Abstract

Fundo

A regulação dos genes que codificam transportadores de nucleosídeos e metabolismo de fármacos responsáveis ​​pela captação e metabólico activação da gemcitabina nucleósido está relacionada com a resistência adquirida do tumor contra este agente. Hidralazina foi mostrado para inverter a resistência a doxorrubicina no modelo de cancro da mama. Aqui nós queríamos investigar se mecanismos epigenéticos são responsáveis ​​pela aquisição de resistência à gemcitabina e se hidralazina pode restaurar a sensibilidade gemcitabina em células de cancro do colo do útero.

Metodologia /Principais Achados

A célula Calo linha de células de câncer cervical a linha foi cultivada na presença de concentrações crescentes de gemcitabina. Down-regulação da

hENT1 Art

DCK

genes foi observado nas células resistentes (CaLoGR) que não estava associada com metilação do promotor. O tratamento com hidralazina inverteu a resistência gemcitabina e levou a

hENT1

e

dCK

reativação do gene de uma forma independente de metilação do promotor DNA. Não foram observadas alterações na actividade total de HDAC nem em H3 e H4 acetilação nestes promotores. análise ChIP mostrou H3K9m2 em

hENT1

e

DCK

promotores de genes que se correlacionou com hiper-expressão de G9A histona metiltransferase em RNA e nível de proteína nas células resistentes. Hydralazine inibiu a atividade metiltransferase G9A in vitro e exaustão do gene G9A por iRNA restaurado sensibilidade gemcitabina.

Conclusões /Significado

Nossos resultados demonstram que a resistência adquirida gemcitabina está associada com o promotor de metilação do DNA independente

hENT1

e

dCK

gene down-regulação e hiper-expressão da metiltransferase G9A. Hydralazine reverte a resistência gemcitabina em células de cancro do colo do útero através da inibição da metiltransferase G9A histona

Citation:. Candelaria M, de la Cruz-Hernandez E, Taja-Chayeb L, Perez-Cardenas E, Trejo-Becerril C, Gonzalez Fierro A, et al. Reversão (2012) DNA metilação-Independente da Resistência gemcitabina por Hydralazine em células de câncer cervical. PLoS ONE 7 (3): e29181. doi: 10.1371 /journal.pone.0029181

editor: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de fevereiro de 2011; Aceito: 22 de novembro de 2011; Publicação: 12 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Myrna et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pela Psicofarma SA de CV Os financiadores não tiveram um papel importante na recolha de dados, mas não no desenho do estudo, análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

CONFLITO DE INTERESSES:. ADG recebeu consultoria pagos a partir Psicofarma S.A. de C.V. para outros que não os relacionados a esta pesquisa assuntos. Instituição do autor (Universidade Nacional Autônoma do México) tem pedidos de patentes relativos a hidralazina. Isto não altera ‘adesão a todas as PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A gemcitabina (2′ os autores, 2’desoxicitidina 2′-difluoro, dFdC) é uma analógicos de arabinósido de citosina, que possui propriedades farmacológicas distintas e actividade anti-tumoral-espectro largo. A gemcitabina tem actividade clínica significativa contra várias condições malignas, incluindo pâncreas, do pulmão, da bexiga, da mama, do ovário e da cabeça e pescoço [1], [2]. Em gemcitabina câncer cervical mais cisplatina e radioterapia melhora os resultados de sobrevivência em comparação com a radiação cisplatina na doença avançada e, quando utilizado com cisplatina é tão eficaz como outros dobletes cisplatina contra o câncer cervical metastático [3].

características farmacológicas da gemcitabina são únicas no que as duas classes principais de genes que são essenciais para os seus efeitos anti-tumorais e resistência: genes transportadores de membrana de codificação de proteínas, cujos produtos são responsáveis ​​pela absorção intracelular de droga, e de drogas genes codificadores de metabolismo, que catalisam a sua activação e inactivação [4]. Assim, a expressão destes genes é essencial para a resposta do tumor e resistência a gemcitabina. A maioria captação intracelular de gemcitabina é mediada por hENT1 (Equilibrative nucleosídeos Human Transporter 1). A sensibilidade aos análogos de nucleósidos incluindo a gemcitabina

