Abstract

andrógeno receptor (AR) mediada é necessário para o desenvolvimento normal da próstata e também impulsiona o crescimento do câncer de próstata (PCA) e sobrevivência celular, com muitos estudos que mostram uma correlação entre níveis de receptores aumentou e resistência à terapia com progressão para fatal castração recorrente PCA (CRPC). Embora tenha sido realizada há algum tempo que o fator de transcrição Sp1 é o principal estimulador da transcrição de genes AR, o conhecimento abrangente da regulação do gene AR permanece incompleta. Aqui nós descrever e caracterizar em detalhe dois novos elementos reguladores activos no 5’UTR do gene AR humano. Ambos estes elementos sobrepostos contêm sítios de ligação para o factor de transcrição Sp1 positivo e o PUR-α proteína repressora. sinalização celular aberrante é característica de APC e a actividade de transcrição do promotor de AR nas células PCA é dependente das quantidades relativas dos dois factores de transcrição. Juntamente com a nossa confirmação do papel dominante do SP1, os resultados suportam a lógica da segmentação este fator de transcrição para inibir a progressão do tumor. Esta deve ser de particular relevância terapêutica em CRPC onde os níveis do repressor PUR-α são reduzidos

Citation:. Hay CW, Hunter I, MacKenzie A, McEwan IJ (2015) An Sp1 Modulada Regulatory região única para primatas superiores Regula andrógeno humano Receptor Promotor Atividade em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 10 (10): e0139990. doi: 10.1371 /journal.pone.0139990

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 16 de junho de 2015; Aceito: 20 de setembro de 2015; Publicação: 08 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Hay et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por do cientista o Chefe do Office (CSO) do Governo escocês (https://www.cso.scot.nhs.uk/) : CWH (CZB-4-477) e IH (ETM /382)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Prostate câncer (PCA) é o segundo tipo de câncer mais prevalente em homens e constitui a segunda principal causa de mortes por câncer do sexo masculino em países ocidentais e o sexto a nível mundial, respectivamente [1]. Além disso, a incidência de CaP está aumentando em praticamente todos os países com a taxa de novos casos deverá duplicar até 2030-1700000 resultando em 500.000 mortes adicionais [2].

O crescimento e diferenciação de células epiteliais normais da próstata células, bem como o desenvolvimento e progressão da APC, são accionados por uma sinalização de androgénio que é mediada pelo receptor de androgénio (AR) [3]. Portanto, a inibição da função AR por terapia de privação de andrógeno (ADT), utilizando antagonistas ou abatimento de testicular ou síntese de andrógenos intratumoral constitui o procedimento principal de combate avançado e metastático CaP [4-6]. Inicialmente, a maioria dos pacientes experimentam a melhoria e remissão significativa, mas o câncer, invariavelmente, evolui para se tornar independente de andrógenos circulantes e é referido como castração resistente PCA (CRPC) [7]. Nesta fase final, metastática é geralmente fatal e representa o maior desafio para o desenvolvimento de novas terapias, eficazes [8]; que necessitam de múltiplos regimes alvejado-AR (revisto em [9]). Crucialmente, tumores CRPC permanecem dependentes de sinalização AR; exemplificado em ambas as células sensíveis (AS) e CRPC de androgénio em que a diminuição da expressão de AR induz uma perda concomitante da viabilidade das células [10].

As funções dos receptores de andrógenos como um factor de transcrição activado por androgénio que se liga a elementos de resposta de androgénio ( Ares) [4] em promotores e potenciadores distais (86% a 95% de Ares [11]). A capacidade de transactivação do receptor é modulada por interacções com uma lista cada vez maior de coregulators e factores de transcrição (revisto em [12]) que actuam sobre o próprio receptor ou alterar o ambiente de cromatina. Por exemplo, a transcrição pioneira fatores FOXA1 e GATA2 promover uma estrutura da cromatina aberta que facilita AR ligação e Estudos do Genoma de largura mostrar co-localização de sites para estes três factores [13,14] vinculativo. GATA2 desempenha um papel particularmente importante porque, bem como aumentar AR ligação a potenciadores, participa de looping cromatina e regula positivamente directamente a expressão do gene AR [13,14]. Níveis elevados de GATA2 em CaP correlacionar com pontuação Gleeson altos, e atividade reduzida através da expressão umedecido [13,14] ou inibição de ocupação GATA2 em ares, com a curcumina isoflavona [15] resultar na proliferação de células CaP inferior.

