Abstract

Fundo

Dihidroartemisinina (DHA), um semi derivado sintéticos de artemisinina, recentemente demonstrou actividade anti-tumoral em várias células de cancro. ligando Apo2 ou ligando indutor de apoptose de necrose tumoral relacionado com o factor (Apo2L /TRAIL) é considerado como um agente anticancerígeno promissor, mas quimiorresistência afecta a sua eficácia como uma estratégia de tratamento. Apoptose induzida pela combinação de DHA e Apo2L /TRAIL não tem sido bem documentada, e os mecanismos envolvidos ainda não estão claros.

Metodologia /Principais Achados

Aqui, nós relatamos que o DHA aumenta a eficácia da Apo2L /TRAIL para o tratamento de câncer de pâncreas. Descobrimos que a terapia combinada usando apoptose DHA e Apo2L /TRAIL significativamente reforçada em BxPC-3 e células PANC-1 em comparação com o tratamento com o agente único

in vitro

. O efeito de DHA foi mediada através da geração de espécies de oxigénio reactivas, a indução de morte do receptor 5 (DR5) e a modulação de proteínas relacionadas com a apoptose. No entanto, a N-acetil cisteína reduzida significativamente a apoptose aumentada observada com a combinação de DHA e Apo2L /TRAIL. Além disso, o knockdown de DR5 por pequeno ARN interferente também reduziu significativamente a quantidade de apoptose induzida pela DHA e Apo2L /TRAIL.

Conclusões /Significado

Estes resultados sugerem que o DHA aumenta a Apo2L /TRAIL- apoptose mediada em células de cancro pancreático humano através reativas de oxigênio espécies mediada por aumento da regulação do DR5

Citation:. Kong R, Jia G, Cheng Zx, Wang Yw, MU M, Wang Sj, et al. (2012) Dihidroartemisinina Melhora a Apo2L /TRAIL-Mediated apoptose em células de cancro do pâncreas via ROS-Mediated Up-regulação da morte Receptor 5. PLoS ONE 7 (5): e37222. doi: 10.1371 /journal.pone.0037222

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Julho, 2011; Aceito em 15 de abril de 2012; Publicado em: 30 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Kong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por doações da Fundação da Primeira Affiliated Hospital da Universidade médica Harbin (2011BS007), a National Science Foundation para científicos de pós-doutoramento da China (20110491109) e da Fundação de Pesquisa de Educação Bureau da Província de Heilongjiang, China ( 12511246). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é uma das neoplasias do sistema digestivo mais letais e tem um prognóstico muito pobre [1], [2]. A quimioterapia convencional tem mostrado benefício de sobrevivência limitada quando combinada com a ressecção cirúrgica [3]. Assim, é urgentemente necessária uma estratégia de tratamento eficaz para o câncer de pâncreas.

A artemisinina (o princípio ativo da erva medicinal chinesa, Artemisia annua [4], [5]) e seus derivados são drogas antimaláricas extremamente eficazes com poucos efeitos secundários adversos [6]. Dihidroartemisinina (DHA), um derivado de artemisinina, é um anti-malária mais eficaz e solúvel em água do que a artemisinina [7]. Recentemente, foi demonstrado que o DHA mata eficazmente vários tipos de células cancerosas [8] – [13]. Além disso, foi determinado que o DHA pode inibir significativamente o crescimento celular e induzir a apoptose de células de cancro do pâncreas de uma maneira dose e dependente do tempo, mas é essencialmente não tóxicos para as células normais [9]. Em estudos anteriores, Agtmael [14] e O’Neill PM [5] demonstraram que a artemisinina contém uma ponte de endoperóxido, que é essencial para a reacção com o ferro para formar espécies reactivas de oxigénio (ROS). Além disso, foi demonstrado que as células cancerosas ocupam uma maior quantidade de ferro para produzir níveis mais elevados de ROS intracelulares que estão presentes nas células normais [15]. Assim, é provável que a potência de DHA contra células cancerosas está relacionada com a geração de ROS [16], mas o mecanismo real de acção DHA é mal compreendida.

