em CL células

1-0 câncer de pulmão com ou sem VEGF-a estimulação. Tal como mostrado na Figura 4E, VEGF-A, não só o tratamento resultou num aumento na expressão da proteína FLJ10540, mas também promoveu a translocação de uma fracção de FLJ10540 para a membrana celular. Além disso, as diferenças na morfologia celular foram mais aparentes, com destaque para a extensão do VEGF-A células tratadas (Figura 4E, 30 e 180 min), em comparação com o CL arredondada

1-0 células (Figura 4E, 0 min ). Estas alterações morfológicas nos levou a examinar o fenômeno da transição epitelial-mesenquimal (EMT). Durante a tumorigénese, EMT podem aumentar a motilidade e invasividade de células cancerosas, e transformação maligna pode ser associada com vias de sinalização promover EMT [36]. Um estudo anterior também indicaram que sinais extracelulares induzidas pelo VEGF-A estão fortemente implicados na EMT em células de carcinoma pancreático humano [37]. Para examinar se FLJ10540 pode mediar EMT induzida por VEGF-A, aumentando, assim, a migração celular e invasão, utilizou-se células

1-0 cancro do pulmão H1299 e CL, com ou sem VEGF-A estimulação, para abordar esta questão. No entanto, apesar do aumento da motilidade celular pela superexpressão FLJ10540 ou diminuindo a motilidade celular por siRNAs FLJ10540 mediadas, as diferenças de FLJ10540 níveis não altera de forma alguma os níveis de qualquer uma das proteínas marcadoras associadas a EMT, como a E-caderina e vimentina expressão ( dados não mostrados). Portanto, FLJ10540 parece mediar efeitos de migração e invasão de VEGF-A, independentemente da EMT e não parecem desempenhar um papel na regulação da EMT, pelo menos em linhas celulares de cancro do pulmão analisadas.

Um positiva β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna. de três experiências independentes.