Abstract

A infecção pelo papilomavírus humano (HPV) pode causar neoplasia intra-epitelial cervical (CIN) e câncer. A regulação negativa da expressão de E6 e E7 podem ser responsáveis ​​para os resultados clínicos positivos observados com o tratamento com IFN, mas a base molecular não foi bem determinado. Como miARNs desempenhar um papel importante na carcinogénese cervical induzido por HPV, que a hipótese de que o IFN-β pode regular a expressão de miARN específicas em células de cancro do colo do útero, e que estes podem mediar miARNs E6 e E7 de expressão, assim modular o seu potencial oncogénico. Neste estudo, descobrimos que miR-129-5p para ser um candidato IFN-β inducible miRNA. níveis de miR-129-5p diminuir gradualmente com o desenvolvimento de lesões intraepiteliais cervicais. Manipulação de expressão de miR-129-5p modula em células HeLa HPV-18 E6 e E7 de expressão de genes virais. Exógeno miR-129-5p inibe a proliferação celular em células HeLa, promove a apoptose e bloqueia a progressão do ciclo celular em células HeLa. SP1 é um alvo directo de miR-129-5p em células HeLa. Este estudo é o primeiro relatório de um miRNA celulares com actividade anti-HPV e fornece novos insights sobre os mecanismos de regulação, entre o HPV e o sistema de IFN em células hospedeiras no nível miRNA

Citation:. Zhang J, Li S , Yan Q, Chen X, Yang Y, Liu X, et al. (2013) Interferon-β induzida

microRNA-129-5p

sub-regula HPV-18 E6 e E7 Viral Gene Expression por Segmentação SP1 em células de cancro do colo do útero. PLoS ONE 8 (12): e81366. doi: 10.1371 /journal.pone.0081366

editor: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de julho de 2013; Aceito: 11 de outubro de 2013; Publicação: 16 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O presente estudo foi apoiado pelos Fundos ciência Natural Nacional da China (nos. 81072139 e 30872760) ea Fundação 2011 Xangai municipal especial para os cuidados de saúde (No.201002013). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma do colo do útero e neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) são causadas por infecção persistente com o papilomavírus humano de alto risco (HPV) sorotipos, mais comumente HPV16 e HPV18 [1]. Assim, o tratamento da infecção por HPV é a chave para a prevenção do cancro do colo do útero e CIN. Dois oncoproteínas, E6 e E7, que codificado por HPV16 e HPV18, pode ligar-se a e estimula a degradação da p53 supressores de tumor e pRb [2] – [5]. IFN tem sido amplamente utilizado no tratamento de CIN e cancro cervical. Infra-regulação de E6 e E7 expressão pode ser responsável pelos resultados clínicos positivos observados com o tratamento IFN, mas a base molecular não foi bem determinado.

Os microRNAs (miRNAs) são RNAs 19-25 nt reguladoras que participam na regulação de várias funções biológicas, bem como na defesa contra patógenos em inúmeras linhagens eucarióticas. Eles são geralmente acredita-se actuar por ligação a sequências de imperfeitamente complementares na (UTR) 3’untranslated região dos genes alvo, resultando em diminuição da tradução ou a degradação do transcrito alvo. Em particular, a sequência complementar no par de base 6-8 “região de semente” da na extremidade 5 ‘do ARNm de miARN-heteroduplex parece determinar a especificidade das interacções miARN-targetRNA. MiRNAs pode ter efeitos pleiotrópicos sobre a diferenciação proliferação celular, apoptose celular e [6]. As alterações nos padrões de miARN celulares em tecido de cancro da cervical ou células de cancro cervical tem sido relatada. Regulação negativa do humano miR-218 [7], [8] e miR-34a [9], em células de cancro cervical foram dirigidas para o HPV 16 E6 oncogene, enquanto que a inibição de miR-21 em HPV 18, contendo células de cancro do colo do útero HeLa provoca uma forte supressão da proliferação de células [10]. Parece, portanto, que miARNs desempenhar um papel importante na carcinogénese cervical por HPV.

