Sumário

microRNAs (miRNA) reprimir RNAs mensageiros pós-transcricionalmente através da ligação a 3 ‘UTR do mRNA com a região da semente do miRNA. Foi suposto que as regiões de semente mais longas têm uma maior eficácia em repressão ARNm. Testámos esta hipótese através da avaliação da expressão diferencial miARNs envolvidos na regulação da resposta imunitária, um mecanismo importante no cancro colo-rectal (CRC), por categoria de comprimento semente. Nós posteriormente avaliadas expressão diferencial de alvos desses miRNAs no tecido do cólon e o impacto destes miRNAs na sobrevivência CRC. Determinou-se a complementaridade entre a sequência de cada região miARN semente e a UTR 3 ‘de cada gene alvo ARNm verificados experimentalmente. Nós miARNs classificadas em grupos com base em regiões de sementes perfeitamente correspondentes a um mRNA UTR com seis bases começando na posição dois, sete bases começando na posição um, sete bases começando na posição dois, ou oito bases começando na posição um. Analisamos esses grupos em termos de expressão diferencial miRNA entre carcinoma e mucosa colorretal normal, diferencial de expressão de mRNA-alvo do cólon, e risco de morrer de CRC. Após correcção para comparações múltiplas, a proporção dos miARNs que foram associados com a expressão de ARNm diferencial foi de 0% para o 6-mero, 13,64% para o grupo 7α-mer, 12,82% para o grupo 7β-mer, e 8,70% para o grupo 8-mer. A proporção de miARNs associados com a sobrevivência foi de 20% para o grupo 6-mer, 27,27% para o grupo 7α-mer, 10,23% para o grupo 7β-mer, e 21,74% para o grupo 8-mer. Nós não vimos uma relação linear entre o comprimento de sementes e miRNA expressão desregulação, a expressão do mRNA, ou a sobrevivência. Nossos resultados não suportam a hipótese de o comprimento região semente sozinho influências mRNA repressão

Citation:. Mullany LE, Herrick JS, Wolff RK, Slattery ML (2016) MicroRNA Semente Região a extensão do impacto no alvo Mensageiro Expressão RNA e Sobrevivência no cancro colorectal. PLoS ONE 11 (4): e0154177. doi: 10.1371 /journal.pone.0154177

editor: Geraldo A. Passos, Universidade de São Paulo, BRASIL

Recebido: 25 de fevereiro de 2016; Aceito: 08 de abril de 2016; Publicação: 28 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Mullany et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. De acordo com os formulários de consentimento assinados e com a aprovação de acordos de partilha de dados, conforme determinado pela Universidade de Utah Institutional Review Board (https://irb.utah.edu/), os dados só podem ser liberados por investigadores do estudo, para efeitos de não comercial, investigação do cancro do cólon, e deve estar em forma identificados-de. Entre em contato com [email protected] no que diz respeito à partilha de dados

Financiamento:. O financiamento para este estudo foi fornecido pelo Instituto Nacional do Câncer, conceder números CA163683 e CA48998. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os microRNAs (miRNAs) têm sido cada vez mais sob investigação para o papel que desempenham nos processos biológicos, em particular no que se refere ao desenvolvimento e progressão do câncer. miRNAs maduros são pequenas (~ 22-23 nucleótidos de comprimento), endogenamente expressos, as moléculas não-codificantes de proteínas de RNA que regulam pós-transcricionalmente RNA mensageiro (mRNA) [1-3]. Eles fazem isto através da ligação à região não traduzida a 3 ‘(UTR) do mRNA e fazendo com que ou a degradação de ARNm, por mais preciso de ligação, ou a inibição da tradução de ARNm, pelo menos precisa de ligação [4, 5]. Os miRNAs são capazes de regular muitos mRNAs individualmente [4], e mais de um miRNA pode ter como alvo um mRNA indivíduo, criando uma dinâmica complexa de regulação cooperativa [6].