a maioria dos tumores CRPC sobre-expressam o receptor [16-19] com a seleção clonal exacerbando o problema [20]. Os níveis elevados de autorização de AR que se ligam a cromatina em 100 vezes menor concentração de ligando do que o normal [21] e o programa transcricional impulsionado-AR aberrante em tumores CRPC permite que as células cresçam em baixas concentrações de androgénio [22] ou a aparente ausência de hormona [23-25], que revoga assim ADT [26] e o tratamento com abiraterona [20].

Nos seres humanos, o gene AR estende por cerca de 180 kpb do cromossoma X (Xq11.2-Q12) e dá origem a um transcrito de 4,3 kb que inclui uma região 5 ‘não traduzida anormalmente longo (5’UTR) de 1,1 kb. O promotor não tem caixas TATÁ e CCAAT e, em comum com muitos genes TATA-menos, a transcrição é conduzida principalmente por ligação do factor de transcrição de dedos de zinco expressa ubiquamente, Especificidade Proteína 1 (SP1) a elementos reguladores da caixa GC. O promotor nuclear situa-se entre -74 e 87 pb [27] e caixas GC activos foram confirmados em -46 a -41 pb bem como no 5’UTR em 429 e 442 bp [27-29]. expressão impulsionado-SP1 do gene AR é facilitada por um alongamento de aproximadamente 90 pb de homopurina /homopirimidina imediatamente a montante do promotor (-150 a -60 pb) que fornece uma fonte abundante do factor de transcrição que se ligam ao promotor de núcleo [30 ]. Uma vez ligado ao promotor, o SP1 associados diretamente com a proteína de ligação tata e TBP-associado factor 4 (TAF4) [31] para estabelecer o complexo de iniciação. Além disso, Sp1 podem formar multímeros e múltiplos tetrâmeros empilhados proporcionando inúmeros locais de ancoragem para uma variedade de outras proteínas que regulam a transcrição, tanto directamente como através de acetilação de histonas e a remodelação da cromatina (revisto em [32]). Para além das caixas GC upregulatory, a região UTR 5 ‘codifica vários elementos reguladores, incluindo um composto de inibição do NF-kB, o site B-myb de ligação [33], um negativo SÃO [34] e um supressor do receptor andrógeno (ARS) [35 ] que se liga pur-α e RNPhn-K em cadeias opostas do ADN [36].

o AR representa claramente calcanhar de câncer de próstata de Aquiles ainda o tratamento primário atual envolvendo os antagonistas do andrógeno tem limitações e também leva a expressão de uma alternativa transcriptoma impulsionado-AR com resultados variáveis ​​CaP [37]. Uma abordagem muito mais eficaz seria a de reduzir a atividade AR através da expressão reduzida ou interferência com co-fatores de transcrição essenciais por exemplo, um inibidor de molécula pequena de GATA2 tem provado ser eficaz [13]. Ambas as abordagens dependem conhecimento detalhado das interações dos fatores de transcrição múltiplas e elementos regulatórios envolvidos na expressão do AR. Portanto, como o factor de transcrição Sp1 é geralmente considerado para ser um estimulador importante da expressão do gene de AR, estudámos função Sp1 no promotor imediato e 5’UTR do gene da AR humana. Neste relatório nós descrevemos dois novos elementos reguladores activos no 5’UTR AR humana que ambos contêm sobreposição de sítios de ligação para fatores de transcrição positivos e negativos. O resultado da transcrição em células de PCA é dependente das quantidades relativas de Sp1 estimuladores e inibidores PUR-α. Os resultados também comprovar o papel dominante do SP1 na condução de expressão AR e, assim, reforçar a lógica da segmentação este fator de transcrição, que esta ação irá promover a ligação de competir pur-α e inibir a progressão do tumor. Por último, os elementos reguladores exibem muito pobre conservação evolutiva que ilustra a natureza distinta de regulação do gene AR humano.