In vitro

e no ambiente clínico foi mostrado para correlacionar com a expressão deste transportador enquanto que as células deficientes em hENT1 são altamente resistentes a este nucleósido [5] – [8]. Pacientes com câncer de pâncreas e de pulmão expressando hENT1 têm maiores taxas de resposta e maior sobrevida média após gemcitabina que os indivíduos com hENT1 baixos ou ausentes [9], [10]. Em relação aos genes do metabolismo gemcitabina,

dCK

expressão tem sido associada a sensibilidade gemcitabina. As linhas celulares seleccionadas para resistência a nucleósidos análogos têm demonstrado inactivação mutacional de

dCK

e

dCK

resultados de transfecção na ressensibilização de células de Ara-C e gemcitabina [11] – [12]. Em pacientes com câncer de menor expressão de dCK está associado com menor sobrevida global [13], [14]. Por outro lado, gemcitabina diphosphorylated é um inibidor da ribonucleótido-redutase, uma enzima heterotetramérica composto por dois homodímeros (RRM1 e RMM2) que é a chave na síntese de trifosfato de desoxinucleótido intracelular [15]. A sobre-expressão de RRM1 RRM2 e tem sido associada com a resistência à gemcitabina em linhas celulares de cancro NSCLC e [16], [17]. citidina desaminase (CDA) catalisa a desaminação da citidina, dexoycytidine, e seus análogos, tais como gemcitabina no entanto, o seu papel de mediador resistência gemcitabina é controverso [18]. Estes dados sugerem claramente que a diminuição ou falta de expressão de dCK hENT1 e são cruciais para a resistência gemcitabina, no entanto, os mecanismos que conduzem ao seu silenciamento transcricional ainda não foram definidos. Estudos anteriores mostraram que a metilação em

gene dCK

é responsável pelo seu silenciamento [19] no entanto; este continua a ser demonstrado para o

hENT1

Hydralazine é um agente de DNA demetilante pequena molécula [20] Sabe-desmetilar promotores de genes e para induzir a reactivação gene in vitro [21] -. [ ,,,0],24] e in vivo [25]. Utilizado em combinação com o ácido valpróico inibidor da histona desacetilase reactiva a expressão de genes em doentes com cancro [26] – [28]. Além disso, hidralazina foi mostrado para inverter a resistência a doxorrubicina no modelo de cancro da mama [29]. Como a maioria dos trabalhos sobre a resistência gemcitabina tem sido feito em linhas e células de câncer pancreático, esta droga tem sido extensivamente avaliado em câncer cervical [30] queríamos investigar se mecanismos epigenéticos são responsáveis ​​pela aquisição de resistência a esse agente e, se hidralazina poderia restaurar sensibilidade gemcitabina em células de cancro do colo do útero. Nossos resultados demonstram que, neste modelo, hidralazina inverte resistência gemcitabina de uma forma independente de metilação do DNA.

Resultados

linhas celulares de cancro do colo do útero foram examinados para a expressão basal de

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

genes e, em seguida, foi avaliada a sua sensibilidade a gemcitabina. A IC

50 na linha de células SiHa era 1,000? M, e foi arbitrariamente considerada como resistente principal. A IC

50 para as outras linhas celulares foram: 3,3 uM, 0,3 uM e 0,1 uM para Calo, células HeLa e células C33A, respectivamente (Figura 1A). Como mostrado na figura 1B, a expressão basal dos genes que codificam para o transporte de gemcitabina e metabolismo, que foram ajustadas para actina e em referência ao colo normal, variou entre as linhas de células e uma relação entre os níveis destes genes com o estado de sensibilidade intrínseca /resistência a gemcitabina nestas linhas celulares não foi encontrado.

a. O IC

50 de gemcitabina para HeLa, Calo, SiHa e células C33A foram 3,3 mM, 0,3 mM, 1000 um e 0,1 mM, respectivamente, como avaliada com o ensaio de cristal violeta. expressão B. Basal de

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

genes avaliada por RT- PCR. Não houve correlação entre a CI

50 e o estado de sensibilidade /resistência intrínseca. Expressão foi ajustado para a expressão no colo normal.

