Abstract

terapia de privação de andrógeno tornou-se o tratamento de linha de punho de câncer de próstata metastático; No entanto, a progressão da doença para castrar resistência ocorre na maioria dos pacientes. Assim, existe uma necessidade urgente para melhoramentos na terapia para o cancro da próstata resistente à castração. Os objetivos do presente estudo foram determinar a octreotide eficácia análogo da somatostatina (OCT), combinada com uma baixa dose de docetaxel (DTX) usando células cancerosas da próstata resistente da castração e investigar os mecanismos moleculares envolvidos na vitro. Os anti-proliferativa e sinergismo efeitos potenciais foram determinadas por ensaio MTT. A indução de apoptose foi analisada utilizando anexina V e iodeto de propídio e coloração de citometria de fluxo. VEGFA, CASP9, CASP3 e o gene ABCB1 expressão foi avaliada por análise Q-RT-PCR e RT-PCR. Outubro em combinação com tratamentos DTX sobre a migração de células DU145 foi também avaliada. A investigação revelou que a administração combinada de DTX e outubro tiveram significativa sinergia maior citotoxicidade, do DTX ou PTU tratamento sozinho. A combinação das duas drogas causaram um aumento mais marcado na apoptose e resultou em maior supressão do potencial invasivo do que qualquer dos agentes individuais. Houve aumento evidente na expressão de caspase 3 em sozinho e grupos de tratamento combinado de duas drogas, no entanto, a expressão VEGFA foi marcadamente suprimida neles PTU. Estes resultados suportam a conclusão de que análogos da somatostatina combinado com docetaxel pode aumentar as eficácias de quimioterapia através de múltiplos mecanismos em linha de células CaP resistente à castração. Este trabalho fornece uma razão pré-clínico para as estratégias terapêuticas para melhorar o tratamento na doença resistência castração

Citação:. Zhu S, Oremo JA, Li S, Zhen M, Tang Y, Du Y (2014) sinérgicos antitumorais Actividades de Docetaxel e octreotida Associated com apoptose-regulação alta no cancro da próstata resistente à castração. PLoS ONE 9 (3): e91817. doi: 10.1371 /journal.pone.0091817

editor: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de dezembro de 2013; Aceito: 13 de fevereiro de 2014; Publicação: 14 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi suportado em partes por uma concessão do National Science Foundation Natural da China (81041102) e Fundação de Pesquisa científica preferido para o ultramarinos de estudiosos chineses, Ministério de Educação do Estado. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o câncer mais comum que representa uma grande ameaça para a saúde dos homens. terapia de privação de andrógeno (ADT), envolvendo a castração cirúrgica ou química é o tratamento padrão para pacientes com PCA avançada [1]. No entanto, a maioria dos pacientes tornam-se refractários à privação de androgénio e, finalmente, progredir com doenças resistente à castração [2], normalmente dentro de 12-24 meses desde a iniciação da terapêutica hormonal [3]. O surgimento de clones resistente à castração agressivo durante ADT é justificativa para terapia baseada em taxano, que é a única classe de quimioterapia para mostrar um benefício de sobrevivência no cancro da próstata resistente à castração metastático (CRPC) [4], [5].

Docetaxel (DTX) é a opção quimioterápico de primeira linha para pacientes com CRPC sintomáticos que são candidatos à quimioterapia [6], o que aumenta a resposta global, a remissão clínica dos pacientes com câncer de próstata [7]. DTX tratamento aumenta a fosforilação de Bcl-2, sub-regula os níveis de proteína Bcl-XL, induz p53 e, portanto, resulta em apoptose [8], [9]. Além disso, foi relatado DTX para exercer efeitos anti-angiogénicos [10]. Lembra-nos a evidência inicial de que taxotere poderia inibir a proliferação de proliferação umbilical humana células endoteliais da veia através da inibição da secreção de VEGF [11]. Por isso, nós investigamos a secreção VEGFA antes e após o tratamento com vários agentes. No entanto, especialmente citotoxicidades neurotoxicidade periférica e efeitos colaterais hematopoiéticas são significativas e progressão inevitável ocorre após o tratamento DTX [12], [13]. A resistência pode desenvolver-se através de uma variedade de mecanismos incluem a inibição de apoptose e a activação dos quinase PI3 /Akt percursos de sobrevivência relacionadas com sinais extracelulares com o desenvolvimento de metástases [14]. Devido à resistência, que muitas vezes não consegue curar pacientes, por conseguinte, é importante identificar as melhores alternativas ou estratégias terapêuticas que invertem a resistência a quimioterapia e a aumentar a sensibilidade aos fármacos de quimioterapia com docetaxel.