Materiais e Métodos

cultura celular

linhas de células de carcinoma da próstata humano LNCaP e DU145 foram obtidos a partir European Collection of Cell Cultures ea American Type Culture Collection, respectivamente. DU145 foram cultivadas em DMEM, enquanto LNCaP foram mantidas em meio RPMI contendo 1 mM de piruvato de Na e 10 mM de HEPES. Todos os meios foram suplementados com soro fetal bovino a 10% (PAA) e mantida a 37 ° C sem antibióticos numa atmosfera humidificada contendo 95% de ar e 5% de CO

2.

Western blotting

Os extractos celulares foram preparados a partir de células LNCaP e DU145, e manchas de western realizada como descrito anteriormente [38]. Sp1 humano, PUR-α, hnRNP-K, e GAPDH foram detectados usando anticorpos ab13370, ab79936, ab52600 e ab36840 (todos da Abcam) em diluições de 1: 6000, 1: 60000, 1: 17000 e 1: 12500, respectivamente. Anti-AR a partir de Santa Cruz Biotechnology (sc-7305) foi utilizado a 1: 100 de diluição. complexos antigénio-anticorpo foram detectados utilizando rábano anti-anticorpo de coelho conjugado com peroxidase de IgG secundário (Sigma) como previamente descrito. Integração análise de Western blots foi realizada utilizando o software Image J..

RT-PCR

células LNCaP foram tratadas com DMSO ou 50 nM mitramicina A (Sigma) durante 24 horas. Extracção de ARN e RT-PCR para a AR e de GAPDH mRNA foram realizadas como descrito anteriormente [34].

Plasmídeos e mutagénese dirigida ao local

Mutações de potenciais elementos reguladores foram introduzidas no plasmídeo phAR1. 6Luc, em que a expressão da luciferase é conduzida por 1,6 kpb do promotor e 5 ‘UTR do gene do receptor de androgénio humano (entre -741 e 842 pb) [34], usando duas metodologias. substituições de bases foram criadas utilizando o kit QuikChange II Mutagenesis (Agilent Technologies), utilizando os oligonucleótidos listados na Tabela A em Ficheiro S1, juntamente com os seus complementos reversos. mutações de deleção foram feitas usando o Na-Fusion Advantage sistema de clonagem de PCR de Clontech utilizando os oligonucleótidos listados na Tabela B em Ficheiro S1. Ambos os protocolos foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante e a integridade de todas as construções foi confirmada por sequenciação de ADN.

A transfecção e os ensaios de gene repórter da luciferase

Vinte placas de quatro poços foram semeadas com células LNCaP ou DU145 as células a uma densidade de 5 x 10

4 células /cm

2 e 1,2 x 10

4 células /cm

2, respectivamente. As células foram cultivadas em meio completo durante 24 h, em seguida, transfectadas com 440 ng /poço de plasmídeo repórter de luciferase de pirilampo usando JetPEI polietilenimina (Polyplus Transfecção) de acordo com o protocolo do fabricante. Após 24 h, o meio foi substituído e as células foram cultivadas durante mais 24 ou 48 h.

O plasmídeo de transfecção foi realizada pelo menos em triplicado e actividade de luciferase foi medida em duplicado ou triplicado, utilizando uma microplaca de 96 GloMax luminómetro (Promega) e normalizados para a concentração de proteína, como descrito anteriormente [38].

Preparação de extractos nucleares

os extractos nucleares foram preparados a partir de células DU145 na presença de inibidores de protease (cocktail inibidor de protease completo a partir de Roche mais PMSF 1,0 mM) e inibidores de fosfatase de proteína (5 mM β-glicerofosfato e 100 ^ M de na activados

3VO

4), utilizando o método de Dignam

et al [39].