Para investigar se a indução de resistência gemcitabina está relacionado a mudanças na expressão de

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

genes, células Calo foram expostos a concentrações crescentes de gemcitabina e uma vez que as células se tornaram resistentes que foram tratados com hidralazina em diferentes épocas e concentrações . A Figura 2A mostra que após cinco semanas, as células Calo adquiriram resistência ao antimetabolito e eram capazes de crescer a 927 uM de gemcitabina (concentração 280 vezes). O estado de resistência foi acompanhada por regulação negativa por metade do

hENT1

e

dCK

.

RRM1

e

RRM2

genes tiveram mudanças menores, enquanto que

CDA

também foi reduzida (Figura 2B). Além disso, a Figura 2C mostra que a regulação para baixo dos

hENT1

e

DCK

genes ocorreu progressivamente à medida que a resistência desenvolvida. O tratamento de células com CaLoGR hidralazina em 2 uM durante 10 dias, 10 uM e 30 uM, durante 5 dias foi capaz de reverter a resistência a gemcitabina como mostrado na Figura 2D. O correspondente IC

50s para estes tratamentos foram de 1,7 mM, 2,7 mM e 6,6 mM, respectivamente.

A. Após a aquisição de resistência a gemcitabina, o IC

50 em células CaLoGR foi de 927 uM (concentração 280 vezes). B. Expressão de

hENT1

,

dCK

e

CDA

foram reduzidos quase pela metade, RRM1 e RRM2 teve pequenas alterações. C. A redução da

hENT1

e

DCK

genes ocorreu progressivamente à medida que a resistência desenvolvida. D. Tratamento de células com CaLoGR hidralazina em 2 uM durante 10 dias, 10 uM e 30 uM, durante 5 dias reverteu a resistência gemcitabina. Os correspondentes IC

50s para estes tratamentos foram de 1,7 uM, 2,7 uM e 6,6 uM, respectivamente.

Para determinar se a reversão da resistência de hidralazina, a qual é um agente de desmetilação de ADN fraco é acompanhada pela alterações na expressão de

hENT1

e

dCK

genes, uma RT-PCR destes dois genes foi realizada. Os resultados na Figura 3A mostra que o esperado como hidralazina conduzido para a re-expressão destes genes nas três condições de tratamento avaliados. a hipermetilação do promotor de ADN foi mostrado para silenciar genes em modelos de resistência à quimioterapia, por conseguinte, o estado de metilação em destes promotores foi avaliada por MSP. Curiosamente,

hENT1

e

dCK

promotores foram parcialmente metilado mesmo no estado basal e não mostrou hipermetilação na linha de células CaLoGR resistentes. Hidralazina a 2 pM, 10 pM ou 30 pM falhou para desmetilar estes promotores como mostrado por MSP na Figura 3B. Para confirmar esta conclusão, seis clones independentes (basal, resistentes e resistentes tratados com hidralazina) foram sequenciados bissulfito, mas não foi observada em desmetilação o CpG avaliados (Fig. 3C). Por conseguinte, a reactivação do gene era independente do seu efeito desmetilante, sugerindo que outros mecanismos epigenética poderia ser responsável para regular para baixo e reactivar destes genes neste modelo. Para confirmar que a falta de efeito demetilante da hidralazina em cima

dCK

e

hENT1

não foi devido à sua capacidade demetilante fraco, figura 3D mostra que, na mesma linha de células e condições, o gene

DAPK

foi desmetilado com hidralazina a 2 mM 10 mM e 30 mM.

a. Hidralazina nas três condições testadas (2? M, durante 10 dias, 10 uM e 30 uM, durante 5 dias) restabeleceu a expressão destes genes. B.

hENT1

,

DCK

genes foram parcialmente metilado basally e metilação do promotor não se alterou nas células resistentes nem após o tratamento hidralazina avaliada pelo MSP. C. Mapas dos promotores nesses genes que mostram a CpG ilhas densidade e distribuição, bem como as posições dos iniciadores para MSP, chip e sequenciamento. Ele também é indicado pelo sequenciamento que a metilação CpG não se alterou em

dCK

e

hENT1

genes nem nas células resistentes nem quando tratados com hidralazina. círculos vazios e cheios representam desmetilado e CpGs metilados em cinco sequencences independentes. D. hidralazina foi capaz de desmetilar o

DAPK

promotor na linha de células de calo.