Em 2015, a American Cancer Society informou que colorectal cancer (CRC) é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos, quando machos e fêmeas são considerados em conjunto, ea terceira quando eles são considerados separadamente, matando 100.000 pessoas em os EUA a cada ano [7]. CRC foi demonstrado ser uma doença complexa, envolvendo muitos processos biológicos [8], e como tais miARNs foram postulados como reguladores chave do CRC [9]. Um processo central na tumorigénese que tem sido proposto para ser significativos no desenvolvimento e progressão de CRC é uma inflamação crónica [10], e de forma mais ampla, o envolvimento da resposta imune [8, 11]. Os tumores são conhecidos como sendo imunogénica, em que elas induzem uma resposta imune [11]. Além de regular vários mRNAs alvo genes que estão envolvidos na resposta imunitária, miARNs têm sido implicados na diferenciação de linhagens hematopoiéticas, que joga um papel importante em ambas as respostas de células T e B [3].

Enquanto muitos factores podem contribuir para miARN-ARNm de ligação, a integridade com a qual a miARN liga-se ao ARNm, e o impacto resultante da miARN tem sobre a expressão do mRNA, é geralmente pensado para ser determinada pela sequência de semente no miARN [1, 12, 13 ]. A definição exacta da região da semente é um pouco debatida na literatura mas geralmente o canónica, ou “núcleo”, região de sementes é pensado para incluir uma cadeia contígua de pelo menos 6 nucleótidos começando na posição dois [13]. Mais especificamente, as sementes de núcleo ter sido descrito como um 6-mer (2-7 bases), 7-mer ( “7-Mer-A1” sendo as bases 1-7, e “7-Mer-M8” 2- sendo bases 8), e 8-mer (bases 1-8); em alguns comentários as sementes 7-mer-A1 e 8-meros são obrigados a ter uma adenina, ‘A’, como o primeiro nucleotídeo [1, 13-16]. Ellwanger et ai. descobriram que sementes mais longos, ou seja, sementes de 7 ou 8 nucleótidos de comprimento, eram mais evolutivamente conservadas do que as menores [13].

Neste estudo, olhamos para similaridade de sequência de sementes entre miRNAs e seus alvos de mRNA verificados correspondentes que participam na resposta imune, e avaliar a duração dos jogos de semente no que se refere à expressão de miARN na mucosa colorrectal normal, tecido de carcinoma colorectal, e a expressão diferencial bem miARN impacto sobre a sobrevivência e a expressão de ARNm diferencial do cólon. Ao avaliar um subconjunto de miRNAs, aqueles que visam a resposta imune, concentramos nossa investigação sobre miRNAs envolvidos em respostas fisiológicas importantes para o câncer, e limitar o número de interações que avaliar, por uma abordagem mais específica. Como as regiões de semente mais longos são suposto ter uma maior eficácia no que se refere à repressão ARNm [1], e os resultados de ligação mais precisos em degradação do mRNA, os autores sugerem que miARNs que se ligam ao alvo genes com uma região de sementes mais será mais significativamente associado com sobrevivência CRC-specific e degradação mRNA.

Materiais e Métodos

estudo da população

os dados vêm de participantes da Dieta, Atividade e estudo Estilo de vida de base populacional que foram recrutados de Utah ou no Programa de Atendimento Médico Kaiser Permanente do Norte da Califórnia (KPMCP). casos de câncer de cólon foram identificados como tendo um adenocarcinoma primário diagnosticados entre 1 de Outubro de 1991 e 30 de setembro de 1994, enquanto que os casos de câncer retal, foram diagnosticados entre Maio de 1997 e Maio de 2001. Todos os casos elegíveis tinham entre 30 e 79 anos de idade no momento do diagnóstico, vivendo em área de estudo, falava Inglês, foram capazes de completar uma entrevista, e não tinha história prévia de CRC, doença de Crohn, colite ulcerativa, ou conhecido polipose adenomatosa familiar. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Utah; todos os participantes assinaram um termo de consentimento informado.