MiRNAs pode desempenhar um papel na IFN-β induzida E6 e E7 repressão. Foi miARNs 1shown pode ser induzida por IFN-β. Em células RSA, IFN-β pode induzir a expressão de miR-431, que pode regular negativamente a expressão do IGF1R e IRS2 e, consequentemente, inibem a proliferação celular através da supressão da via da MAPK [11]. Em hepatócitos, IFN-β medeia a modulação da expressão de numerosos miARNs celulares com quase perfeita complementaridade nas suas sequências de sementes com o genoma de ARN do VHC que são capazes de inibir a replicação do VHC e infecção [12]. Como miARNs desempenhar um papel importante na carcinogénese cervical induzido por HPV, que a hipótese de que o IFN-β pode regular a expressão de miARN específicas em células de cancro do colo do útero, e que estes podem mediar miARNs E6 e E7 de expressão, assim modular o seu potencial oncogénico. Para verificar isto, rastreados para miARNs expressos e regulados diferencialmente em 18 de HPV-células HeLa positivas após exposição ao IFN-β, e verificou-se que o miR-129-5p para ser um candidato IFN-p indutível miARN que pode regular negativamente E6 e E7 expressão.

Materiais e Métodos

linhas de células e tecidos humanos

O HPV 18 positivos linha de células Hela [13], HPV 16 negativos linha de células Siha [13] , linha de HPV-negativo cervical C33A célula cancerosa [13] e a linha bem diferenciado cervical carcinoma de células escamosas de células HCC94 [14] foram utilizados neste estudo. Todas estas células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de FBS a 37 ° C e 5% de CO

2. As linhas de células foram colhidas depois de IFN-β (3 × 10

5IU L

-1) tratamento durante 2 h.

cérvix normal e tecidos de cancro do colo do útero foram obtidas de mulheres com idades entre 28 a 77 anos de idade. Quatro amostras cervicais normais foram obtidas de pacientes submetidas à histerectomia para tratar outros tipos de doenças, tais como mioma ou adenomiose. Nenhum dos pacientes tinham sido submetidos a terapia hormonal, radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. Os estágios e graus histológicos desses tumores foram estabelecidos de acordo com os critérios da Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO). Cada amostra de tecido foi imediatamente congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à extracção do ARN. consentimento escrito e informado antes foi obtido de cada paciente, eo estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Faculdade de Medicina de Shanghai Jiao Tong University. Os dados clínicos e patológicos relacionados com as amostras clínicas são apresentados na Tabela 1.

Microarray perfil de expressão e análise de dados

O RNA total em células ou tecidos foram isolados utilizando reagente Tri (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) de acordo com as instruções do fabricante. Depois de passar medições da qualidade do ARN num instrumento Nanodrop, as amostras foram marcadas utilizando o kit de marcação de energia miRCURY Hy3 ™ ™ /hY5 ™ e hibridado na matriz miRCURY ™ LNA (v.11.0). As amostras foram hibridadas sobre uma estação de hibridação, seguindo o protocolo descrito pelo fabricante. Análise foi feita com o digitalizador GenePix 4000B Axon microarray. GenePix Pro V6.0 foi utilizado para ler a intensidade da imagem em bruto. Os limiares utilizados para o rastreio diferencialmente expressos miRNAs foram dobra muda ≥1.5 ou ≤0.7, e

P

valoriza ≤0.05 em t-testes foram considerados significativos.

análise da sequência complementaridade semente Crucial

processamento de dados array e análise da sequência de sementes complementaridade fundamental foram realizadas utilizando os sites (https://www.mirbase.org/, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db = PubMed e https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/).