Um aumento da actividade da histona desacetilase foi mostrado para induzir o silenciamento do gene em alguns modelos. Para determinar se este fenómeno participa na resistência gemcitabina em cancro do colo do útero, a actividade de desacetilase foi medida em células Calo usando um kit que contém o protótipo de HDAC inibidor tricostatina A como um controlo positivo. A Figura 4A mostra que não se observaram alterações na actividade de HDAC; na verdade, uma pequena diminuição na actividade de desacetilase foi observada nas células resistentes. A avaliação da acetilação total a H3 e H4 em

hENT1

e

DCK

promotores de genes por ensaios chip, enquanto mostraram uma diminuição na H3 e H4 acetilação no

promotor hENT1

, observou-se um ligeiro aumento da acetilação de H3 na

dCK

promotor e nenhuma mudança para H4 acetilação (Figura 4B). Estes resultados aparentemente opostas argumentar contra um papel importante de H3 e H4 acetilação para explicar o silenciamento desses genes por esta modificação da histona. Além disso, o tratamento com ácido valpróico a 1 mM durante 5 dias falharam para reactivar a expressão destes genes e para inverter a resistência a gemcitabina (não mostrado).

. A actividade total da histona deacetilase não mostraram alterações importantes entre basais e células resistentes, na verdade, um pequeno decréscimo foi observado nas células resistentes avaliada com um kit de actividade HDAC. acetilação B. total de H3 e H4 como avaliado por Chip mostraram uma diminuição na H3 e H4 acetilação no

hENT1

promotor, um ligeiro aumento da acetilação de H3 e não mudar em H4 em

dCK

promotor.

Para obter mais conhecimentos sobre os mecanismos epigenéticos de

hENT1

e

dCK

silenciamento neste modelo de resistência gemcitabina, histonas metilação foi ensaiada. Metilação do H3K9 é uma marca repressiva conhecida enquanto metilação na H3K4 está ativando, portanto, a metilação nestes lisinas foi avaliada por análise chip no estado basal, em células resistentes e após o tratamento hidralazina. A Figura 5 mostra que para a

gene hENT1

, não foram observadas alterações na metilação H3K4me3 mas H3K9me2 levemente aumentada nas células resistentes e diminuiu após o tratamento hidralazina. Em relação ao gene

dCK observou-se uma ligeira redução no H3K4me3 nas células resistentes que não foi modificado por hidralazina. No entanto, a metilação em H3K9me2 levemente aumentada nas células resistentes e depois reduzida a hidralazina. As alterações na intensidade da banda foram normalizados contra a sua respectiva intensidade de entrada. Como o agente de desmetilação de ADN 5-aza-CdR tem demonstrado diminuir H3K9me2, utilizou-se o programa MetaDrug ™ para descobrir se hidralazina pode estar envolvido na regulação da metilação H3K9. Como mostrado na Figura 6, hidralazina podem afectar não apenas da metilação do DNA em citosina, mas também podem estar envolvidos na regulação negativa de metilação H3K9. Para confirmar essas previsões a expressão de mRNA de

G9A

foi avaliada em células Calo por qPCR. Os resultados mostram que a expressão deste gene aumentou nas células resistentes ao passo que diminuiu a sua hidralazina nível (Figura 7A). Resultados semelhantes foram obtidos por Western blot, a proteína G9A aumentada nas células resistentes e diminuíram após o tratamento hidralazina (Figura 7B). Para investigar mais a capacidade inibitória G9A da hidralazina, uma metiltransferase H3K9

in vitro

ensaio de inibição foi realizada utilizando o

EpiQuik

™ histona metiltransferase Activity /Inibição Assay Kit (H3-K9). Hidralazina a 2 uM e 10 uM reduziu fortemente metilação H3K9 (Figura 7C). Para confirmar a significância biológica deste facto in vitro, nocaute do gene G9A por meio de um ensaio de iARN revelou que as células Calo transfectadas recuperou sensibilidade a hidralazina, a qual não foi ainda modificado quando estas células foram também tratadas com hidralazina (Fig. 8).