eletroforética ensaios de mudança de mobilidade (EMSAs)

de qualquer 10 pg LNCaP extracto nuclear de células ou 120 nM purificada recombinante proteínas Sp1 humana (Ativo Motif) foram incubadas com 20 fmol biotina ‘DNA de cadeia dupla 3 marcado na extremidade oligonucleótidos utilizando condições anteriormente descrito [34]. As sequências para a frente dos oligonucleótidos foram: Sp1-1, 5’-CGGCCCGGTGGGGGCGGGACCCGACTCGCA-3 ‘; ARS, 5’-TCTCCACCCCGCCTCCCCCCACCCTGCCTT-3 ‘; e Sp1-3, 5’-TTCTCCCCACCCGCCCCCCCGCCCCCGTCG-3 ‘. Um oligonucleótido não marcado de um elemento de consenso Sp1 reguladora, contras SP1, 5’-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3 ‘, foram adicionados 15 min antes da sonda marcada. Para os ensaios de supershift os anticorpos ab13370 e ab52600 (Abcam) contra Sp1 humana e RNPhn-K, respectivamente, foram adicionados 15 min antes da adição da sonda marcada

Os ADN resultantes:. Produtos de proteína foram resolvidos em refrigerado 6% não desnaturante geles de poliacrilamida executados em tampão TBE 0,5x, pH 8,3 (Tris-borato 45, 1 mM de EDTA) e detectados utilizando reagentes quimioluminescentes Pierce LightShift (Thermo Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. Os dados foram compilados utilizando autorads de géis EMSA com a ordem das pistas dentro de alguns géis ser alterada para aumentar a clareza e facilitar as comparações. integração digital do DNA:. complexos de proteínas foi realizada utilizando um Vilber Loumat Fusão SL arrefecida sensor CCD tendo o cuidado para garantir que nenhuma saturação de pixel ocorreu

cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

Um relato detalhado da metodologia chip tem sido apresentado anteriormente [34]. Em resumo, as células LNCaP foram transfectadas com o plasmídeo à base de phAR1.6Luc relevante e cultivadas no modo usual. As células foram fixadas em formaldeído a 1% durante 10 min a 37 ° C e os núcleos foram preparados. Cromatina e do plasmídeo foram digeridos com 200 unidades HphI (NEB) durante 20 min a 37 ° C; seguido por lise e a remoção dos resíduos insolúveis por centrifugação. O sobrenadante foi diluído em tampão de chip e pré-aclarados com proteína G e proteína A Dynabeads (Life Technologies). As amostras de lisados ​​límpidos foram retidos como entrada (PI) e a restante foi incubado com anticorpos contra o SP1 (07-645, Millipore) ou IgG. Imunocomplexos foram recolhidos por magnetização, lavado duas vezes cada um com: baixo teor de sal; elevada de sal; LiCl e TE tampões, seguido de eluição. ADN-proteína ligações cruzadas foram invertidos com NaCl a 65 ° C e o ADN purificado. ADN isolado foi quantificado por fase log semi-quantitativo PCR e resolvidos por electroforese em gel de agarose em tampão TAE. A frente (F) e inverso (R) iniciadores foram: ARS-F, 5′-GCTGCTAAAGACTCGGAGGA-3 ‘; ARS-R, 5’-CTGAGAGTAGCCGACTGAGG-3 ‘; Sp1-3-F, 5’-CCCGAGTTTGCAGAGAGGTA-3 ‘e vect-R, 5′-TCTTCCATGGTGGCTTTACC-3’.

A análise estatística

O significado estatístico das diferenças em conjuntos de dados de ADN :. proteína formação do complexo em experimentos AESM foi determinada utilizando duas vias de análise de variância e teste t pareado análise de variância foi utilizada para todas as outras comparações entre os dados complementares

Resultados

O gene AR humana 5 ‘ UTR contém duas regiões com sobreposição de elementos reguladores