Análise de miRNA e mRNA por qPCR

O RNA total foi extraído de células cultivadas e tecidos, utilizando Tri-reagente. Para a análise de miARN, miARNs maduros foram reverso transcrito a partir de ARN total, utilizando iniciadores de RT miARN específicas nos Ensaios TaqMan microRNA e reagentes no kit TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa. qPCR foi realizado utilizando os iniciadores TaqMan MicroRNA de ensaio com a PCR Master Mix TaqMan Universal e analisadas com um sistema de prisma 7000 sequência de detecção ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

U6B

foi detectado como um controlo interno para normalizar todos os dados. Os nomes de ensaio para

miR-129-5p e

U6B

foram HSA-mir-129-5p e RNU6B, respectivamente (Applied Biosystems). O cDNA foi gerado utilizando o Kit Prime Script RT Reagente (Takara, Dalian, China). Para a quantificação de HPV18

E6

, HPV18

E7

e

ISG54, PCR em tempo real foi realizada no Sistema de 7000 Sequence Detection ABI Prism com SYBR Premix Ex Taq ( TaKaRa). As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela 2. Em todos os ensaios qPCR, expressões foram calculadas pela fórmula 2

(- ΔΔCt), onde ΔCt é a diferença entre o gene e o gene Ct Ct normalizador. Ct representa o ciclo limite no qual a fluorescência aumenta estatisticamente significativamente acima da linha de base. As experiências foram realizadas em triplicado em três experimentos independentes.

transfecções celulares

As células foram lavadas com PBS e transferido para meio de crescimento sem antibiótico para 24-48 h antes da transfecção. As células foram transf ectadas transitoriamente com

pré-miR-129-5p

, miARN controlo não específico (pré-miR-negativas) ou controlo em branco (Applied Biosystems) em Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando agente siPORT NeoFX Transfecção (Applied Biosystems) seguindo o protocolo do fabricante. O meio foi substituído 8 h mais tarde. números de cópias iguais de plasmídeos foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. vector repórter luciferase tendo os sites de destino para

miR-129-5p

do

SP1 e região 3′-UTR foi comprada pela Shanghai choseasy co., Ltd. As informações detalhadas sobre as construções usadas nesta experiência é mostrado na Tabela 3.

Os ensaios de proliferação

As células (3000 por poço) foram plaqueadas em placas de 96 poços e cultivadas durante 72 h após transfecção (concentração final de miARN de 100 nM) em DMEM /F12 contendo 10% de FBS. A proliferação celular foi documentada a cada 24 h durante 3 dias, utilizando o ensaio de MTT colorimétrico (Sigma, St. Louis, MO) e a absorvância a 490 nm foi avaliado por um leitor de microplacas de 190 Spectra Max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

as células, incluindo células transfectadas, foram fome de 24 h, substituindo o meio com meio DMEM /F12 vermelho-free e livre de soro de fenol (Hyclone Laboratories, Logan, UT) e controle de veículo apropriado com fenol livre de vermelho meio contendo 5% de carvão despojado-FBS (Hyclone Laboratories) durante 48 h. A proliferação celular foi documentada a cada 24 h durante 2 dias. Dentro de uma experiência indivíduo, proliferação sob cada condição foi testada em triplicado, e a experiência geral foi repetida pelo menos duas vezes.

ciclo celular análise

As células foram fixadas com 70% de etanol a 72 h após transfeco e coradas com 25 ug /PI ml (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) em tamp de FACS (PBS contendo albumina de 0,1% de soro de bovino (BSA), 0,05% de Triton X-100, e 50 ug /ml de RNase a) . Após 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz, as células foram analisadas através de citometria de fluxo utilizando um Becton Dickinson FACScan e as fracções de células em G0 /G1, S e G2 /M fases foram analisados ​​usando celular quest Pro Software (BD Biosciences, San Jose, CA). As experiências foram realizadas em triplicado, em três experiências independentes.