Apo2 ou ligando de necrose tumoral a apoptose relacionado com o factor -inducing ligando (Apo2L /TRAIL) é um membro da superfamília de TNF, que serve como um agente anti-cancerígeno eficaz, devido à sua especificidade celular e cancro potente actividade antitumoral. Apo2L /TRAIL induz apoptose em células cancerosas através de interacções com o receptor de morte 4 (DR4) e DR5, que formam o complexo de sinal indutor de morte (DISC) ligando-se a FADD e caspase-8 ou caspase-10 [17] – [19] . O DISCO seguida, por sua vez inicia uma cascata de protease, o qual activa as caspases efectoras a jusante, incluindo a caspase-3. Além disso, muitas proteínas relacionadas com a apoptose a jusante dos receptores de morte, tais como a caspase-6, caspase-7 e caspase-9, participar Apo2L /apoptose induzida por TRAIL [20]. Um certo número de estudos demonstraram que os terpenóides podem sobre-regular a expressão de DR4 e /ou DR5 em células de cancro humano [12], [20], [21]. Assim, os agentes que podem sobre-regular os receptores de Apo2L /TRAIL e regular negativamente as proteínas anti-apoptóticas têm o potencial para aumentar os efeitos apoptóticos de Apo2L /TRAIL. Neste estudo, procurou-se determinar o efeito de DHA em Apo2L /apoptose induzida por TRAIL em células de cancro pancreático. Nossos resultados mostram que o DHA pode potenciar os efeitos apoptóticos de Apo2L /TRAIL através de up-regulação da expressão DR5 em células de cancro pancreático humano.

Resultados

DHA e Apo2L /TRAIL sinergicamente inibir o crescimento de células de cancro do pâncreas

para determinar se o DHA e Apo2L /TRAIL actuar sinergisticamente para inibir o crescimento de células de cancro do pâncreas, medimos a viabilidade celular em BxPC-3 e linhas de células PANC-1 em resposta a diferentes regimes de tratamento. inibição do crescimento dependente da dose foi observada quando as células BxPC-3 foram tratados com o DHA (0-100 nmol /L) ou Apo2L /TRAIL (0-200 ng /ml) sozinha (Figura 1A esquerda). No entanto, o tratamento com doses mais elevadas de DHA e Apo2L /TRAIL em combinação (50 umol /L e 100 ng /mL, respectivamente e 6 pmol /L e 200 ng /ml, respectivamente) resultou numa inibição de crescimento mais potente do que o tratamento com qualquer um dos compostos sozinho (Figura 1A esquerda). Para determinar com maior precisão os efeitos da terapia de combinação, os dados foram analisados ​​utilizando a análise de efeito mediano para determinar o tipo de interacções que ocorreu, isto é, antagonismo (CI 1), aditividade (IC = 1) ou sinergismo (CI 1). O efeito sinérgico (CI 1), foi observada na terapia de combinação (Figura 1A direita). De igual modo, foi observado um efeito sinérgico sugestivo de DHA e de Apo2L /TRAIL no crescimento celular em células PANC-1 (dados não mostrados)

.

(A) células foram tratadas com DHA, Apo2L /TRAIL sozinho ou um combinação dos dois agentes e incubou-se a 37 ° C durante 72 h. A viabilidade das células foi avaliada utilizando o método de MTT. índice de combinação (IC) versus afectadas lotes das fracções (Fa) obtidos a partir da análise do efeito mediano de Chou-Talalay. A CI 1 indica antagonismo, = 1 indica aditividade, e 1 indica sinergia. (B) O ensaio clonogénico foi realizada como descrito na secção Materiais e Métodos. As células foram tratadas com o DHA (50 umol /L) sozinhos, Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) sozinha ou a combinação das duas drogas, durante 24 h e lavou-se com PBS. As células foram então incubadas durante mais 7 d e coradas com violeta de cristal. (C) a sobrevivência clonogénica é apresentada como a percentagem de colónias sobreviventes formado nas células tratadas com a droga em relação às células não tratadas.

Em seguida, realizou-se um ensaio clonogénico para determinar se o DHA aumenta o efeito de Apo2L /TRAIL na formação de colónias de longo prazo. As células foram tratadas com o DHA (50 umol /L), e Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) isoladamente ou em combinação, durante 24 h. As células foram então lavadas com PBS, incubadas em meio fresco e, sete dias mais tarde, foram coradas com violeta de cristal. O ensaio clonogénico indicou que o número de colónias sobreviventes no grupo que recebeu a combinação de DHA e Apo2L /TRAIL foi dramaticamente mais baixa do que nos grupos tratados com DHA ou Apo2L /TRAIL sozinho. Estes resultados indicam que o tratamento combinado com DHA e Apo2L /TRAIL reduziu significativamente o número de células reprodutoras (Figura 1B e 1C).