Para

gene hENT1

, não foram observadas alterações na metilação H3K4m3 mas H3K9me2 levemente aumentada nas células resistentes e diminuiu após o tratamento hidralazina. Em

gene dCK

houve uma ligeira redução na H3K4me3 nas células resistentes que não foi modificado por hidralazina. A metilação na H3K9me2 levemente aumentada nas células resistentes e depois reduzida a hidralazina. As mudanças na intensidade da banda foram normalizados contra suas respectivas entradas.

MetaDrug ™ programa previu que a hidralazina pode afetar não só a metilação do DNA em citosina, mas também podem estar envolvidos na regulação negativa da metilação H3K9.

A. RT-PCR quantitativa de

G9A

mostra que as células CaLoGR resistentes apresentaram um aumento em relação ao basal e que a hidralazina reduz a sua expressão (basal vs resistente, p 0,05). B. Ao nível da proteína, houve um aumento na G9A nas células resistentes que diminuíram após o tratamento hidralazina. C. H3K9 metiltransferase

in vitro

ensaio de inibição. Hydralazine a 2 mM e 10 mM fortemente reduzida metilação H3K9 (sem tratamento vs hidralazina, p 0,05)

A.. concentração inibitória de gemcitabina em células Calo não alcançado. B. Esgotamento de G9A restaurado sensibilidade gemcitabina (IC

50 10,3 mM). C. Sem mais alterações no IC

50 foram vistos quando hidralazina foi adicionada às células G9A esgotado. D. qPCR de G9A confirmando o esgotamento parcial de

G9A

messenger.

Discussão

Os resultados deste estudo da resistência gemcitabina em células de câncer cervical e sua reversão com o agente de desmetilação de ADN fraco hidralazina mostram que o desenvolvimento da resistência é acompanhada por sub-regulação de genes-chave para a absorção de gemcitabina e metabolismo intracelular,

hENT1

e

dCK

. Curiosamente, esta sub-regulação não foi devido à hipermetilação do gene promotor, como demonstrado por sequenciação de MSP e bissulfito; no entanto, hidralazina foi capaz de reativar sua expressão e para reverter a resistência gemcitabina. Estes dados sugerem que outros mecanismos epigenética operar para silenciar genes de resistência a quimioterapia e a hidralazina que tem efeitos independentes de metilação do DNA, muito provavelmente através de afectar negativamente a regulação da metilação H3K9 como previsto pelo programa MetaDrug ™.

Estes resultados são importante para ganhar mais conhecimento sobre os mecanismos de resistência a quimioterapia droga. Gene inativação por metilação do DNA foi o primeiro mecanismo epigenético mostrado para ser diretamente envolvidos na aquisição de resistência à quimioterapia em

in vitro

modelos [31], [32] no entanto, como o conhecimento sobre os processos epigenéticos evoluiu, o participação dos outros jogadores epigenética, tais como histona-desacetilases ambos zinco e-NAD-dependentes, bem como das histonas metiltransferases, desmetilases microARNs histonas e no processo de inactivação dos genes envolvidos na sensibilidade quimioterapia e resistência foi descoberto [33] – [38]. Nossos resultados sugerem fortemente que neste modelo de resistência gemcitabina no cancro do colo do útero, a metilação em H3K9 poderia ser o principal mecanismo para silenciar a expressão de

hENT1

e

dCK

genes que abre o caminho para uma maior testando a participação dessa modificação da histona em outros modelos de resistência à quimioterapia. A relevância deste achado aumenta à medida que os inibidores de metiltransferases G9A histonas estão a ser disponível para o estudo [39].