Anexina V ensaio

As amostras foram lavadas com PBS e utilizando a coloração de anexina V-FITC e PI para a determinação de exposição de fosfatidilserina na membrana plasmática externa . Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz, as amostras foram quantificadas por citometria de fluxo, utilizando um FACScan Becton Dickinson. As experiências foram realizadas em triplicado em três experimentos independentes.

ensaios de repórter de luciferase

Para ensaios de luciferase, as células (15.000 por poço) foram semeadas 24 h antes da transfecção em branco, claro-bottom 96 poços pratos. As células foram co-transfectadas com 100 ng de

SP1

3′-UTR plasmídeo repórter com 50 nM de pré-miR construir usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. A actividade de luciferase foi ensaiada 24 h ap a transfeco com o Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) e foi medida com um leitor de placas Envision (Perkin Elmer Inc., Wellesley, MA). As amostras foram testadas em triplicado, em três experiências independentes.

análise Western blot

Após os tratamentos indicados, as células foram colhidas e preparadas utilizando proteínas NE-PER nuclear e citoplasmática reagente de extracção (Pierce, Rockford , IL) com um cocktail inibidor de protease (Roche Diagnostics). Todos os extractos foram lisadas de acordo com o protocolo do fabricante. O teor total de proteína foi determinada pelo método de proteínas de Bradford utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce). As proteínas (60 ^ g) foram carregadas numa pré-moldado de 4% de empilhamento, géis de 10% Tris glicina e separados por electroforese em gel seguido por transferência electroforética para uma membrana de PVDF. Após lavagem com solução salina tamponada com Tris, as membranas foram bloqueadas com BSA a 5% /PBS durante 1 h. As membranas foram incubadas com anticorpos policlonais de coelho dirigidos contra SP1 e p21 (1:1000 diluição) (Abcam, Reino Unido). As membranas foram depois incubadas com um anticorpo secundário anti-coelho de cabra (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), e as proteínas manchadas foram visualizadas utilizando o sistema de detecção quimico-luminescência aumentada (Pierce), com pré-corados marcadores (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) como padrões de tamanho molecular. As intensidades das bandas de proteínas foram quantificadas utilizando o software Image J. (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

A análise estatística

Todos os testes foram realizados com o pacote estatístico para o software Ciências Sociais versão 17.0 (Chicago, IL, EUA). Os dados são representados como média com desvio padrão (SD). A significância estatística foi determinada com testes t Student e

P

valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todos os testes estatísticos foram bilaterais.

Resultados

expressão miRNA profiling em células HeLa induzidas por IFN-β

Hela Os miRNAs diferencialmente expressos entre tratados e IFN-β induzida as células foram analisadas utilizando microarrays. As expressões de

miR-129-5p,

miR-637

,

miR-744 Comprar e

miR-943

foram encontrados para ser mais bem induzida em células HeLa por IFN-β e seleccionados para posterior análise (Tabela 4 e Fig. S1). A sequência de semente de

miR-129-5p exibida complementaridade perfeita com o genoma de HPV-18 (Fig. 1). Quantitativa PCR em tempo real (qPCR) foi então realizada para validar a análise microarray, e os resultados demonstraram que as expressões de

miRNA-744

,

miR-943 Comprar e

miR- 129-5p

eram basicamente consistente com a do microarray; Tempo de análise é claro de expressão revelaram que a indução de

miR-129-5p ocorreu rapidamente, atingindo um máximo dentro de 48 h. Semelhante à indução de

ISG54, um gene bem caracterizado IFN-β regulada, a regulação positiva de

miR-129-5p

seguiu uma curva de dose-resposta clássica entre 3 e 3000 UI

-1 ml de IFN-β (Fig. 2).

(a) a validação dos dados de microarranjos por qPCR. Os ensaios foram realizados em triplicado para cada amostra. Induções de genes regulados por IFN conhecidos

ISG54 e

ISG56

são mostrados para comparsion. (B) curso Tempo de indução de miRNA por IFN-β. As células HeLa foram estimuladas com 300 UI ml

-1 IFN-β durante os tempos indicados, e

miR-129-5p e

ISG54 Twitter /

ISG56

expressões foram quantificados por qPCR. (C) Análise de dose-resposta de indução por IFN-miARN β. As células HeLa foram estimuladas com as doses indicadas de IFN-β durante 2 h, e

miR-129-5p e

ISG54

/

ISG56

expressões foram quantificados por qPCR.