miRNA Processamento

RNA

foi extraído de parafina tecidos fixados em formalina e processados ​​como descrito anteriormente [17]. 100 RNA total ng foi marcado com Cy3 e hibridado com Agilent Humano miRNA Microarrays v19.0 e foram digitalizados em um microarray SureScan modelo de scanner G2600D Agilent usando Agilent v.11.5.1.1 software Extrato de Recurso. Os dados foram obrigados a passar parâmetros QC rigorosos estabelecidos pela Agilent, que incluiu testes para o fundo excessiva de fluorescência, variação excessiva entre sequência sonda replica na matriz, e as medidas do sinal total gene na matriz para avaliar baixo sinal. Se as amostras não cumpria as normas QC, a amostra foi repetido, e se uma amostra falhou avaliação QC uma segunda vez a amostra foi considerada ser de má qualidade e foi excluído da análise a jusante. A plataforma Agilent verificou-se ser altamente fiável (r = 0,98), ter concordância razoável com NanoString [18], bem como uma excelente concordância com qRT-PCR (Pellatt, no prelo). Para as amostras não emparelhadas devido à falta de exames normais, imputada valores para mucosa normal, como anteriormente descrito em [19]. Para minimizar as diferenças que poderiam ser atribuídos à matriz, a quantidade de RNA, local em conjunto, ou outros fatores que poderiam influenciar erroneamente expressão, sinal total gene foi normalizado pela multiplicação de cada amostra por um fator de escala que foi a mediana de 75

percentis de todas as amostras divididas pelo 75

percentil de cada amostra individual [20]. Este fator de escala foi implementado utilizando SAS 9.4.

mRNA Sequencing Biblioteca Preparação, Sequenciamento e Processamento de Dados

construção da biblioteca RNA foi feito com o Kit de Preparação de Amostras Illumina TruSeq RNA Stranded total com Ribo-Zero . As amostras foram, em seguida, fragmentada e preparado para a síntese do ADNc, adaptadores foram então ligados para o ADNc e as amostras resultantes foram então amplificados utilizando PCR; a biblioteca amplificada foi então purificado usando esferas Agencount AMPure XP. Uma descrição mais detalhada dos métodos podem ser encontrados em nosso trabalho anterior [21].

O sequenciamento foi realizado utilizando célula de fluxo de leitura única uma Illumina TruSeq v3 e 50 ciclos sequência single-ler corrida foi realizada em um Illumina instrumento HiSeq. Lê foram então alinhado com um banco de dados contendo sequência do genoma humano (construir GRCh37 /hg19, de Fevereiro de 2009 genome.ucsc.edu) e alinhamento foi realizada utilizando v2.08.01 novoalign. Python e uma biblioteca pysam foram usadas para calcular as contagens para cada exão e UTR dos genes utilizando uma lista de coordenadas obtidas a partir do gene https://genome.ucsc.edu. Nós cair características que não foram expressas nos nossos dados ou para o qual a expressão foi em falta para a maioria das amostras. Uma descrição mais detalhada dos métodos podem ser encontrados em nosso trabalho anterior [21].