Os primeiros estudos mostraram que os inibidores de metilação do DNA induzida

dCK

re-expressão na CEM células /dCK- [19] e que a ausência de expressão deste gene chave para a activação de vários análogos de nucleósido, incluindo gemcitabina ocorre por metilação do promotor [40] – [43]. Até agora, nenhum outro mecanismo para silenciar epigenética este gene tenha sido descrita em modelos de resistência à quimioterapia. Da mesma forma, a falta de expressão ou baixos níveis de hENT1 se correlacionam fortemente com a resistência a gemcitabina e outros análogos de nucleósidos [6], [9], [10], [44]. Embora vários transportadores de membrana de codificação de genes, tais como hOAT3 (SLC22A8), a família transportadora de soluto 5 iodidetransporter (SLC5A8), o transportador de folato reduzido (RFC), a proteína de ligação ao retinol celular 1, e o humano de Na + /I-simportador são conhecidos a ser regulada negativamente por metilação do DNA e reativado por inibidores de DNA metiltransferase [45] – [49], aqui não foram capazes de demonstrar que a metilação do promotor em

hENT1

responsável por sua regulação negativa observada, mas sua reativação foi alcançado por hidralazina através de um mecanismo de metilação do DNA independente sugerindo que de fato

hENT1

é regulada negativamente por um efeito epigenético mais provável através G9A histona mediada por metiltransferase metilação H3K9.

Apesar de que ambos os genes contêm ilhas CpG os seus promotores [50], [51], e que, pelo menos, para o

gene dCK

tem consistentemente sido demonstrado que o seu promotor é metilado em células resistentes a [19], no nosso modelo não existe uma correlação entre a metilação do promotor de expressão e estes promotores. No entanto, o efeito demetilante em outros genes (

DAPK

) foi comprovada, descartando que a hidralazina não tem efeito demetilante. Estes dados levaram-nos a procurar outros mecanismos epigenéticos que poderiam ser responsáveis ​​para o silenciamento do gene. Não ocorreram alterações consistentes na histona desacetilase nem na acetilação de histonas nestes promotores de genes foram observados para afastar esta modificação da histona como um mecanismo de silenciamento de genes para estas neste modelo. Como o inibidor da metiltransferase de ADN 5-aza-CdR decitabina podem apresentar mecanismos de acção alternativos para a metilação do DNA no que se refere à reactivação da transcrição, tais como desmetilação histona H3K9 nas regiões reguladoras dos genes silenciados [52] Foi realizada uma pesquisa no programa MetaDrug ™ para obter pistas para outros efeitos possíveis de hidralazina. Os nossos resultados mostraram que, de facto hidralazina é predito para ser envolvida na regulação negativa da metilação H3K9. Este resultado levou-nos a analisar por análise de chip para mudanças no H3K9me2, tanto a

dCK

e

hENT1

promotores nas células CaLoGR. Ambos os promotores contido H3K9me2 em células não tratadas, aumentaram ligeiramente no estado resistente, e esta marca silenciador foi parcialmente aliviada pela hidralazina. Devemos no entanto, salientar que essas mudanças embora em H3K9m2 embora consistentes em três ensaios separados, foram leves que pode ser explicado com base em que, pelo menos, oito metiltransferases histonas incluindo G9A também têm H3K9 como seu alvo de metilação [52].

para confirmar ainda mais a conclusão, uma RT-PCR quantitativa mostrou que a expressão de G9A foi aumentada nas células resistentes, em comparação com células sensíveis e níveis fez diminuir após o tratamento com hidralazina. No entanto, uma redução dramática no nível de proteína desta metiltransferase histona foi observada por Western Blot nas células resistentes após tratamento hidralazina. Notável, estes resultados são muito semelhantes aos encontrados com 5-aza-CdR em um modelo de cancro da mama de maspina re-expressão em que as reduções nos níveis de proteína metiltransferase G9A histonas não são devidos a efeitos sobre a expressão do gene G9A [53]. Suporte adicional para este efeito de hidralazina foi obtida por um ensaio in vitro de exibição H3K9 metilação que hidralazina inibe a actividade deste metiltransferase histona. O significado biológico destas observações foi comprovada por mostrando que empobrecem G9A nas células Calo resistente levado a recuperar sensibilidade a gemcitabina por estas células e que a maior sensibilidade a gemcitabina não foi conseguida pela adição de hidralazina às células G9A empobrecido que argumentam contra um

off-alvo

efeito da hidralazina.