A somatostatina (SST) foi descoberto como um inibidor da hormona do crescimento que foi primeiro isolada a partir do hipotálamo de ovinos. Distribui-se em muitos órgãos humanos e tumores com uma variedade de funções, tais como a inibição da proliferação celular, regulação das actividades da fosfatase fosfotirosina para inibir a cinase PI3 e PLANO actividades de quinase [15]. Muitos análogos de somatostatina sintéticas (octreotide, lanreotida, vapre�ido e depreotida) foram desenvolvidos e cinco subtipos diferentes de receptores de somatostatina pode ser vinculado por eles [16]. receptores de somatostatina estão presentes em membranas celulares de linhas celulares de CaP resistente à castração, no entanto, a sua expressão dinâmica pode variar dependendo da característica fenotípica de cada linha de células [17]. O análogo de somatostatina octreótido sintético (PTU) tem sido extensivamente estudada como um dos análogos de SST e acumular evidência apoia a sua actividade antitumoral em terapia do cancro [18], [19]. Outubro foi aprovado pela FDA para ser usado como um padrão de cuidados para o tratamento médico em vários tipos de cânceres. Ele tem uma estabilidade altamente melhorada em comparação com a somatostatina natural, permitindo um tratamento a longo prazo [20].

Pentear agentes anticancerígenos diferente é uma estratégia razoável com o qual para obter um efeito citotóxico potente em células cancerosas. Em nosso estudo, determinou-se o efeito do tratamento combinado de DTX e outubro sobre o perfil de expressão de genes associados com a apoptose, angiogênese e drogas de tolerância em células DU-145. Os resultados aqui apresentados mostram que a associação de DTX e outubro fornecida uma mais do que aditivo resposta apoptótica. Esta combinação de drogas romance foi mais eficiente na indução de apoptose e reduzir a migração do que apenas uma ou outra droga. Estes resultados fornecem uma compreensão global das estratégias clínicas de câncer de próstata e inversão de resistência aos medicamentos.

Materiais e Métodos

células e cultura de células

células cancerosas DU145 próstata e células PC3 foram fornecidos amavelmente como um presente pelo Prof. Peter Nelson (Fred Hutchinson Cancer Research Center). Eles são adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, EUA) que foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Hyclone) e 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% CO2. As células confluentes foram passadas com tripsina-EDTA (0,05% de tripsina e 0,53 mM de EDTA tetrassódico) e colhidas para preparar ARNm tal como descrito abaixo.

Tratamento e ensaio de viabilidade celular

células de cancro da próstata DU145 foram semeadas em placas de 96 poços em quintuplicado com meio basal de Dulbecco mais soro de bovino fetal a 10% e mantidas em cultura durante 24 h. As células foram tratadas com DTX (5, 10, 20, 50 ou 100 nM) e outubro (10, 10

2, 10

3, 10

4, 10

5 nM), utilizadas sozinho ou em combinações em simultâneo durante 24 h, 48 h e 72 h, respectivamente. No final da incubação, o meio celular foi removido e 100 ul /poço de uma solução de MTT (brometo de /0,5 mg ml em PBS) foram adicionados. Em seguida, as placas foram incubadas durante 3 h (a 37 ° C, ao abrigo da luz). Após incubação a 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 h, os sobrenadantes foram removidos cuidadosamente, e 150 ul de DMSO foi adicionado a cada poço. As células foram então chocado durante 10 min no escuro. A absorvância foi medida a 450 nm num leitor de microplacas (Bio-Rad 680). A análise dos resultados obtidos foi realizada utilizando GraphPad Prism programa de 4 computador para avaliar a taxa de proliferação celular e taxa de citostático. células não tratadas foram utilizados como controle.