DHA aumenta a Apo2L /apoptose induzida por TRAIL dependente de espécies de oxigénio reactivo

p> para determinar se a capacidade de DHA para aumentar a citotoxicidade de Apo2L /TRAIL foi mediada por apoptose induzida por ROS, utilizou-se citometria de fluxo e por microscopia confocal de varrimento laser para medir a taxa de apoptose e intracelular ROS em BxPC-3 e PANC- 1 células.

BxPC-3 e PANC-1 As células foram tratadas com o DHA (50 umol /L) e /ou Apo2L /TRAIL (100 ng /mL). Após 72 h de tratamento, as células foram coradas com Anexina V e iodeto de propídio (PI), submetido a citometria de fluxo e visualizado por microscopia confocal de varrimento de laser para medir a taxa de apoptose. histogramas representativos da citometria de fluxo experiências indicam que as taxas de apoptose de controlo BxPC 3-células e as células tratadas com DHA, Apo2L /TRAIL ou a combinação de ambos, foram de 5,1%, 29,4%, 15,5% e 47,8%, respectivamente (Figura 2A ). No que diz respeito às células PANC-1, as taxas de apoptose foi de 6,7%, 18,6%, 11,9% e 45,8%, respectivamente. Assim, o tratamento com DHA ou Apo2L /TRAIL sozinho aumentaram significativamente a taxa de apoptose de células BxPC-3 em comparação com os controlos (tanto in

P

0,05). Além disso, o tratamento com a combinação de DHA e Apo2L /TRAIL levou a um aumento adicional na taxa de apoptose em comparação com o tratamento com DHA ou Apo2L /TRAIL sozinho (

P

0,01). Resultados semelhantes foram obtidos com células PANC-1. A extensão da apoptose, como detectado por V Anexina rotulagem, aproxima-se a redução da viabilidade das células após o tratamento com DHA, Apo2L /TRAIL ou a combinação de ambos, o que sugere que as contas de apoptose para a maioria da citotoxicidade observada. No entanto, o pré-tratamento com N-acetilcisteína (NAC, 10 mM) foi capaz de reduzir significativamente a quantidade de apoptose causada pelo tratamento combinado de DHA e Apo2L /TRAIL em células BxPC-3 e PANC-1 (ambos

P

0,01). Tomados em conjunto, estes dados indicam que as ROS medeia a capacidade de DHA para melhorar a Apo2L /apoptose induzida por TRAIL. O uso de varrimento a laser confocal, microscopia confirmaram o aumento da apoptose medida por citometria de fluxo, como se mostra nas fotografias representativas (Figura 2B). células BxPC-3 e PANC-1 tratados com DHA e Apo2L /TRAIL exibido mais numerosas células em apoptose precoce e de fase tardia do que os controles, que tinham muito poucas células em apoptose em fase inicial.

(A) A apoptose de células de câncer de pâncreas. células BxPC-3 e PANC-1 foram tratados com o DHA (50 umol /L), e Apo2L /TRAIL (100 ng /mL), como indicado. A citometria de fluxo foi realizada para medir as taxas de apoptose (%). Um aumento significativo na taxa de apoptose em comparação com o controlo é indicado por “*” (

P

0,05), um aumento significativo em comparação com DHA- ou Apo2L /células tratadas com TRAIL é indicado por “†” (

P Art 0,01), e uma diminuição significativa em comparação com DHA + células Apo2L /tratados com TRAIL é indicado por “‡” (

P Art 0,01). histogramas representativos de células analisadas cytometrically BxPC-3 e PANC-1 tratadas com controlo, DHA, Apo2L /TRAIL, DHA + Apo2L /TRAIL ou a NAC (10 mM). microscopia confocal (B) de exploração do laser células. fotografias representativas foram tomadas do controle BxPC-3 e células PANC-1 e de BxPC-3 e células PANC-1 tratados com DHA + Apo2L /TRAIL e DHA + Apo2L /TRAIL + NAC. (C) Os níveis de ROS intracelulares medida in vitro. BxPC-3 e células PANC-1 foram tratados com o DHA (50 umol /L), Apo2L /TRAIL (100 ng /ml), o DHA + Apo2L /TRAIL, ou pré-tratados com NAC (10 mM) e depois tratou-se com DHA + Apo2L /TRAIL durante 6 horas. Células não tratadas serviram como controlo. As células foram incubadas com DCFHDA e, em seguida, submetido a citometria de fluxo para medir os níveis de intracelular de ROS, como representado por DCF fluorescência. Um aumento significativo na fluorescência de DCF em comparação com o controlo é indicado por “*” (