Análise Bioinformatics

A lista de genes de mRNA foi obtida a partir Ensembl usando a ferramenta Biomart de Ensembl, usando a versão mapeada ao genoma humano GRCh38. Foi solicitada uma lista de ENSEMBL Gene IDs e Associated Gene Nomes que tinha o atributo GO termo “resposta imune”. Isto rendeu uma lista de 1.762 IDs ENSEMBL, correspondendo a 1.355 nomes de genes únicos. A lista das associações miRNA-gene foi então gerada utilizando o repositório de Homo sapiens a partir miRTarBase, que utiliza miRBase 21. Os miRNAs que foram associados com genes encontrados na lista “resposta imune” e foram experimentalmente verificados usando um “ensaio de repórter”, “qRT -PCR “, ou” western blot “, uma vez que estes métodos são considerados mais forte por miRTarBase, foram adicionalmente analisados. Estas restrições rendeu 1.413 associações miRNA-alvo que compreende 395 únicas “genes” resposta imune e 327 miRNAs únicas. A plataforma Agilent corresponde a miRBase 19 nomenclatura e, ao utilizar esta versão para sequências FASTA podemos ver que as sequências atuais estavam sendo diferencialmente expressos em nosso conjunto de dados. Como miRTarBase v6.0 é baseado fora de miRBase 21, isto permite-nos conhecer as associações mais atuais, e apenas os miRNAs que combinavam em nome transitaram na análise. sequências FASTA UTR mRNA 3 ‘foram obtidos para os genes que foram verificados metas para miRNAs de Biomart de Ensembl; aplicou-se uma exigência de filtro de “CCDS ID”, a fim de obter apenas as sequências de consenso. regiões de sementes foram gerados para cada um miARN calculando o complemento de ADN inverso dos nucleótidos 2-7, 1-7, 2-8, ou 1-8 da extremidade 5 ‘da miARN para fazer o 6-mero, 7α-mer ( também chamado 7-Mer-A1 na literatura), 7β-mer (também chamado 7-Mer-M8 na literatura), e as sementes de 8-mero, respectivamente. Em seguida, procurou o UTR 3 ‘do ARNm que se verificou experimentalmente a ser alvejado pelo miARN a partir do qual eles foram gerados para cada uma das sequências de sementes. MiRNAs que ocorreram em apenas uma categoria de sementes foram realizadas em na análise; isso foi feito para polarizar os resultados, bem como reduzir a ambiguidade em associações miRNA-genéticas inferidas. Um diagrama deste processo pode ser visto na Figura 1. Os grupos finais de miARN consistiu de 99 miARNs: 15, 22, 39, e 23 para miARNs 6-mer, 7α-mer, 7β-mer e 8-mer sementes respectivamente. O número de miARNs correspondentes a cada grupo pode ser visto na Fig 2. Depois de determinar que miARNs foram significativamente expresso diferencialmente entre a mucosa colorrectal normal e tecido de carcinoma colo-rectal, foi identificado um novo conjunto de genes-alvo para os miARNs. A lista resultante não era espec�ico “resposta imune”, embora não incluem genes de “resposta imunológica”, como os miRNAs in vivo provavelmente não iria limitar a sua acção sobre os mRNAs a que se dirigem. Estes genes foram então analisados, conforme descrito abaixo, para as associações com as respectivas miRNAs de segmentação para investigar mais o impacto de sementes do tipo de ligação na expressão de mRNA.

Métodos Estatísticos

A nossa amostra foi composta por 1893 indivíduos com níveis de expressão de miRNA tanto para carcinoma e os tecidos da mucosa normais. Nós comparamos log de base 2 transformou níveis de expressão de miRNA entre o tecido carcinoma emparelhados e mucosa colorretal normal geral, estratificados por estudo utilizando a análise de significância de microarrays (SAM) técnica nas siggenes pacote R [22]. P-valores gerados a partir de SAM foram baseadas em 1.000 permutações com uma taxa de descoberta de falsas (FDR), fixado em 0,05 [23]. Analisou-se a quatro regiões de sementes, 6-mer, 7α-mer, 7β-mer e 8-mer, conjuntamente. Para esses miRNAs que foram significativamente diferencialmente expressos, relatamos o nível médio de expressão e a mudança vezes (sobre a não-log dados transformados) entre o tecido carcinoma colorectal e mucosa colorretal normal.

Em seguida, examinou o impacto de expressão miRNA diferencial na sobrevivência utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox em 1855 indivíduos com dados de sobrevivência disponíveis. Nós, as taxas de risco calculado (RH) e correspondentes intervalos de confiança de 95% (IC) com a unidade de mudança sendo o intervalo interquartil (IQR), o ajuste para idade, sexo e estágio AJCC geral, bem como estratificada por estudo e estágio. Testamos a sobrevivência CRC-specific com base em meses entre a data de diagnóstico e morte ou última data de acompanhamento. Os indivíduos que morrem de outras causas ou que foram perdidos para follow-up foram censurados pelo seu tempo de morte ou a data do último contato. A sobrevivência pacote R foi utilizada para calcular os valores de p com base em 10.000 permutações do ensaio de taxa de probabilidade. Porque um número de miRNAs foram raramente expressa, que definimos como a expressão em menos de 50% dos indivíduos, foi calculado o HR para estes miRNA com base em qualquer expressão sem o uso de permutações para calcular os valores de p no SAS 9.4 (SAS Institute, Cary , NC). Nós combinamos os valores de p de ambos os miRNAs mais comumente expressa e os miRNAs raramente expressas e ajustado para comparações múltiplas utilizando um FDR de 0,05.