RNA e DNA extração

Total de RNAs de células cultivadas foram extraídos utilizando Trizol reagente (Takara, Dalian, China) de acordo com as instruções do fabricante e as suas concentrações foram determinadas por um espectrofotômetro (NanoDrop, Nyxor Biotech). ADN genómico de células de cultura foram extraídos utilizando DNeasy Blood Kits de tecido (Qiagen) e as suas concentrações foram medidas com o NanoDrop espectrofotômetro. Todos os processos foram realizados de acordo com as instruções dos fabricantes.

RT-PCR e Q-RT-PCR

quantitativa PCR em tempo real foi realizado com a mistura principal QPK-201 SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japão) e o sistema ABI 7300 da Applied Biosystems. Os iniciadores utilizados no estudo foram obtidas de Invitrogen (Pequim, China) e apresentado na Tabela 1. Os parâmetros de ciclagem térmica incluído um passo de RT a 50 ° C durante 20 min, seguido por um passo de activação da polimerase de ADN a 95 ° C durante 2 min e 50 ciclos de PCR (95 ° C durante 20 s, 60 ° C durante 30 s). Todas as reacções foram realizadas em triplicado. A dobra-mudança na expressão diferencial de cada gene foi calculada utilizando a comparativo C

Tmethod (também conhecido como o 2

-ΔΔCTmethod) tal como descrito por Lu et al [21].

Fluxo de avaliação por citometria de-FITC V /as células marcadas com PI anexina

As células cancerosas foram cultivadas em placas de 6 poços durante 24 h, tratada com DTX (20 nM) e outubro (10

3 nM) sozinho ou em combinação simultânea de mais 48 h. Para detectar eventos apoptóticos, as células foram lavadas duas vezes com PBS e o sedimento foi re-suspenso em 1 × tampão de ligação a Anexina a uma concentração de 10

6cells /ml. Em seguida, 100 ul da suspensão de células foi transferida para tubo de 5 ml de cultura. Em seguida, 5 ul da Anexina V-FITC e 5 ul de iodeto de propídio foram adicionados a cada um dos testes, e as amostras foram incubadas durante 15 min à temperatura ambiente na escuridão. Após este tempo, a 400 ul de tampão de ligação 1 × anexina foi adicionada a cada tubo e as células foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo BD FacsCanto (BD Biosciences). Cada experimento incluiu as células amostras de controlo coradas com anexina V-FITC (sem PI) e as células coradas com PI (sem anexina V-FITC). As células viáveis ​​foram anexina V-FITC e PI-negativo, as células em apoptose precoce foram anexina V-FITC-positivas e PI-negativo e células no final de apoptose ou morto foram positivos tanto para a anexina-FITC e PI. Os resultados foram representados como alterações de dobragem em razões médias relativas entre as células não tratadas, em comparação com as diferentes modalidades de tratamento. Cada experimento foi realizado em triplicado.

cicatrização de feridas ensaio

O ensaio zero foi realizado para avaliar a influência do DTX e outubro na motilidade celular do cancro da próstata isoladamente e em combinação. células DU145 foram semeadas em alta densidade em placas de 6 poços e crescidas durante 24 h. O meio foi removido e substituído com meio contendo DTX e /ou outubro durante mais 24 h. As células em monocamada foram fisicamente ferido por riscar a superfície com uma ponteira (1000 mL) como uniforme e reto possível. As imagens de células que invadem o zero foram capturados em pontos de tempo indicados (0, 4, 6, 8 e 24 horas) através de microscopia de contraste de fase (IX 70 Olympus Optical Co., Alemanha). As imagens foram avaliados através da medição da diferença na área das feridas com um sistema de análise de imagens Leica (Leica, Mannheim, Alemanha) e a taxa de migração expressos como percentagem de fecho zero foi calculada como se segue:% de encerramento zero = a-b /a, em que (a) é a distância entre os bordos da ferida, e (b) é a distância que se manteve isento de células durante a migração celular para fechar a ferida. As experiências foram repetidas em poços em triplicado, pelo menos duas vezes.