P

0,05), uma diferença altamente significativa em comparação com o controlo é indicado por “**” (

P

0,01), e uma redução significativa em comparação com o DHA + Apo2L tratamento /TRAIL é indicado por “†” (

P

0,05). (D) fotografias representativos são mostrados para as células DCFHDA coradas observados usando laser scanning microscopia confocal. A fluorescência verde representa ROS intracelulares. (E) A intensidade média de fluorescência foi medido para as células DCFHDA-coradas, e as respectivas imagens plano horizontal 3-dimensionais foram produzidos por varrimento a laser microscopia confocal. Uma diferença significativa do controlo é indicada por “*” (

P

0,01), e uma diferença significativa relativamente ao tratamento /TRAIL + DHA Apo2L é indicado por “†” (

P

. 0,05)

BxPC-3 e células PANC-1 foram incubadas com DHA (50 umol /L), Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) ou a combinação de ambos para 12 h, e DCF fluorescência foi registado como uma medida dos níveis de ROS intracelulares. Tal como mostrado na Figura 2C, os níveis de ROS intracelular foram significativamente (

P

0,01) mais elevada em células que tinham sido tratados com a combinação de DHA e de DHA e Apo2L /TRAIL do que em células de controlo. No entanto, o tratamento de Apo2L /TRAIL sozinho teve pouco efeito sobre os níveis intracelulares de ROS em BxPC-3 e células PANC-1. Para confirmar que a produção de ROS é responsável por aumentar a Apo2L /apoptose induzida por TRAIL, as células foram pré-tratados com NAC 10 mM, um inibidor bem conhecido da produção de ROS, durante 6 h e, em seguida, incubou-se com a combinação de DHA e Apo2L /TRAIL. resultados de varredura a laser indicam que o pré-tratamento com NAC significativamente (

P Art 0,05) reduziu o nível de ROS intracelular em todos os tipos de células em comparação com as células tratadas com DHA e Apo2L /TRAIL sozinho. A microscopia confocal em combinação com coloração DCFHDA, onde fluorescência verde representa o ROS intracelular (Figura 2D), revelou que era significativamente intracelular ROS (

P

0,01) mais elevada em células tratadas com DHA do que em células de controlo. No entanto, o pré-tratamento com NAC significativamente (

P

0,05). Reduziu a intensidade média de fluorescência nas DHA- e Apo2L /TRAIL-células tratadas (Figura 2E)

DHA regula a apoptose relacionada a expressão do gene

em seguida, analisou-se a expressão de genes relacionados com a apoptose mediada por ROS depois do tratamento com DHA. BxPC-3 e células PANC-1 foram tratadas com várias concentrações de DHA (0, 25, 50 e 100 nmol /L) ou pré-tratados com NAC (10 mM), seguido pela adição de DHA (100 umol /L) durante 72 h , e os níveis de proteína Bcl-2, Bax, sobrevivendo, caspase-3, caspase-8 e caspase-9 de expressão foram detectados por análise de western blot. Em resposta a DHA, os níveis de Bax, caspase-3, caspase-8 e caspase-9 de expressão foi significativamente regulada para cima, enquanto a Bcl-2 expressão diminuída de um modo dependente da dose, e a expressão de survivina permaneceu inalterada na BxPC-3 e PANC-1 células. Interessantemente, o pré-tratamento com a NAC (10 mM) bloqueou a capacidade de DHA para sobre-regular a expressão da caspase-8, Bax, caspase-9 e caspase-3. Verificou-se também que o DHA melhorou significativamente Apo2L /TRAIL mediada por apoptose em ambas as linhas celulares, e esta correlacionada com o aumento da activação de caspase-8, Bax, caspase-9 e caspase-3 (Figura 3).

células BxPC-3 e PANC-1 foram tratadas com várias concentrações de DHA (0, 25, 50, 100? mol /L) e pré-tratados com NAC seguido de DHA (100 umol /L) durante 72 h. Os extractos celulares totais foram preparados e analisados ​​por Western Blotting utilizando anticorpos contra Bcl-2, Bax, sobrevivendo, caspase-3, caspase-8, caspase-9 e. DHA significativamente sobre-regulada a expressão da Bax, caspase-3, caspase-8 e caspase-9, e regulados negativamente a expressão de Bcl-2. No entanto, DHA tiveram pouca influência sobre a expressão de survivina. DHA com NAC (10 mM) pré-tratamento não sobre-regular a expressão da caspase-8, Bax, caspase-9 e caspase-3. β-actina serviu como um controlo interno.