Finalmente, examinou a relação entre miRNAs diferencialmente expressos e seu respectivo alvo mRNA genes avaliando a 302 combinações identificadas em miRTarBase pelo método descrito acima no subconjunto de 148 sujeitos com dados de mRNA disponíveis. Geramos modelos de regressão linear ajustados para idade e sexo em 1000 de bootstrap [24] amostras. Calculou-se a expressão do mRNA diferencial como a diferença da base de log 2 do RPKM (Lê per quilobases por milhão) para o carcinoma e os tecidos da mucosa normais. Os valores de p foram gerados a partir da distribuição dos coeficientes de p para cada miARN e avaliando H

0: β = 0 versus H

1: p ≠ 0 usando o pacote de inicialização em R. Nós ajustadas para comparações múltiplas utilizando um nível FDR de 0,05. Padronizamos as encostas gerados a partir do conjunto de dados global, a fim de comparar os resultados em todo o miRNA.

Resultados

Um resumo geral dos miRNAs incluídos nas análises e excluídos da análise após a geração de sementes pode ser encontrados na Tabela S1.

Quarenta e três miRNAs foram significativamente diferencialmente expressos entre os tecidos da mucosa e colorectal carcinoma colorretal normais (Tabela 1). Além daqueles diferencialmente expressos em câncer colorretal, três miRNAs foram diferencialmente expressos por apenas cancro do cólon e três foram diferencialmente expressos por apenas câncer retal. Dos 49 totais miRNAs desregulados, 18 foram regulados positivamente e 31 foram reprimidos no tecido carcinoma contra mucosa colorretal normal. Seis dos miRNAs foram classificados como 6-mer vinculativo, 12 foram classificados como 7α-mer, 19 como 7β-mer, e 12 como 8-meros. Dezesseis desses miRNAs teve uma mudança dobra de ≥1.5 ou ≤0.67 representado por uma 6-mer, quatro 7a-meros, quatro 7p-meros e sete 8-meros.

Dezoito miRNAs foram significativamente associados com a sobrevivência alterada; 17 destes miRNAs foram associados com a sobrevivência após o diagnóstico de câncer retal e um foi associada com a sobrevivência CRC geral após o ajuste para comparações múltiplas (Tabela 2). Dos 18 miARNs que estavam associados com a sobrevivência alterada, 15 também foram significativamente expresso diferencialmente entre a mucosa colorrectal normal e tecido de carcinoma colorrectal. Não miRNAs alterado sobrevivência apenas para o câncer de cólon. Três destes miARNs foram classificados como 6-meros, como cinco 7a-mers, quatro como 7p-meros, e três como 8-meros.

Dezanove miARNs foram associados com a expressão dos seus mRNAs segmentados conhecidos (Tabela 3); 12 delas permaneceu significativa após ajuste para comparações múltiplas. Destes 12, seis miRNAs foram inversamente associados com a expressão do mRNA alvejado e seis foram diretamente associados com a expressão do mRNA alvejado. Dos miARNs que mostraram uma associação directa com a expressão diferencial de ARNm, um foi classificado como um 7α-mer, como dois 7p-meros, e três como 8-meros. Dos miRNAs que mostraram uma associação inversa com o ARNm diferencial expressão dois foram classificados como 7a-meros e quatro foram classificados como 7p-meros.

Um resumo do número de miRNAs diferencialmente expressos significativamente, associados com risco de morrer de colorretal ou câncer retal, e associado a expressão de mRNA diferencial são mostrados para cada categoria de semente na Tabela 4. Enquanto o grupo de sementes 7α-mer tinha a maior proporção de miRNAs em cada teste estatístico, as percentagens para cada categoria eram muito perto, sugerindo que não há verdadeira diferença em proporções. À medida que o número total de miARNs em cada categoria é relativamente pequeno, uma ou duas miARNs poderia explicar a diferença nas proporções.