A análise estatística

Os dados das experiências foram analisados ​​usando o programa SPSS 18.0 e expressos sob a forma de média ± DP. O teste t de Student de duas faces foi usada para analisar as diferenças nas experiências. O valor de p 0,05 foi considerado significativo enquanto valor de p 0,01 ou 0,001 como altamente significativa

Resultados

Propriedades apoptótica de células DU145 tratados pelo DTX sozinho, outubro sozinho e sua combinação para 48 h

no estudo inicial, foi examinado o efeito inibidor do crescimento do DTX, outubro ea combinação de-los em células cancerosas da próstata DU145. Seguindo estes agentes de tratamento, as peças de células começam a encolheu, espaçamento inter-celular tornou-se maior e a deposição de partículas citoplasmática foi observada no DTX e outubro células tratadas. Este efeito era muito mais potente no grupo de tratamento com a combinação do que nos grupos de tratamento individuais. Havia mais células de formação de espuma de flutuação e apresentaram características morfológicas de apoptose nos grupos de tratamento de combinação e o aumento na concentração de tratamento melhorou as aparências apoptóticas. FIG. 1 mostra a morfologia das células de diferentes concentrações de DTX e /ou tratamento de outubro durante 48 h. Além disso, como o tempo de tratamento progrediu, crescimento celular tornou-se lenta e houve um aumento do número de células flutuantes podem ser observadas no meio.

. células não tratadas; B. 1 nM DTX; C. 100 nM PTU; D. 10 nM DTX; E. Duas drogas combinação de 10 nM DTX e 100 nM PTU; F. 100 nM DTX. Inibição

Crescimento por DTX e outubro sozinho, respectivamente

O efeito inibidor do crescimento do DTX e outubro foi examinada, respectivamente. É óbvio que cada um dos dois agentes exibida efeito anti-proliferação em células DU145 (Fig. 2A e 2B). Ambos DTX e outubro diminuiu a proliferação celular em um tempo e forma dependente da dose. Como mostrado na Fig. 2C, em comparação com controlos não tratados, houve 14%, 31% e 43% de inibição da proliferação de células DU145 expostas a 10 nM de DTX às 24 h, 48 h e 72 h. Quanto outubro (Fig. 2D), em comparação com o controlo, o havia um 10%, 18% e 29% de inibição da proliferação de células DU145 expostas a 100 nM do fármaco às 24 h, 48 h e 72 h . Os dados mostraram que a maior citotoxicidade foi o de 72 h e IC

50 valores de DTX (Fig. 2A) e outubro (Fig. 2B) foram calculadas a partir de gráficos de proliferação de células, respectivamente. DTX exibiu uma citotoxicidade forte com o menor IC

50 com um valor de 10,784 ± 3,122 nM do que a OCT mostrou um efeito de inibição mais fraca com IC

50 sendo 2.342 ± 0,262 M.

A viabilidade celular foi determinado pelo ensaio de MTT e expressos como uma percentagem do valor de controlo (média ± SEM de três experiências efectuadas em triplicado); barras de erro = SEM (n = 6).

DTX juntamente com outubro produz inibição sinérgica do crescimento em células DU145 humanos

Para avaliar os possíveis efeitos sinérgicos de DTX-OCT combinados em o crescimento das células cancerosas, células DU145 foram expostas a diferentes concentrações de DXT e outubro combinada durante 72 h (Fig. 3B). Observou-se o efeito sinérgico do DTX e outubro sobre a proliferação de células DU145. As percentagens de inibição do crescimento celular induzida por DTX em combinação com outubro foram maiores do que cada um dos agentes isoladamente. Na concentração de 10

3 nM, outubro reduziu significativamente o valor de IC50 (P 0,05) e promoveu a apoptose (P 0,05) nas células DU145 em resposta a DTX. Como mostrado na Fig. 3A, 10 nM DXT e 10

2 nM outubro resultado de uma inibição de 39% e 14% na proliferação de células DU145, respectivamente, enquanto ambos combinados nas mesmas doses causou uma diminuição de 68% na proliferação celular em comparação com o controlo não tratado, que indicaram uma sinergia forte.

os resultados são a percentagem do valor de controlo obtido com células não tratadas (média ± SEM de três experiências efectuadas em triplicado). (**) A proliferação foi significativamente diminuída (

P

0,001); barras de erro = SEM.