de nota, o programa MetaDrug ™ também indicou que a hidralazina pode agir positivamente na regulação da metilação H3K4 que não foi observado em nosso estudo, no entanto, dados recentes do nosso grupo indicam que, em vários célula cancerosa tratamento linhas com ácido hidralazina e valpróico levou à sobre-expressão de MIC a e MIC B ligantes que foi acompanhada por um aumento da metilação H3K4 nestes promotores de genes, sugerindo que a hidralazina poderia ter este efeito sobre esta marca histona [54].

de qualquer resistência aos medicamentos intrínseca ou adquirida é um fenômeno complexo e pleiotropic e outros potenciais jogadores que participam na resistência gemcitabina neste modelo não foram investigados neste estudo. Para instâncias, apesar

RRM1

e

RRM2

sobre a expressão tem sido relacionada à resistência aos medicamentos [55] sem grandes mudanças foram observadas nestes genes neste estudo. Paradoxalmente, gene CD foi regulada negativamente nas células resistentes, apesar da sua sobre-expressão tem sido consistentemente mostrado relacionada com a resistência à gemcitabina e outros análogos de nucleosídeos [56]. Esta constatação enfatiza ainda mais a complexidade da resistência às drogas que parece ser gene e modelo específico de célula.

Os resultados deste estudo são de potencial relevância clínica, pelo menos, para este modelo de resistência aos medicamentos. A gemcitabina é frequentemente usado para o cancro do colo do útero quer em paralelo à radiação ou em combinação com a cisplatina para estágios avançados [3]. Adquiriu resistência a esta droga pode ser responsável pela falha do tratamento; portanto, hidralazina pode prevenir a resistência e, potencialmente, aumentar a eficácia da gemcitabina. Além disso, a descoberta de que a metilação H3K9 pode levar à resistência à quimioterapia merece o seu teste em outros modelos experimentais.

Materiais e Métodos

cultura celular

As linhas celulares de cancro do colo do útero HeLa , SiHa e C33A foram obtidas a partir da ATCC. A linha de células Calo foi um gentilmente doado pelo Dr. Monroy-Garcia [57]. As linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C em atmosfera humidificada contendo 5% de C0

2 em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (Gibco, Grand Island, NY).

Os ensaios de citotoxicidade

As células foram semeadas em 6-se placas de microtitulação de Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) em 2 × 10

3 células /cavidade em 0,2 ml de meio completo e depois tratou-se durante 24 horas com gemcitabina em concentrações que variam de 1 × 10

-8 M para 1 × 10

-4 M. em seguida, o meio contendo a gemcitabina foi removido e foi adicionado meio fresco. Após 72 h o meio foi aspirado e substituído por 10 minutos com 50 mL de 0,75% de violeta cristal em 50% de etanol, 0,25% de NaCl, e solução de formaldeído a 1,75%. As células foram então lavadas com água, secas ao ar e o corante eluída com solução de PBS + 1% de sulfato de duodecyl de sódio (SDS). A viabilidade celular foi avaliada pela absorvência do corante foi medida a 570 nm num leitor automático de ELISA. Todos os ensaios foram realizados em triplicado. O efeito citotóxico de cada tratamento foi expressa como uma percentagem de viabilidade celular relativa às células de controlo não tratadas (percentagem de controlo) e é definida como [

570 nm tratada células /

570 células nm A um não-tratada] × 100.

a indução de resistência gemcitabina e tratamento hidralazina

linha de células de calo foi cultivada a 37 ° C em atmosfera humidificada contendo 5% de C0

2 em DMEM suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (Gibco, Grand Island, NY). O aumento das doses de gemcitabina (IC

30, IC

50, IC

80 e, finalmente, dois degraus de IC

90 foram adicionados semanalmente para induzir resistência gemcitabina. Depois de adicionar IC

90 duas vezes, o ensaio citotóxico foi repetido para confirmar a resistência gemcitabina.

células Calo resistente induzida por gemcitabina (CaLoGR), foram cultivadas a 37 ° C em atmosfera humidificada contendo 5% de C0

2 em DMEM suplementado com 10% de vitelo fetal de soro (Gibco, Grand Island, NY). a partir daí, hidralazina foi adicionado a 10 uM e 30 uM, durante 5 dias e 2 uM durante 10 dias. o meio contendo o fármaco foi reabastecido diariamente.