o exame do gene AR humano que codifica a região 5’UTR da transcrição (Fig 1A) revelou um potencial caixa de GC de ligação Sp1 (328-332 pb) que verificou-se estar dentro da sequência anteriormente descrita Supressor receptor andrógeno (ARS) [35] (Figura 1B). O primeiro exemplo de um elemento regulador ARS que se pode ligar a proteína pur-α ubiquamente expressa foi descrito na UTR 5 ‘do gene de AR rato sobre 400 pb a jusante da sequência humana correspondente [40]. Como ambas as caixas e locais de GC ARS tem elevado teor de GC, a possibilidade de outros exemplos desses dois elementos reguladores sobreposição foi investigada. Embora a ligação de PUR-α é uma sequência específica com uma preferência para repetições de (GGN), não há nenhuma sequência de reconhecimento de consenso clara, portanto, a região do ARS rato protegido de ADNase I a digestão foi usada para procurar outros locais possíveis no 5’UTR humano. Uma região da 5’UTR humano, distai em relação à sequência ARS, possuindo 85% de identidade foi detectada (Fig 1C) que é maior do que a identidade de 70% observado com a mesma sonda e o ARS humanos estabelecidos (S1A FIG). A utilização do rato definido sequência ARS [41] produziu um resultado semelhante com 75% de identidade de que, mais uma vez, foi maior do que o valor de 67% para os humanos (ARS S1B e Fig S1C), respectivamente. A região de potencial supressor novo sobreposto o elemento regulador Sp1-3 que é conhecido para abrigar duas caixas GC activas [29]. Isto levantou a possibilidade intrigante de que estas duas regiões pode actuar para estimular ou reduzir a expressão do AR.

(A) Representação esquemática da 5 ‘UTR do gene AR humano e promotor proximal imediato que mostra os principais elementos reguladores e as regiões em estudo. Bent seta indica o local de início da transcrição (1) e com a seta sólida ATG mostram o início da tradução. (B) caixa de GC Potencial (verde caixa tracejada) dentro do elemento regulador confirmados ARS humanos (azul sublinhado). (C) Alinhamento da 5’UTR AR humana e do rato elemento supressor AR 5’UTR protegido de DNase I digestão [40] (sublinhado em azul) com as caixas GC humanos confirmados (caixa sólida verde). Sequências homólogas estão indicadas por linhas verticais.

múltiplos alinhamentos das regiões equivalentes da 5’UTR do gene AR humano em 11 outras espécies utilizando sequências de ADN publicamente disponíveis (Figura 2) mostrou que ambas as sequências são mal conservada. A região ARS está presente apenas em primatas e a sequência no chimpanzé, que divergiram de seres humanos 6,6 milhões de anos atrás [42], tem homologia perfeita com humano. Além disso, e ao longo do período de 42,2 milhões de anos a partir da divergência dos seres humanos e de saguim, o primata mais divergente examinados, a maior parte das sequências mostram apenas algumas substituições de nucleótidos. A região Sp1-3 exibidas ainda menos homologia com apenas chimpanzé partilha de ambas as caixas GC com os seres humanos. Para ambas as regiões de interesse, as espécies não primatas possuíam níveis muito baixos de homologia com a humana, e não há sequências equivalentes foram encontrados em espécies de aves ou piscine (dados não mostrados). Além disso, o rato ARS região é extremamente mal conservada e sem sequência de ligação PUR-α foi encontrado na região genómica equivalente de outros animais, incluindo o roedor intimamente relacionados; do rato (Fig S2).

As regiões do gene da 5’UTR hAR sob investigação foram comparados com os das espécies indicadas placentários. (A) as ARS (caixa azul) e (B) o elemento regulador Sp1-3 (caixa verde). Diferenças em relação à sequência humana são indicados por negrito fonte, sublinhado.

A caixa de GC é o principal sítio de ligação Sp1 no promotor AR humana

As experiências iniciais examinou o efeito do Sp1 antagonista, mitramicina a, o gene AR endógeno em células LNCaP. Um mitramicina Observou-se uma redução dependente da dose nos níveis de proteína AR (Figura 3A) com uma concentração de 50 nM mitramicina Um sendo usado em experiências subsequentes. Estudos RT-PCR confirmou que a diminuição dos níveis de proteína AR correlacionado com a transcrição reduzida (Fig 3B).

células LNCaP foram incubadas com mitramicina A durante 24 h e, em seguida, ensaiadas. (A) análise de transferência de Western com os valores relativos de AR /GAPDH mostrados abaixo. (B) RT-PCR de ARNm de AR e de GAPDH. As células LNCaP foram transfectadas com phAR1.6Luc (WT) ou phAR1.6Luc-ΔCG e tratadas com DMSO ou 50 nM mitramicina A durante 24 horas e a actividade da luciferase foi medida. Os dados representam as médias ± DP de pelo menos três experiências independentes e a significância estatística das comparações indicadas são: * p 0,05; ** P 0,01 e *** p . 0.001