VEGFA, CASP3, CASP9 e expressão de mRNA ABCB1 em células DU145

Para explorar o potencial mecanismo pelo qual DTX além outubro induz a morte celular por apoptose, a expressão de genes envolvidos no sinal apoptótico, resistência das células à DTX e angiogénese foi avaliada por RT-PCR e qRT-PCR seguinte 48 h (Fig. S3) e 72 h de tratamento. Em comparação com o controlo, 10 nM e 100 nM DTX outubro, o grupo de combinação de dois agentes diminuiu marcadamente a expressão de ARNm VEGFA (Fig. 4A) (P 0,01). Quanto CASP9 e CASP3, o nível basal de ARNm CASP9 e CASP3 foram baixos mas detectáveis ​​e a expressão de ARNm foi aumentada de forma significativa, como demonstrado na Fig. 4B e Fig. 4C (P 0,01). O nível dos dois genes de caspase expressão da proteína também foi examinada e coerente com o resultado de qRT-PCR (Fig. S4). Além disso, a expressão de ABCB1, que é reconhecido como um gene associado com resistência a drogas [22], não foi afectada nos grupos de tratamento (Fig. 4D). Estes resultados implicam que o efeito anti-tumoral de DTX em combinação com outubro pode estar envolvido na promoção de apoptose associada com elevada expressão da caspase 9 e caspase 3.

M: Marcador, foram examinados os níveis de expressão de genes objectivos por RT-PCR (a, B, C e D) e quantitativo em tempo real-PCR (B, D, F e H), respectivamente, utilizando células tratadas com os fármacos de teste durante 72 horas. O nível de expressão de cada ARNm foram normalizados para o nível de mRNA de β-actina. Os valores representam as médias ± SD de análises em triplicado (*

p Art 0,05, **

p Art 0,01).

Efeitos do DTX, outubro tratamento de combinação de dois fármacos em células DU145 sozinho e apoptose

de acordo com os resultados de qRT-PCR, os experimentos foram divididos em quatro grupos de tratamento, incluindo o controlo, DTX (10 nM), outubro (100 nM) e os grupos de combinação de duas drogas (Fig. 5). A seguir ao tratamento durante 48 h, um ensaio de apoptose foi realizada por citometria de fluxo de acordo com as instruções fornecidas no kit de anexina V-FITC /PI coloração (fig. 5A). Em contraste com o grupo de controlo, a apoptose foi induzida em ambos os grupos e DTX OCT (p 0,05). Consistente com as observações anteriores, a percentagem de células apoptóticas foi acentuadamente aumentada pela aplicação de DTX outubro mais, em comparação com DTX ou outubro tratamento sozinho (Fig. 5B). Estes resultados indicam que o tratamento de combinação melhorada morte celular apoptótica em células DU145.

Os dados são média ± SEM de duas experiências independentes realizadas em triplicado. ***

p

. 0,000 vs. controlo

Efeito do DTX, outubro sozinho e combinação de duas drogas sobre a migração das células DU145

para detectar o efeito da combinação de dois fármacos sobre a migração de células DU145, um ensaio de cicatrização da ferida foi realizada de acordo com 24 h de tratamento. Os resultados dos ensaios de cura da ferida mostraram que tanto do fármaco sozinho tem o efeito inibitório sobre a migração de células. Mas as células no grupo de combinação migrou mais lentamente do que as nos grupos de controlo não tratados (Fig. 6A) e da droga sozinha. Em comparação com o controlo, a distância migrada relativa das células da DTX, Out e DTX /Oct grupos combinados (Fig. 6B), respectivamente, foram de 76,5 ± 10,21, 53,2 ± 12,13, 79,4 ± 13,04 (P 0,05). As células incubadas no grupo de controlo migrado através de uma área que foi marcadamente maior do que aquela das células incubadas no grupo combinado com a droga, indicando que o DTX em combinação com outubro inibiu a migração das células DU145

.