A sobreposição de miARNs representados por cada uma das análises pode ser visto na figura 3. a partir deste diagrama, vemos que apenas quatro miRNAs foram significativamente diferencialmente expressos, foram associados com a sobrevivência alterada, e foram significativamente associados com a expressão do mRNA alterada após o ajuste para comparações múltiplas. Destes quatro miARNs, dois foram classificados como 8-meros, como um 7β-mer, e um foi classificado como 7α-mer. Apenas um destes quatro, hsa-miR-150-3p, foi inversamente associado com a expressão do mRNA, o resto foram diretamente associados.

Discussão

Muitos miRNAs neste estudo foram diferencialmente expresso entre o tecido carcinoma colorectal e mucosa colorretal normal, foram associados ao risco alterado de morrer de qualquer CRC ou o cancro rectal, ou foram associados com a expressão do mRNA do cólon diferencial. Quatro desses miRNAs foram encontrados para ter associações significativas em todos os três testes. Nossa hipótese é que, porque as regiões de sementes mais longas têm uma maior eficácia da repressão mRNA e resultados de ligação mais precisos em degradação do mRNA, que as regiões de sementes mais longos seria mais associada à expressão de mRNA diferencial, bem como risco de CRC. Em geral, o grupo de sementes 7α-mer, que consiste de miARNs com sementes compreendendo os nucleótidos 1-7, teve resultados mais significativos em termos de como muitas miARNs pertencentes a cada uma das categorias foram associados com a expressão diferencial tanto de miARN, a expressão diferencial de mRNA ou a sobrevivência. No entanto, como os percentuais são bastante perto para todos os grupos, é provável que este resultado não é estatisticamente diferente. Além disso, não houve tendência linear, isto é, número de 6-semente número de 7a /β-sementes número de 8-sementes ou vice-versa, com a proporção de miARNs de cada grupo de sementes que foram significativas com expressão diferencial de mRNA ou com a sobrevivência. Isto sugere que o comprimento da semente sozinho, pelo menos, tal como é definido no presente estudo, não está associado com qualquer expressão diferencial de mRNA entre o tecido de carcinoma de cólon e de mucosa do cólon normal ou com risco de morrer de CRC. Houve uma tendência linear ligeira na expressão diferencial miRNA com as mudanças dobra ≥1.5 ou ≤0.67 no que se refere às sementes comprimento região, sucessivamente mais miRNAs sendo diferencialmente expressos em comprimento região de sementes aumentou. Isto, no entanto, é pouco provável que seja biologicamente relevante.

Contrariamente ao seu papel bem estabelecido como repressores, miARNs foram mostrados recentemente para activar a tradução de ARNm, quando as células estão num estado quiescente [25]. Especificamente, HSA-let-7 exógena foi mostrado para aumentar a

HMGA2

tradução quando adicionados a células HeLa (quiescentes) privadas de soro. Em nosso estudo observamos aumento da expressão de HSA-let-7d-5p no tecido carcinoma colorectal, em comparação com mucosa colorretal normal, e uma associação direta entre HSA deixá-7F-5p e

HGMA2

expressão (β = 0,16, P

adj = 0,032), indicando um aumento subsequente da

expressão HGMA2

no tecido carcinoma. HSA-let-7d-5p é categorizado como um miRNA obrigatório em nosso conjunto de dados 7β-mer. Como esta dinâmica foi visto anteriormente em células quiescentes, pode ser que os indivíduos que expressam níveis mais elevados de HSA-let-7d-5p e

HMGA2

têm mais células que estão em um estado dormente. Vimos regulação positiva de hsa-miR-196a-5p e hsa-miR-196b-5p no tecido carcinoma colorectal, em comparação com mucosa colorretal normal; que posteriormente viu uma relação direta com HSA-miR-196a-5p e