Quando por muito tempo se considerou que o fator de transcrição Sp1 é o principal motor da expressão do gene AR humano-faltando a caixa TATA, o importância relativa da caixa de GC (Sp1-1; -45 a -40 pb) do promotor-núcleo permanece obscura com estudos de deleção sugerindo que ou é essencial [27] ou não desempenhar um papel significativo [43]. Mutação da caixa de GC no plasmídeo repórter luciferase phAR1.6Luc [34] que contém uma seção de 1,6 Kpb do promotor hAR e 5’UTR entre as posições -741 pb para 842 pb levaram a uma redução de 80% na expressão de luciferase em transfectadas células responsivas andrógenos LNCaP (Fig 3C). Da mesma forma, uma redução de 46% foi observada com a linha celular de CaP não respondem a androgénios DU145 (dados não mostrados). Juntos, esses ensaios demonstraram que a caixa GC promotor core, e Sp1 vinculativo, desempenhar um papel proeminente na expressão de mRNA e proteína AR. Importante, o plasmídeo repórter mutante permaneceu suscetível à inibição por mitramicina A (Fig 3C), confirmando assim que a regulação positiva mediada-SP1 do gene AR ocorre em outros locais do que a caixa de GC.

O 5’UTR sobreposição de regulamentação elementos podem cima ou regulam negativamente a actividade do promotor

a fim de elucidar a atividade funcional de outros elementos reguladores potenciais em estudo, mais mutações foram introduzidos no plasmídeo repórter luciferase phAR1.6Luc. As experiências de transfecção foram realizadas utilizando tanto andrógeno responsivo, LNCaP e não-responsivo, as linhas celulares DU145 APC, que foram cultivadas em meio completo para assegurar que todas as células vias de sinalização que são dependentes de componentes do meio (factores de crescimento e hormonas), foram funcionais.

a fim de estabelecer o papel de ligação SP1 para a caixa GC potencial nas ARS (322-345 na 5’UTR), substituições de bases foram introduzidas para criar repórter phAR1.6Luc-UTRm1 que resultou na reduções de expressão, de 29% e 13% em DU145 e LNCaP respectivamente (Fig 4A e 4B), confirmando um papel activo para esta caixa GC romance em upregulating expressão AR. Por outro lado, esta região da 5’UTR foi mostrado que actua como um elemento regulador negativo, através da ligação da PUR-α factor de transcrição que tem sido relatado para ser rompida sob condições EMSA pela inclusão de um par de substituições de bases de dois [35] e estes foram utilizados para preparar repórter phAR1.6Luc-UTRm2. No entanto, utilizando a actividade de transcrição este repórter foi reduzida em 36% e 20% em DU145 e LNCaP, respectivamente, em vez de aumentarem (Figura 4B), como pode ser previsto após a libertação de um inibidor. Inspecção das alterações de sequência produzidos pela mutação revela que a guanina e cyctosine no centro da caixa GC putativa foram substituídos por adenina de uma maneira análoga à mutação específica em phAR1.6Luc-Sp1-UTRm1. Portanto, a perda de ligação de Sp1 neste elemento regulador é o resultado dominante, fornecendo mais evidências de que a caixa GC putativo pode upregulate ativamente expressão AR. Em a probabilidade de que a mutação por substituição da região de ARS não foi suficiente para prevenir a PUR-α e PRNhn-K de ligação em condições fisiológicas, todo o elemento regulador foi suprimido para criar phAR1.6Luc-UTRΔm1. Neste caso, a actividade do promotor foi regulada positivamente por 1,27 e 1,67 vezes em DU145 e LNCaP, respectivamente (Fig 4B) com a diferença entre as duas linhas celulares serem significativa (p 0,01).