( a) Wound healing ensaio para determinar o efeito dos fármacos indicados em células DU145 migração. (B) A razão de migração resumidos (%), após 72 h de tratamento medida por ensaio de cicatrização da ferida. Cada coluna representa a média ± SEM. **

p

. 0,01, vs. controlo

Discussão

quimioterapia à base de segmentação microtúbulos é o método mais utilizado no tratamento de câncer de próstata [23]. No entanto, o tratamento de longo prazo geralmente resulta em efeitos secundários e resistência à quimioterapia, normalmente contribuir para os resultados clínicos variáveis ​​entre os pacientes com tipos de tumores aparentemente semelhantes. Em uma tentativa de superar a resistência aos medicamentos, decidimos investigar as concentrações eficazes citotóxicos e apoptóticos da microtúbulos de metas de droga docetaxel (DTX) e octreotide somatostatina analógico (OCT) e seu efeito sinérgico dos dois fármacos na linha de células de câncer de próstata resistente à castração DU145.

neste estudo, avaliou-se o efeito combinado do DTX e outubro contra o câncer de próstata DU145 e células PC3 (Fig. S1). A combinação de DTX com outubro induziu uma maior redução da viabilidade celular do que qualquer agente sozinho. Outubro reduziu o IC

50 valor de DTX em DU145 e PC3 células de uma forma dependente da dose, inibiu a proliferação de células de PCA (Fig. S2), aumento da sensibilidade DTX, citotóxica celular e apoptose. Embora nós descobriram que as células PC3 mostrou mais sensível aos DTX do que as células DU145 que consistentes com o estudo in vivo (Fig. S5). Estes resultados sugerem que outubro sinergicamente potencia a eficácia de agentes de direccionamento de microtúbulos em células CaP in vitro. Estes consistente com o estudo recente realizado por Lattanzio et al. docetaxel combinado com octreotide sinergicamente aumentada o efeito de tratamento combinado em uma linha de células PC-3 particularmente o docetaxel-resistente [24]. No entanto, verificou-se qualquer um dos dois fármacos por si só estimula a proliferação de células DU145 em uma concentração mais baixa de DTX 1 nM ou outubro. 10 nM, respectivamente, o que não foi observado no grupo combinado

O anti-proliferativa efeito de DTX e outubro pode ser devido ou a necrose celular ou apoptose celular. Portanto, nós investigamos o efeito apoptótica de DTX, outubro sozinho e seu tratamento de combinação em células DU145. Os resultados mostraram que a combinação de DTX com outubro diminuiu a viabilidade celular e aumentar a actividade de caspase 9/3 para uma extensão maior do que qualquer dos agentes sozinho único de uma forma dependente do tempo (Fig. S4). Em comparação com o controlo não há aumento óbvio na expressão da caspase 3 em particular nos grupos sozinhos e de dois fármacos de tratamento combinado PTU. Isto é consistente com o relatório mostrou que outubro aumentou a expressão da caspase 3 mRNA e a apoptose celular induzida em células HepG2 [18]. Foi indicado que programa apoptótico de morte celular foi disparado por activação do iniciador de caspase-8, induzindo a permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP), fragmentação mitocondrial, e em última análise, a activação das proteases jusante caspase-9 e -3. MOMP induzida a saída do citocromo c, a formação de apoptossomo e, finalmente, a activação de caspase-9 [25]. No presente estudo, a caspase 9 actividade foi significativamente aumentado após tratamento das células DU145 após a combinação de DTX e outubro de tratamento, que implica a indução de fragmentação de MOMP e mitocondrial, o que resulta na activação da apoptose observada na linha celular DU145.

sinalização de VEGF promove a angiogénese através da estimulação da formação de células de proliferação, migração e tubo endotelial vascular e aumenta significativamente a permeabilidade vascular [26]. A família VEGF inclui cinco membros, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e do factor de crescimento placentário (PIGF) e VEGF-A é conhecida pelas suas funções-chave na angiogénese tumoral relacionada com o [27]. Por isso, nós investigamos o efeito de outubro, DTX e a combinação das duas drogas na expressão VEGFA em células DU145. Estudos mostraram que a combinação de outubro DTX e exercer um grande efeito inibidor na expressão de ARNm de VEGFA mas teve um efeito moderado por DTX tratamento sozinho. Reportar demonstraram que a expressão de VEGF foi significativamente suprimida em células de glioma de outubro dose-dependente. No entanto, outubro teve pouco efeito no microambiente da produção de VEGF induzida por hipoxia in vivo [28].