HOXB7 Comprar e hsa-miR-196b-5p com

HOXA10

no tecido carcinoma do cólon. As mesmas relações entre estes miARNs e ARNm foram observados em pacientes com a doença de Huntington, em comparação com cérebros normais [26]; Neste estudo atribuiu essa observado dinâmica para processamento de mRNA aberrante. Como este estudo identifica um caminho chave enriquecido por esses genes como “A morte celular e sobrevivência”, encontrado usando IPA, poderia ser que essa relação não ortodoxa é devido a alterações nessa via. Fosfatase e homólogo tensina, ou

PTEN

, codifica para uma enzima que se encontra em muitos tecidos do corpo e actua de modo a inibir o crescimento descontrolado, actuando assim como um supressor de tumores [27]. Este gene foi associado diretamente com HSA-miR-425-5p, que foi aumentada no tecido carcinoma (dobre mudança = 1.79, P-value 0,0001). Sobre expressão de HSA-miR-425-5p no carcinoma colorectal foi associado à diminuição do risco de morrer de câncer retal (IQR Gama HR 0,84 IC 95% 0,74, 0,95 P

adj = 0,0354). Como este miARN foi associada com a expressão aumentada de

PTEN

no tecido do cólon (β = 0,25, P

aj = 0,024), e a expressão diferencial de miARN este foi similar para tecido do cólon e rectal, é possível que uma associação semelhante com PTEN seria visto em tecido rectal. O risco alterado de câncer retal poderia, portanto, ser afetado pela capacidade do PTEN para suprimir o crescimento descontrolado.

Uma limitação é que avaliou dados de mRNA por apenas tecido do cólon. Embora tenhamos mostrado que a desregulação de miARN é semelhante para cancro do cólon e rectal [18], não se sabe se o ARNm de desregulação é a mesma para o cancro rectal e do cólon. No entanto, se for, é interessante notar que, dos miARNs que foram associados com ambos sobrevivência alterada após o diagnóstico de cancro rectal e a expressão do mRNA no tecido do cólon, aqueles que o aumento da sobrevida (HSA-miR-192-5p, hsa- miR-30e-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-142-3p e hsa-miR-196b-5p) tiveram associações diretas com expressão de mRNA (β 0) e aqueles que o aumento do risco de morte por câncer (HSA-miR-486-5p e hsa-miR-150-3p) teve uma associação inversa com a expressão de mRNA (β 0). Como uma célula de repouso não é dividir de forma incontrolável, é possível que esta relação entre miRNAs e ativação de mRNA em células quiescentes contribui para a melhora da sobrevida nestes assuntos, no entanto, como alguns destes genes têm propriedades oncogênicos (

MYC

,

MYB

, e

IGF1R

) ou estão relacionados com a transcrição do DNA e diferenciação celular (

KAT2B

,

HOXB7

,

HOXB8

,

HOXA7

,

HOXA9

, e

HOXA10

), é provável que muitos fatores influenciam a expressão gênica global na célula e subsequente impacto na sobrevida. Além disso, porque todos os miARNs associados com risco alterada e a expressão de ARNm são de diferentes grupos de sementes, é pouco provável que a ligação por si só as sementes contribui para esta ocorrência.