níveis

miR-129-5p diminuir gradualmente com o desenvolvimento de lesões intra-epiteliais cervicais e correlacionar com HPV-18 E6 e E7 expressão

por análise qPCR nas amostras de lesões intra-epiteliais cervicais e tecidos humanos cervicais normais, o

miR-129-5p

níveis de expressão foram muito menores em câncer do que em CIN I-II e amostras cervicais normais (Fig. 3 a). as expressões médios de

miR-129-5p foram 10,90 ± 4,01, 4,54 ± 3,12, 1,07 ± 0,65 e 0,57 ± 0,67, respectivamente, nos tecidos normais do colo do útero (controle), grupo CIN I-II, CIN grupo III, e os grupos de carcinoma de células escamosas. As diferenças estatisticamente significativas nas

expressões

miR-129-5p foram encontrados quando comparados os quatro grupos (

P Art 0,05). Os estágios clínicos e graus patológicas do grupo CIN I-II em comparação com os outros grupos foram confirmados para ser significativamente diferentes (

P Art 0,05). HPV-18 de E6 e E7 foram expressão aumentada significativa relativamente ao grupo cérvix normal, grupo de CIN I-II, grupo CIN III, e o grupo de carcinoma de células escamosas (P 0,05, Figura 3 B, C.). As expressões médios de HPV-18 E6 foram 1,67 ± 0,41, 3,55 ± 0,73, 4,70 ± 0,53 e 0,94 ± 0,33, respectivamente, nos tecidos cervical normal (controle), grupo CIN I-II, o grupo CIN III, e carcinoma de células escamosas grupos, enquanto que as expressões médios de HPV-16 E7 foram 1,90 ± 0,35, 3,67 ± 0,55, 6,87 ± 1,33 e 1,23 ± 0,24 nestas amostras. correlação negativa foi encontrada entre a expressão de miR-129-5p e HPV-18 de E6 /E7 em amostras de tecido cervical (P . 0,05, Fig 3 D, E).

(A) A expressão de miRNA-129-5p nas amostras de lesões intra-epiteliais cervicais e tecidos humanos cervical normal. (B) A expressão de E6 de HPV-18 nas mesmas amostras. (C) A expressão do HPV-18 E7 nestas amostras. (D, E) A correlação entre as expressões de HPV-18 E6 /E7 e miR-129 nestas amostras.

Manipulação de

expressão

miR-129-5p em células HeLa modula HPV-18

E6

e

E7

expressão genética viral

Para avaliar se

miR-129-5p

tem um papel funcional na down- regulação do HPV18

E6

e

E7

, que manipulou o nível de

miR-129-5p em células HeLa expressão. Os três grupos incluídos células controle (sem tratamento), células transfectadas com controle de miRNA não específica

(pré-miR-negativo)

, as células transfectadas com

pré-miR-129

. Às 72 horas após a transfecção transitória de pré-miRNAs, as expressões de mRNA de HPV-18

E6

e

E7

em células HeLa foram detectados por qPCR. Transfecção de

pré-miR-129-5p

diminuiu significativamente HPV-18

E6

e

E7

mRNAs (Fig. 4B, Fig. 4C e Fig. S2), e este efeito foi altamente específico, como o

pré-miR-negativo

transfecção não mostrou qualquer efeito na expressão de HPV-18 de E6 e E7.

Fig. (a) demonstraram a eficiência de miR-129 transfecção. Dobre mudanças das expressões de (B) HPV-18

E6 Comprar e (C) HPV-18

E7

em células HeLa determinados por qPCR. A experiência foi repetida duas vezes, cada uma com três repetições. Meios (bares) e SDC (barras de erro) são mostrados. *