DHA induzida por aumento da regulação do DR5 é dependente de espécies reativas de oxigênio

A seguir, examinar se ROS foi envolvido em DR5 induzida DHA expressão. células BxPC-3 e PANC-1 foram tratadas com várias concentrações de DHA durante 48 h, os extractos celulares totais foram preparados e a expressão da proteína de DR5 foi examinada. Descobrimos que o DHA teve os efeitos dose-dependente da expressão de DR5 (figura 4A). Assim, buscou-se determinar se a geração de ROS está diretamente associado com a capacidade de DHA para induzir a expressão DR5. detecção de FACS mostrou que o tratamento de BxPC-3 e PANC-1 com o aumento dos níveis de DHA ROS intracelulares de um modo dependente da dose, e o aumento induzido por DHA em níveis de ROS foi significativamente bloqueada por pré-tratamento com NAC 10 mM (Figura 4B). Importantemente, o pré-tratamento com NAC inibiu marcadamente a DHA induzida por sobre-regulação da expressão de DR5 (figura 4A).

BxPC-3 e células (A) PANC-1 foram tratados com as doses indicadas de DHA durante 48 h . Os extractos celulares totais foram preparados e analisados ​​para a expressão de DR5 utilizando Western blotting. DHA teve os efeitos dose-dependente da expressão de DR5. O aumento induzido por DHA em níveis significativamente DR5 foi bloqueada por pré-tratamento com NAC 10 mM. p-actina serviu como um controlo interno. (B) As células foram recolhidas e analisadas utilizando citometria de fluxo. Um aumento progressivo na fluorescência foi observada em células tratadas com 25, 50 e 100 nmol /L de DHA, respectivamente, indicando um aumento dependente da dose na produção de ROS em resposta ao tratamento com DHA nas duas linhas celulares. A produção de ROS foi marcadamente inibida pelo pré-tratamento das células com NAC (10 mM). (C) As células foram tratadas com o DHA (50 umol /L) sozinhos, Apo2L /TRAIL (100 ng /mL) sozinha, ou uma combinação dos dois agentes. As células também foram tratados com NAC (10 mM) por si só ou pré-tratados com NAC e incubou-se a 37 ° C durante 72 h. A viabilidade das células foi avaliada utilizando o método de MTT e foi calculado o índice de viabilidade (%). As diferenças significativas são indicados por “*” (

P Art 0,01).

A seguir, analisou se a limpeza de ROS poderia atenuar o /morte celular induzida por TRAIL Apo2L reforçada por DHA . Tal como mostrado na Figura 4C, o DHA marcadamente melhorada morte celular de Apo2L /TRAIL em induzida por BxPC-3 e células PANC-1. No entanto, o pré-tratamento com NAC reduziu de forma significativa a capacidade de DHA para induzir a morte celular de 63% para 14% em células BxPC-3 e de 31% para 17% em células PANC-1. Tomados em conjunto, estes dados indicam que a ROS mediada por sobre-regulação de DR5 é crítica para o reforço de DHA observada de Apo2L /apoptose induzida por TRAIL.

Apo2L /apoptose induzida por TRAIL mediada por DR5 está DHA-regulada expressão

também investigamos se a expressão DR5 DHA mediada é necessário para Apo2L /apoptose induzida por TRAIL em células de câncer de pâncreas. Para determinar o papel de DR5 na Apo2L /apoptose induzida por TRAIL, foi utilizado siRNAs para sub-regular a expressão de DR5. A seguir, analisou se a supressão de DR5 por siRNA poderia revogar os efeitos sensibilizantes de DHA sobre a morte celular Apo2L /induzida por TRAIL. A transfecção de células com DR5 siARN aumentou a viabilidade das células BxPC-3 de 47% (

P

0,01) e a viabilidade de células PANC-1 em 42% (dados não mostrados), em comparação com a combinação tratamento sozinho (Figura 5); tratamento com ARNsi de controlo não teve nenhum efeito (Figura 5). Estes resultados revelam, por conseguinte, que o efeito de DHA na apoptose induzida por TRAIL de Apo2L /tinha sido aboliu eficazmente nas células que foram transfectadas com ARNsi de DR5, indicando que DR5 é um importante mediador de Apo2L /apoptose induzida por TRAIL.