Este estudo avalia apenas tecido CRC. Enquanto nós acreditamos que as regiões de semente deve comportar-se de forma semelhante em outros tecidos, a expressão de miARN tem sido mostrado para ser específico de tecido e isto pode limitar a generalização destes resultados como aplicado a outros tipos de tecidos. Existem muitos factores possíveis que também podem influenciar a ligação de miARN-ARNm. Como estávamos interessados ​​em saber como comprimento região semente impactado miRNA vinculativo, a expressão do mRNA, e sobrevivência em pacientes com CCR, existem alguns elementos potencialmente relevantes que não considerar neste estudo. Estas influências sobre a ligação de miRNA-mRNA incluem: outros elementos de microRNA-reconhecimento (MRE), a composição da UA e elementos AU-ricos (Ares) e outras influências sobre a acessibilidade do site, 3 ‘(do miRNA) compensatório obrigatório, conteúdo GC da semente região, se a sequência de semente é conservada, e a distância a partir do codão de terminação no local e perto do fim da 3 ‘UTR do ARNm [1, 2, 15, 28]. Além disso, é possível que algumas miARNs interagir principalmente com ARNm através da sua extremidade 3 ‘, ou exibem não canónicas locais de ligação (que são, por vezes, na literatura descrita como sementes que são de 6 nucleótidos de comprimento, em vez de 7 ou 8), que se manifesta por protuberâncias ou de um único nucleótido laços nas regiões de semente, ou ligam-se na região média da miARN [16]. Estas variações sobre miRNA-mRNA ligação não foram investigados neste estudo, e, como tal, algumas interações podem ser desperdiçada. Finalmente, como se referiu anteriormente, o 7α-mer (como descrito noutro 7-Mer-A1) e as sementes de 8-mer são, em alguns estudos descritos como aqueles que têm uma adenina na posição um. Nós não calcular regiões de sementes desta forma, em vez encontramos exata, Watson-Crick, os jogos entre as sementes e mRNAs de miRNA. Porque esta distinção é normalmente aplicado a previsão alvo mRNA, e só olhou para os jogos de sementes em mRNAs que foram experimentalmente verificados como alvos para miRNAs que foram diferencialmente expressos, não sentimos que este é um prejuízo para nossa investigação. Alguns dos miARNs, os que começam com um uracilo, têm sequências complementares que começam com uma adenina, e como tal o nosso conjunto de dados inclui algumas 7a-meros e 8-meros que seguem este padrão, e outros que se seguem a mais ampla de emparelhamento de Watson-Crick . A abordagem que levou ao examinar semelhanças região de sementes olhou para uma correspondência perfeita e intencionalmente polarizou o conjunto de dados apenas por análise de miRNAs que aparecem em uma categoria de sementes. Enquanto isto foi feito, a fim de limitar as comparações e tornar a interpretação dos resultados mais fácil, pode ser que esta abordagem não é apropriada para a análise desejada. É possível que uma abordagem que determina uma sequência ou sequências de consenso e permite miRNAs para estar em vários grupos seria melhor e nós encorajamos outros estudos para examinar isso.

Conclusões

A hipótese que miARNs os pertencentes aos grupos de sementes mais longos, isto é, aqueles nos 7 e 8-semente categorias, que compreendem a maioria dos resultados para a expressão diferencial de mRNA, assim como para a sobrevivência, devido à sua capacidade proposto para a repressão do mRNA. Enquanto muitos miRNAs foram diferencialmente expressos entre o tecido carcinoma colorectal e mucosa normal, foram associados com risco de morrer após um diagnóstico de câncer retal, ou foram associados com a expressão do mRNA diferencial, sementes comprimento região não influenciou essas associações. Nossas descobertas poderiam ser influenciado pela forma em que foi determinada região de sementes e que miARNs incluir na análise. Descobrimos que miRNAs que foram diretamente associados com a expressão do mRNA do cólon aumento da sobrevida de câncer retal, e aqueles que foram inversamente associado com a expressão do mRNA do cólon maior risco de morrer de CRC. Devido ao pequeno número de miRNAs que foram associados à sobrevida CRC, nós encorajamos outros estudos para investigar isso.

dinâmica Informações de Apoio

S1 Table. Resumo de miRNA grupo resultados e região semente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0154177.s001

(DOCX)

Reconhecimentos

O conteúdo deste manuscrito são da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Instituto Nacional do Câncer. Nós gostaríamos de agradecer Dr. Bette Caan eo Medical Research Program Kaiser Permanente para as contribuições de amostra, Erika Wolff e Michael Hoffman para o processamento de miRNA, Brett Milash e o recurso compartilhado de Bioinformática do Instituto de Câncer Huntsman da Universidade de Utah e de miRNA e mRNA bioinformática processamento de dados e Sandie Edwards por seus esforços no acompanhamento estudo global e coleta de tecido tumoral.