P

. 0,001

exógena

miR-129-5p

inibe a proliferação celular em células Hela

Estamos próximos testaram se o aumento níveis de

miR-129-5p

poderia diminuir o potencial proliferativo das células Hela como relatado em células de câncer de bexiga. Um ensaio com base em MTT foi realizado para avaliar a proliferação de células HeLa até 72 h após a transfecção com

miR-129-5p. O ensaio de proliferação revelaram que

miR-129-5p

sobre-expressão inibiu o crescimento celular (Fig. 5), enquanto que as células transfectadas com miARN de controlo continuaram a crescer durante este período.

de crescimento celular era medido por um ensaio MTT. A experiência foi repetida pelo menos duas vezes, cada uma com três repetições, e os dados são expressos como médias com absorvâncias SD. *

P Art 0,001; #

P

. 0,05

exógena

miR-129-5p

promove a apoptose e bloqueia a progressão do ciclo celular em células Hela

Como determinada pela rotulagem anexina V, as células não tratadas e as tratadas com

controles pré-miR-negativos permaneceram viáveis ​​e foram principalmente Anexina V e iodeto de propídio (PI) negativo. Um desvio para a direita na célula activado por fluorescência perfil (FACS), indicativo de apoptose, foi observada para células HeLa transfectadas com

pré-miR-129-5p (Fig. 6).

análise de anexina V mostraram que as células HeLa transfectadas com

pré-miR-129-5p exibido um nível de apoptose significativamente maior do que os grupos de controle. *

P Art 0,01, #

P

. 0,05

análise do ciclo celular por citometria de fluxo demonstrou que as proporções de células em G0 /G1 e S fases dos controlos negativos ficaram inalterados em comparação com células não tratadas. A transfecção de células Hela com

pré-miR-129-5p resultou numa acumulação de células na fase G0 /G1 e uma redução de células na fase S em comparação com células de controlo. A análise de citometria de fluxo que sugeriu

miR-129-5p

poderia prender células Hela no ponto de verificação G1 S /e atrasar o ciclo celular de entrar na fase S. Consequentemente,

miR-129-5p

sobre-expressão abrandou a progressão do ciclo celular e causou um bloqueio da fase G1 do ciclo celular, embora a diferença não foi estatisticamente significativa.

SP1

é um alvo direto de

miR-129-5p em células HeLa

um ensaio de repórter duplo de luciferase foi usado para determinar se

miR-129-5p poderia se ligam aos locais

alvo

miR-129-5p dentro do

SP1

3′-UTR. Utilizou-se construções contendo a sequência de semente previsto para testar o efeito inibidor dos

miR-129-5p. A transfecção de

pré-miR-129-5p em células HeLa, durante 48 h a diminuição da actividade de luciferase em comparação com o controlo negativo. Embora nenhuma alteração na actividade foi observada quando transfectados com o controlo (Fig. 7B), a análise Western blot verificou-se que exógeno

miR-129-5p poderia reduzir os níveis de proteína de SP1 (Fig. 7C).

mapa de restrição (A) Vector. (B) SP1 foi alvo de miR-129-5p através do seu 3 ‘UTR em células HeLa como avaliada utilizando um ensaio da luciferase. (C) analisa Western blot de p21, SP1 e GAPDH em células HeLa após miR-129-5p sobre-expressão. Meios (bares) e SD (barras de erro) são mostrados * P .. 0,05

Discussão

Neste relatório, identificamos IFN-beta miRNAs induzidas no HPV-18 células HeLa positivas. análise de microarray miRNA mostraram as expressões de

miR-129-5p,

miR-637

,

miR-744 Comprar e

miR-943

foram aumentadas , enquanto que

miR-526

* foram reprimidos após a estimulação IFN-β.

miR-129-5p

foi escolhido para um estudo mais aprofundado, como análise bioinformática revelou que

miR-129-5p Comprar e as sequências de genes virais HPV-18 são totalmente complementares. Tem sido demonstrado que o miR-129-5p foi desregulamentado em vários tipos de tumores, incluindo o câncer de endométrio, câncer de esôfago, câncer de cólon e cancro da bexiga, e seus genes alvo verificados incluídos SOX4 [15] – [17], a VCP /p97 [18] e Cdk6 [19]. Sobre-expressão de miR-129-5p pode inibir o crescimento celular e induzir a morte celular no cancro da bexiga [17] e câncer hepatocelular [18], no entanto, o seu papel no cancro do colo do útero não é clara.