(A) Representação esquemática de a luciferase phAR1.6Luc construção repórter conduzido por 1,6 kpb do promotor hAR 5’UTR e com ligação do factor de transcrição potencial para as regiões de interesse. Sp1-3 contém dois locais de ligação SP1. (B e C) As linhas celulares de CaP indicados, cultivadas em meio completo, foram transfectadas quer com phAR1.6Luc contendo a sequência de WT (barras pretas) ou a versão mutada (barras cinzentas) mostrado por cima de cada gráfico. dados de luciferase representam as médias ± SEM de, pelo menos, três experiências independentes e a significância estatística das comparações indicadas são: * p 0,05; ** P 0,01 e *** p . 0.001

mutações análogas também foram introduzidos na terceira sequência reguladora de interesse (423-446). Em primeiro lugar, as duas caixas GC em Sp1-3 foram mutados individualmente (phAR1.6Luc-UTRm3 e phAR1.6Luc-UTRm4) ou em conjunto (phAR1.6Luc-UTRm5). A actividade da luciferase revelou que a ruptura das caixas GC resultou em diminuições significativas na estimulação do promotor. As duas mutações simples diminuição da actividade de transcrição em 42% e 29% em células DU145 e por 29% e 17% em células LNCaP, e a mutação apresentada reduções duplas de 34% e 16% nas duas linhas de células, respectivamente (Figura 4C). Mais uma vez, as diminuições na atividade do promotor foram maiores em DU145 de LNCaP. Os efeitos das mutações não eram cumulativos, como seria de esperar a partir de dois locais de ligação que se sobrepõem. De um modo semelhante ao observado com 322-345 região, a mutação por substituição de bases do potencial elemento regulador negativo em sobreposição phAR1.6Luc-UTRm6 produzidas perdas de actividade transcricional de 9% e 4% em DU145 e LNCaP, respectivamente (Fig 4C). Estes valores eram menos que os observados com 322-345 região do descrito acima, no entanto, eles eram consistentes com a sequência de muda de ter apenas um impacto menor sobre os locais de ligação SP1. A eliminação de todo o potencial elemento regulador negativo no phAR1.6Luc-UTRΔm2 levou a 1,18 e 1,50 vezes supra-regulação de actividade de transcrição em DU145 e LNCaP, respectivamente (Figura 4C). Tal como acontece com a mutação de deleção phAR1.6Luc-UTRΔm1, o aumento da actividade do promotor foi significativamente maior do que em LNCaP DU145.

As características de ligação do 5 ‘UTR de sobreposição elementos reguladores

A possibilidade de que se liga SP1 para todas as três regiões em estudo foi examinada por ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSAs). Em experiências iniciais, Sp1 proteína humana recombinante purificada foi incubada com as sondas oligonucleotídicas marcadas contendo quer o quadro principal GC (Sp1-1), o potencial local de ligação romance Sp1 na região da ARS ou Sp1-3. Electroforética resolução dos produtos resultantes com todas as três sondas marcadas mostrou uma única elevada de ADN de peso molecular:. Complexo proteico perto do topo do gel (Fig 5A, pistas 2-4) consistente com SP1 tendo um peso molecular de 95 kDa

a proteína purificada Sp1 (painel a) ou extracto nuclear a partir de células DU145 (painéis (B) a (D)) foram incubadas com as sondas oligonucleotídicas marcadas indicados abaixo de cada gel e os produtos resolvidos por análise de desvio de mobilidade electroforética. As adições são mostrados acima e os géis foram: Ab, anticorpo; PI, soro pré-imune; Mith, mitramicina; contras SP1, consenso Sp1 oligonucleótido. Concorrentes oligonucleótidos não marcados (excesso molar de 100 vezes) ou soros imunes foram adicionados antes da adição da sonda. EMSAs são representativos de pelo menos 3 experiências independentes. (A) As sondas marcadas indicados foram incubadas com a proteína purificada Sp1 excepto na pista 1, que não tinha adição. seta preta indica complexo ADN-SP1. Foi adicionado anticorpo (B) Anti-Sp1 como indicado, e o complexo ausentes após a incubação com o anticorpo é indicado pela seta. (C) Mitramicina (120 nM) foi adicionado em vias indicadas e o complexo empobrecido após incubação com a droga é indicado pela seta sólida. (D) não marcado competir local de ligação do oligonucleótido que codifica consenso Sp1 foi adicionado como mostrado.