RT-PCR

o ARN foi isolado a partir de linhas celulares por métodos padrão. em seguida 5 g de RNA foram tratadas com DNase. a transcrição reversa foi realizada utilizando o kit de PCR de ARN de gene Núcleo Amp

R (Applied Biosystems Roche) seguindo as recomendações do provedor .

GAPDH

,

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

genes eram amplificado utilizando os iniciadores de oligonucleótido seguinte:

GAPDH

: S: 5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3 ‘, aS: 5′-ATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3’

hENT1

: S: 5’GCAAAGGAGAGGAGCCAAGA-3 ‘ , AS: 5’CCCAACCAGTCAAAGATATTG-3 ‘

dCK

: S: 5′-CGATCTGTGTATAGTGACAG-3′, AS: 5’GTTGGTTTTCAGTGTCCTATG-3 ‘,

RRM1

: S: 5′-GCAGCTGAGAGAGGTGCTTT -3 ‘, AS: 5′-CAGGATCCACACATCAGACA-3′, RRM2: S: 5’-GAGTTCCTCACTGAGGCC-3 ‘, AS: 5′-TTAGAAGTCAGCATCCAAG-3’,

CDA

: S: 5 ‘GTTGCCTTGTTCCCT TGTAA -3 ‘, AS: 5′-TCTTGCTGCACTTCGGTATG-3’. A PCR foi realizada num volume total de 25 ul contendo ADNc, 20 pmoles de iniciadores, 200 uM de dNTP, 0,25 U de Taq polimerase, e 1 × tampão fornecido pelo fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os PCRs foram iniciadas por um passo de desnaturação a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 35 seg, 59 ° C durante 35 seg, e 72 ° C durante 45 seg; uma extensão final foi realizada a 72 ° C durante 7 min. Os produtos foram sujeitos a electroforese em géis de agarose a 2%.

G9A

expressão de genes foi avaliada por RT-PCR quantitativo (iCycler iQ, Bio-Rad, Hercules, CA), utilizando corante SYBR Green I (Bio-Rad, Hercules, CA), utilizando os seguintes iniciadores:

G9A

; Senso 5′-CTCCGCTGATTTTCGAGTGTAA-3 ‘e anti-sentido 5′-GTCGAAGAGGTAAGAATCATCC-3’.

GUSB

(beta glucuronidase humana) primers específicos foram utilizados como controle endógeno; sentido 5′-CCTGTGACCTTCTGAGCAA-3 ‘e anti-sentido 5′-AAACCCTGCAATGGTTTCTG-3’. A PCR iniciada por incubação a 95 ° C durante 1 min, seguido de ciclos de PCR de 35 segundos, a 94 ° C, 35 s, a 59 ° C, 50 seg, a 72 ° C, com uma extensão final a 72 ° C para 7 min. O número de ciclos de PCR foi determinada experimentalmente. Os dados foram analisados ​​utilizando o método 2-ΔΔCT e relatados como a mudança vezes na expressão de genes normalizados para o gene endógeno de controlo (

GUSB

) e relativamente a células sem tratamento.

ensaio de transfecção iARN

a gemcitabina adquirida células resistentes foram semeadas em 24 microtitier Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a 1,5 × 10

5 células /poço em 0,2 ml de OptiMEM e após 24 horas foram transfectadas com lipofectamina e

G9A

siRNA (Ambrion cat # 439242). O controlo negativo foi feito com lipofectamina RANiMAX contendo siRNA Scramble (Ambrion, cat # 4390844). As células foram cultivadas foram cultivadas a 37 ° C em atmosfera humidificada contendo 5% de C0

2.