Nós descobrimos que miR-129-5p sobre-expressão pode inibir o crescimento de células HeLa a cerca de 70,23% de células de controlo. Enquanto isso, a pré-miR-129-5p transfectadas aumentou a captura de células HeLa na fase G0-G1 (68,34%), enquanto que as células em fase S diminuiu, indicando que a proliferação celular foi inibida, como a síntese de ADN retardado. Estes resultados do efeito de miR-129-5p na proliferação de células e ciclo celular juntamente com a sua capacidade de aumentar a apoptose estavam em conformidade com as observações em células de cancro da bexiga [17]. O nosso estudo também mostrou que a expressão de miR-129-5p foi induzida por IFN-β numa dose e modo dependente do tempo. Estes resultados implicam que o efeito anti-proliferação e pró-apoptose de IFN- no cancro do colo do útero pode, em parte devido à indução da expressão de miR-129-5p.

O cancro cervical causado por infecção por HPV está associado principalmente com o E6 e E7 oncogenes virais. Por análise de qPCR, transfecção de pré-miR-129-5p em células HeLa foi encontrado decréscimo as expressões de E6 e E7 de 69,01% e 77,15%, respectivamente. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que a IFN-β induzida microRNA pode regular negativamente HPV-18 E6 e expressão do gene viral E7. Nosso maior investigação descobriu que o fator de transcrição SP1 é um alvo a jusante direto de miR-129-5p. SP1 é uma proteína de ligação a ADN específica da sequência que contém um local de ligação de miR-129-5p no seu 3′-UTR. As regiões reguladoras a montante de genes de HPV-18 contêm o local de ligação SP1, e eles têm sido mostrados para determinar E6 e E7 expressão do gene [20] – [22]. No presente estudo, verificou-se que a expressão SP1 pode ser regulada de forma significativa pela sobre-expressos miR-129-5p. Além disso, constatou-se a existência de um local de ligação para miR-129-5p em SP1 3′-UTR pelo ensaio de actividade de luciferase. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a expressão induzida de miR-129-5p por IFN-β suprimir a progressão do cancro cervical por HPV-18 de expressão de E6 e E7-regulação para baixo, e SP1 é um alvo a jusante directa de miR-129- 5p. Um resultado interessante revelado pela nossa investigação é que a expressão de miR-129-5p foi elevada em tumores CIN I, mas diminuiu gradualmente ao longo do desenvolvimento do câncer e do aumento do grau patológico. infecção pelo HPV pode induzir a alteração da expressão do miRNA celular durante o desenvolvimento do câncer cervical. Regulação negativa do ser humano miR-218 e miR-34a em células de câncer cervical foram dirigidas ao HPV 16 E6 oncogene. Um estudo recente mostrou que 25 miARNs foram regulados diferencialmente em dois ou três tipos de HPV (HPV 11/16/45) [23]. É razoável que a expressão de miR-129-5p pode ser suprimida por infecção pelo HPV, como a taxa de infecção de HPV de alto risco aumentado através CIN I ao câncer cervical. No entanto, mais estudos são necessários para determinar o mecanismo exato de diminuição da expressão de miR-129-5p durante a progressão do câncer cervical.

Informações de Apoio

Figura S1.

O mapa de calor para os miRNAs diferencialmente expressos entre as células HeLa induzidas não tratados e IFN-beta

doi:. 10.1371 /journal.pone.0081366.s001

(TIF)

Figura S2. Um

A expressão de E6 de HPV-18 em células HeLa; S2B A expressão de HPV-18 E7 em células HeLa

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0081366.s002

(TIF)

Agradecimentos

Um agradecimento especial a Youji Feng e Wang Feng do Hospital Filiado de Xangai primeiras pessoas a Shanghai Jiao Tong University para fornecer orientação tecnológica ao longo do curso do estudo.