BxPC-3 e PANC-1 foram transfectadas com ARNsi de DR5 e ARNsi de controlo, quer sozinho ou em combinação. Após 48 h, as células foram tratadas com 50 pmol /L DHA durante 24 h, e extractos de células inteiras foram sujeitos a transferência Western para testar a expressão de DR5. A transfecção de células com siRNA alvejando DR5 silenciados especificamente a expressão de DR5. As células foram semeadas numa câmara de corrediça e transfectadas com ARNsi. Após 48 h, as células foram tratadas com 50 pmol /L de DHA, 100 ng /ml de Apo2L /TRAIL, sozinho ou em combinação, e incubou-se a 37 ° C durante 72 h. A viabilidade das células foi avaliada utilizando o método de MTT, e foi calculado o índice de viabilidade (%). O silenciamento de DR5 por siRNA reduziu o efeito citotóxico da combinação de DHA e Apo2L /TRAIL, mas não de DHA. As diferenças significativas são indicados por “*” (

P Art 0,01).

DHA e Apo2L /TRAIL inibir significativamente o crescimento de células de câncer de pâncreas humanos

In vivo

Para investigar o efeito de DHA e /ou Apo2L /TRAIL no crescimento celular

in vivo

, as células BxPC-3 foram xenoenxerto subcutaneamente em ratinhos nus. Nem o DHA nem os grupos de Apo2L /TRAIL demonstraram uma redução significativa no volume do tumor comparado com o grupo de controlo (

P

0,05). No entanto, os ratinhos tratados com a combinação de DHA e Apo2L /TRAIL tinham tumores que eram, não só significativamente menor do que o controlo (

P

0,01), mas também foram menores do que aqueles tratados com qualquer dos agentes isolados (

P Art 0,05), demonstrando supressão maior no crescimento do tumor

in vivo

(Figura 6A e B). A análise Western blot dos lisados ​​de tecido tumoral também revelaram que os níveis de DR5, caspase-3 e caspase-8 de expressão foi significativamente regulada para cima no grupo tratado com a terapia de combinação e a um maior grau do que os grupos tratados com DHA ou Apo2L /TRAIL sozinho (Figura 6C). Estes resultados são consistentes com os nossos

in vitro

estudos, fornecendo mais evidências de que o DHA pode potencializar a atividade antitumoral de Apo2L /TRAIL

in vivo

.

(A) BxPC- 3 tumores foram estabelecidos por via subcutânea em ratos. Quando os tumores atingiram aproximadamente 120 milímetros

3 em volume de, os ratinhos foram atribuídos aleatoriamente ao controlo, DHA, Apo2L /TRAIL, ou grupos de DHA + Apo2L /TRAIL e tratada tal como descrito na secção de métodos. Os tamanhos (medido em mm

3) dos tumores foram monitorados e gravados. Uma diferença significativa no volume do tumor a partir do controle é indicado por “*” (

P

0,05), e uma redução significativa em comparação com o DHA ou Apo2L /TRAIL-tumores tratados é representada por “**” (

P Art 0,01). (B) Animais e tumores representativos são mostrados para cada grupo. (C) tumores de ratinhos de controlo e dos ratinhos tratados com DHA, Apo2L /TRAIL, e DHA + Apo2L /TRAIL foram homogeneizadas e submetidas a análise Western Blot para detectar a expressão da caspase-3 e caspase-8. p-actina serviu como um controlo interno. (D) Análise de proliferação marcador PCNA por imuno-histoquímica e estado de apoptose de células tumorais in situ por TUNEL. PCNA positivos (E) e as células positivas TUNEL (F) também foram contadas sob microscópio para calcular o índice de proliferação e índice apoptótico, respectivamente. “*”:

P Art 0,05, em comparação com o controle. “**”:

P Art 0,01, em comparação com um único agente

A proliferação celular marcador PCNA e apoptose celular foram reanalisadas

in situ

no tumor. amostras dos quatro grupos. Como mostrado na Figura 6D e E, DHA ou /TRAIL grupos tratados com Apo2L tinha reduzido expressão de PCNA comparado ao grupo controle (

P Art 0,05). Enquanto os ratos tratados com a combinação de DHA e Apo2L /TRAIL teve expressão de PCNA, que não só era mais baixo do que o controle (

P Art 0,01), mas também foi menor do que um ou outro agente tratados isoladamente (

P

0,05). Monoterapia ou com DHA ou Apo2L /TRAIL produzidos significativamente maior apoptose do que o controle (

P Art 0,05), enquanto a terapia combinada produziu ainda mais a apoptose não só que o controle (

P 0,01), mas também que os grupos tratados com agente único (

P

. 0,05, Figura 6D e F)

Discussão

no presente estudo, mostramos que o DHA, um derivado semi-sintético da artemisinina, pode aumentar o efeito apoptótico de Apo2L /TRAIL contra as células cancerígenas pancreáticas. DHA age sinergicamente com Apo2L /TRAIL para inibir a proliferação e induz a apoptose através da regulação up-ROS mediada por DR5 em ambas as células BxPC-3 e PANC-1. Além disso, foi demonstrado que o DHA pode sensibilizar células do cancro do pâncreas Apo2L tratamento /TRAIL

in vivo

.

Solúvel Apo2L /TRAIL, que está a emergir como um agente anticancerígeno atraente, tem sido avaliada em vários testes clínicos. No entanto, muitos relatórios indicam que a maioria das linhas de células de carcinoma pancreático são resistentes a Apo2L /TRAIL [22] – [25]. a resistência de células de câncer de Apo2L /TRAIL é uma das maiores barreiras para a maior exploração desta terapia. Assim, os agentes que podem potenciar o efeito de Apo2L /TRAIL ou ultrapassar a resistência são urgentemente necessários [26]. Os objetivos deste estudo foram determinar se a combinação DHA com Apo2L /TRAIL pode promover a atividade antitumoral sinérgica e compreender o mecanismo exato pelo qual a terapia de combinação utilizando estes agentes provoca a morte das células do câncer de pâncreas

in vitro

e

in vivo

.

Apesar de muitas neoplasias apresentar alguma resistência a Apo2L /TRAIL em ensaios clínicos, um crescente corpo de dados demonstra que Apo2L /TRAIL pode matar selectivamente as células cancerosas sem danificar as células normais, o que poderia aliviar muitos efeitos secundários da quimioterapia convencional. Notavelmente, muitos relatos demonstraram que alguns extractos de plantas e agentes quimioterapêuticos pode sensibilizar as células cancerosas à morte Apo2L /induzida por TRAIL de células [17], [26] – [29], o que indica que a resistência de Apo2L /TRAIL podem ser superados com a utilização de sensibilizadores eficazes. Recentemente, o DHA tem sido mostrado para produzir fortes efeitos antitumorais quer isoladamente ou em combinação com agentes quimioterapêuticos com mínima toxicidade para o hospedeiro contra vários tipos de carcinoma

In vitro

e

In vivo

[8] – [ ,,,0],10], [30] – [32]. Enquanto isso, o efeito de DHA contra o cancro do pâncreas foi confirmada em nossos estudos anteriores [9], [30]. No entanto, desconhece-se se DHA e Apo2L /TRAIL agem sinergicamente contra o cancro pancreático. No presente estudo, verificou-se que a combinação de DHA e Apo2L /TRAIL resultou em maior inibição do crescimento de BxPC-3 e PANC-1 células

in vitro

do que quando um ou outro agente foi usado sozinho. Os nossos resultados indicam que o DHA pode sinergicamente melhorar Apo2L /citotoxicidade mediada por TRAIL e sensibilizar as linhas de células de cancro pancreático humano para Apo2L /apoptose induzida por TRAIL.