No presente estudo, demonstrou uma redução significativa na migração celular in vitro após exposição ao tratamento da combinação de dois fármacos . Estudos sugerem que o DTX em combinação com outubro DU145 inibe a proliferação ou migração através da inibição da libertação do péptido VEGFA e subsequentemente resulta na inibição da migração celular. Estudos relataram que o aumento da interacção de VEGF /VEGFR aumenta a migração de células de cancro do cólon [29]. No entanto, alguns resultados inconsistentes de estudo foram descobertos. Por exemplo, no modelo de lesão hepática isquémica e reperfusão, outubro mostraram o efeito inibitório sobre a apoptose e dano hepatocelular hepatócitos atenuada causada por reperfusão isquémica-[30]. aplicação de curto prazo de outubro poderia induzir outubro receptor SSTR2 dessensibilização e internalização, que inibiu o efeito apoptótica de outubro em células de câncer de fígado [31]. Estes resultados contrários pode ser devido às diferentes características celulares, microambiente celular, expressão de receptores e a concentração de outubro de tratamento.

É relatado que ABCB1 é expresso em mais de cinquenta por cento dos cancros resistentes a fármacos e reconhecido como um mecanismo de resistência principal subjacente droga [32]. expressão ABCB1 foi regulado para cima após a quimioterapia em vários tumores como uma resposta ao estresse generalizado [33], [34]. Em nosso estudo não foi observada diferença significativa entre os vários grupos tratados com DTX combinado e outubro, cada agente único sozinho e o controle untreatment. Alta expressão do gene ABCB1 antes e após tratamento destes medicamentos indica uma linha celular DTX e /ou do PTU resistentes aos medicamentos de células DU145 câncer de próstata, que tem sido observado em nosso estudo anterior modelo do rato xenoenxerto in vivo (dados não publicados).

Estes dados sugerem que o tratamento combinado de DTX e outubro de células DU145 e PC3 exercida uma maior inibição da proliferação de células tumorais e a apoptose induzida acentuadamente, o que pode estar relacionado com o aumento da regulação da actividade da caspase 9/3 e a diminuição da expressão de VEGFA in vitro. Embora nossos resultados precisam ser estendido a modelos in vivo em estudos futuros, eles levantam a possibilidade intrigante de que a segmentação microtúbulos com um taxano combinado um análogo de somatostatina pode ser uma abordagem útil para melhorar os resultados no cancro da próstata.

Informações de Suporte

Figura S1.

Efeito da DTX sozinho, o efeito sinérgico de DTX em combinação com 100 nM de outubro sobre a proliferação de células PC3 seguinte 48 h (A) e 72 h (B) do tratamento. Os resultados são a percentagem do valor de controlo obtido com células não tratadas (média ± SEM de três experiências efectuadas em triplicado). (**) A proliferação foi significativamente diminuída (

P

0,001); barras de erro = SEM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s001

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Figura S2.

Efeito sinérgico da DTX em combinação com outubro sobre a proliferação de células DU145 seguinte 48 h de tratamento. Os resultados são a percentagem do valor de controlo obtido com células não tratadas (média ± SEM de três experiências efectuadas em triplicado). (**) A proliferação foi significativamente diminuída (

P

0,001); barras de erro = SEM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s002

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Figura S3.

Efeitos da DTX sozinho, outubro sozinho e a combinação de DTX /outubro sobre a expressão de VEGFA, a caspase 9, caspase 3 e ABCB1 em células DU145 por qRT-PCR respectivamente, utilizando células após 48 h de tratamento. O nível de expressão de cada ARNm foram normalizados para o nível de β-actina. Os valores representam as médias ± SD de análises em triplicado (*

p Art 0,05, **

p Art 0,01)

doi: 10.1371 /journal.pone.0091817.s003.

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Figura S4.

Detecção de caspase 3, caspase 9 e expressão em células DU145 por Western blot (A). Os resultados mostram que os níveis significativamente aumentados de caspase 3 e caspase 9 expressão em DTX sozinho e em combinação com outubro seguintes 48 h de tratamento. Análise (B) densitométrica foi realizada usando software de análise de imagem Kodak unidimensional. (P 0,01)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s004

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Figura S5.

curvas de crescimento de PC3 de xenoenxerto de cancro da próstata (A) e DU145 (B) em murganhos de controlo, murganhos e ratos castrados tratados com docetaxel, incluindo dois grupos de 10 mg /kg e 20 mg /kg de tratamento com docetaxel. medição do tumor começa a partir do tratamento de fármaco (p 0,015). (N = 5)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s005

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