A incubação de extracto nuclear preparado a partir da linha celular de cancro da próstata DU145 com qualquer Sp1-1, ARS ou oligonucleótidos Sp1-3 produzido várias bandas com motilidades eletroforética praticamente idênticos (Fig 5B, pistas 1, 4 e 6, respectivamente). A ligação de Sp1 foi confirmada em todos os casos por meio da adição de anticorpo anti-SP1 que produziu um supershift com o oligonucleótido Sp1-1 e montagem muito diminuída de um ADN de elevado peso molecular: complexo de proteína com ambas ARS e Sp1-3 (Fig 5B , pistas 2, 5 e 7, respectivamente), enquanto que o soro pré-imune não teve efeito (Figura 5B, pista 3). Diferentes resultados da incubação com o anticorpo anti-factor de transcrição pode ocorrer em análises EMSA v.g. CREB-1 a locais CRE na promotores humanos insulina e somatostatina [44], devido a vários factores, incluindo: a força de ligação ao ADN; a organização /conformacional espacial da proteína em elementos reguladores, a orientação de ADN adjacente ao consenso e a presença de co-factores ligados.

A adição de mitramicina A, que interfere com a ligação de SP1 para o seu elemento regulador [45 ], muito reduzida formação dos altos complexos de peso molecular, com todos os três oligonucleótidos (Fig 5C, comparar as pistas 1 e 2, 3 e 4, e 5 e 6). Da mesma forma, a pré-incubação com excesso de oligonucleotídeo não marcado contendo a sequência de ligação consenso Sp1 praticamente eliminado todo o ADN: proteína formação do complexo (Fig 5D, comparar as pistas 1 e 2, 3 e 4, e 5 e 6). Juntos, esses resultados confirmam a ligação de Sp1 a todas as sequências contendo caixa de três GC, apoiando as conclusões de experimentos gene repórter (Fig 4). Além disso, a diferença nos resultados observados com os oligonucleótidos para o local Sp1-1 no promotor-núcleo em comparação com ARS e locais Sp1-3, que exibiu menor afinidade aparente para o SP1 naturais, diferentes resultados após incubação com anticorpo anti-SP1 e menor redução induzida por mutação em ensaios de luciferase (Fig 4), sugeriu que a ligação do SP1 para a caixa promotor GC o núcleo era mais forte que a 5’UTR.

o fator de transcrição pur-α liga-se preferencialmente a guanina rica DNA de cadeia simples ou as sequências equivalentes em DNA de cadeia dupla. A incubação de extracto nuclear ou com a cadeia dupla ou o G-rica vertente única inversa das ARS e sondas Sp1-3 produziu resultados bastante diferentes. Ambas as únicas sondas encalhados produziu um DNA: complexo de proteínas (indicado pela seta aberta) que migrou ligeiramente à frente do SP1: DNA e outros complexos de alto peso molecular tipicamente observado com a sonda de cadeia dupla (Fig 6A). Consistente com a habilidade de PUR-α para também se ligam de dsDNA, ambos os oligonucleótidos Sp1-3 ARS e de cadeia dupla produziu uma fraco de ADN: complexo de proteína que migrou numa posição muito semelhante ao produto visto com as sondas de cadeia simples. Importantemente, o ADN: complexo de proteína formado com o rico em G fio de Sp1-3 comportou-se de um modo idêntico ao do oligonucleótido ARS equivalente que se sabe ligar-PUR-α [36]. Curiosamente, PUR-α se liga ao ADN como dimeros e multimeros de [46], que podem sobreviver a condições não desnaturantes de EMSA resultantes aparentes nas características de migração de elevado peso molecular do ADN: complexos de proteínas. O anticorpo anti-PUR-α comercial não conseguiu obter um efeito e a proteína purificada não está disponível. No entanto, as cadeias complementares para a frente ricas em citosina da ARS e oligonucleótidos Sp1-3 falharam completamente para produzir o ADN: complexo proteína confirmando a especificidade da ligação ao cordão rico em G (Fig 6B, comparar pistas 1 e 7, e 4 e 8).

extracto nuclear de células DU145 foram incubadas com as sondas oligonucleotídicas marcadas indicados abaixo de cada gel e os produtos resolvidos por análise de desvio de mobilidade electroforética. As adições são mostrados acima e os géis foram: Ab, anticorpo; PI, soro pré-imune. EMSAs são representativos de pelo menos 3 experiências independentes. (B). (C).