Vários relatórios têm mostrado que a produção de ROS está envolvido em Apo2L /TRAIL mediada apoptose [33], [34]. ROS também é geralmente aceite para ser associado com a metástase e a tumorigénese, embora esta correlação é frequentemente complexo e contraditório [35]. Na verdade, a maioria dos agentes anti-neoplásicas têm mecanismos bem estabelecidos de acção que envolvem a geração de ROS [36]. Em células de cancro, o stress oxidativo induzido por drogas sobrepõe sobre o stress oxidativo intrínseca, resultando em uma resposta citotóxica mediada por ROS potente que preferencialmente matam as células tumorais ou inibe a sua proliferação [37]. Uma ponte endoperóxido em artemisinina reage com o ferro intracelular para gerar radicais livres, o que pode levar a danos macromolecular e a morte das células [38], [39]. DHA, um derivado de artemisinina, foi demonstrado que provoca a morte de linhas celulares que expressam o vírus do papiloma humano através da indução de estresse oxidativo que conduz à geração de ROS [8]. Um trabalho recente demonstrou também que as células metastáticas de melanoma humano em cultura são sensíveis à apoptose induzida pela DHA e exposição a sobre-regulação do stress oxidativo celular, externalização fosfatidilserina e pro-caspase-3 clivada [40]. No nosso estudo, verificou-se que os níveis de intracelular ROS aumentada significativamente pelo tratamento DHA na presença e ausência de Apo2L /TRAIL, enquanto o tratamento com Apo2L /TRAIL sozinho teve pouco efeito sobre o ROS intracelular em BxPC-3 e células PANC-1. Descobrimos também que a capacidade de DHA para melhorar a Apo2L /apoptose induzida por TRAIL pode ser atenuada por pré-tratamento com NAC. Portanto, nossos resultados fornecem um novo mecanismo pelo qual DHA podem agir sinergicamente com Apo2L /TRAIL para exercer seus efeitos pró-apoptóticos combinados em câncer pancreático, pelo menos em parte através da geração de ROS. Em células de cancro do cólon, a apoptose induzida por Apo2L /TRAIL sozinho também é regulado pela geração de ROS [41]

Dois caminhos primários são conhecidos para iniciar a apoptose celular:. A morte induzida pelo receptor, e a via extrínseca intrínseca, via mitocondrial [42], [43]. Nós anteriormente relatado que o DHA pode desencadear a via mitocondrial para induzir apoptose através da regulação da expressão de Bcl-2 e Bax, que conduz à libertação de citocromo c das mitocôndrias e activar o iniciador a jusante de caspase-9, o que resulta na activação do efector caspases e a indução de apoptose [44]. No entanto, vários estudos têm ilustrado que a resistência de Apo2L /TRAIL em linhas celulares de cancro envolve a expressão da proteína anti-apoptótica c-flip e a regulação negativa da pró-apoptótica de proteínas caspase-8 [20], [27], [45 ]. Alguns agentes quimioterapêuticos, incluindo zerumbone [20] e garcinol [27], pode significativamente regular negativamente a expressão de c-flip e /ou regular positivamente a expressão da caspase-8 por meio de ROS para aumentar a sensibilidade de células para Apo2L /TRAIL . Reconhece-se que a caspase-8 é um alvo a jusante directa de DR5, e pró-caspase-8 recrutas DISC para activar caspase-8, o que resulta na activação de caspases efectoras a jusante [46]. No nosso estudo, DHA-se regula-caspase-8, a expressão de uma forma dependente da dose para iniciar a apoptose celular. Também mostram que o DHA modula a expressão de DR5 de uma forma dependente da dose e que a expressão aumentada de DR5 está relacionada com as alterações observadas em estresse oxidativo. Os nossos dados indicam que as ROS é um dos reguladores a montante responsáveis ​​pela indução de DHA-mediada de DR5 e que o DHA pode potenciar Apo2L /apoptose celular induzida por TRAIL através dos caminhos-de receptor de morte extrínsecos. Estes resultados são consistentes com os relatados em um estudo anterior [20]. A interferência entre estas duas vias é provavelmente devido a clivagem de Bid e a sua subsequente translocação para a mitocôndria em que inicia a via de apoptose intrínseca [28] caspase-8-mediada. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que, para além das vias apoptóticas mediadas por mitocondriais, a produção de ROS DHA-dependente também desempenha um papel crucial na melhoria sinérgica de Apo2L /apoptose induzida por TRAIL através dos caminhos-de receptor de morte extrínsecos em células de cancro do pâncreas .

Aqui, nós usamos com sucesso o limpador ROS, NAC, para inibir o estresse oxidativo. As experiências foram repetidas três vezes.