Abstract

O desenvolvimento de novas terapias direcionadas tornou-se um foco de pesquisa importante para o tratamento do cancro do pulmão. Nosso estudo anterior mostrou leptomycin B (LMB) proliferação significativamente inibido de células de câncer de pulmão; no entanto, p53 tipo selvagem células de câncer de pulmão foram resistentes a LMB. Portanto, o objetivo deste estudo foi desenvolver e avaliar uma nova estratégia terapêutica para sensibilizar células de câncer de pulmão LMB-resistente, combinando LMB e doxorrubicina (DOX). Entre os diferentes regimes de tratamento, o pré-tratamento com DOX (pré-DOX) e subsequente tratamento com LMB para células A549 diminuiu significativamente a concentração inibidora 50% (CI50) quando comparada com a de isoladamente (4,4 nM

vs LMB.

10,6 nM,

P Art 0,05). Análise do ciclo celular e a apoptose por citometria de fluxo confirmou ainda mais os dados citotóxicos. Para investigar os mecanismos moleculares para este efeito a combinação de fármacos, vias p53 foram analisados ​​por Western blot, e proteoma nuclear foi avaliada por electroforese bidimensional em gel diferença-(2D-DIGE) e espectrometria de massa. Em comparação com grupos de controle, os níveis de p53, fosfo-p53 (ser15), e proteínas p21 foram significativamente aumentados, enquanto fosfo-p53 (Thr55) e survivina foram diminuiu significativamente após tratamentos de pré-DOX e LMB (

P

0,05). A análise de 2D-DIGE /MS identificou que sequestosome 1 (SQSTM1 /p62) tinham um aumento significativo no pré-DOX e células tratadas com LMB (

P

0,05). Em conclusão, os nossos resultados sugerem que as células de câncer de pulmão resistentes aos medicamentos com p53 do tipo selvagem pode ser sensibilizados para a morte celular por tratamento de combinação programada de DOX e LMB através da activação e restaurar p53, bem como potencialmente outra via (s) de sinalização envolvendo sequestosome 1.

Citation: Lu C, Shao C, Cobos E, Singh KP, Gao W (2012) quimioterápico sensibilização de Leptomycin B resistentes células de câncer de pulmão por pré-tratamento com doxorrubicina. PLoS ONE 7 (3): e32895. doi: 10.1371 /journal.pone.0032895

editor: Ashraf B. Abdel-Naim, Faculdade de Farmácia da Universidade Ain Shams, Egipto

Recebido: 13 de dezembro de 2011; Aceito: 07 de fevereiro de 2012; Publicação: 07 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Lu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de câncer. morte no mundo e nos Estados Unidos [1]. cancro do pulmão de não-pequenas células (NSCLC) continua a ser a forma predominante de cancro do pulmão (cerca de 85% de todos os cânceres de pulmão), entre os quais adenocarcinoma pulmonar (AC) é o subtipo histológico mais comum para todos os sexos e raças combinada [2]. O prognóstico de câncer de pulmão é muito pobre, com uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 15% nos Estados Unidos. A quimioterapia continua a ser o tratamento mais comum para prolongar a sobrevivência e melhorar a qualidade de vida [3], [4], [5], [6].

A quimioterapia do cancro tem sido utilizado com sucesso numa variedade de circunstâncias envolvendo doenças malignas, no entanto, a sua eficácia tem sido muitas vezes limitada pela resistência à droga e os efeitos colaterais [7]. Terapias com foco na molécula específica (s) /via (s) têm o potencial para ultrapassar estas limitações [7]. Leptomycin B (LMB) e /ou os seus derivados, que podem inibir eficazmente exportação nuclear por inibir especificamente a manutenção região cromossoma 1 (CRM1), tem sido reconhecida como uma nova classe de agentes terapêuticos do cancro [8], [9], [10], [11], [12]. CRM1, o melhor receptor de exportação nuclear caracterizada, desempenha um papel essencial na canônica sinal de exportação nuclear (NES) exportação nuclear dependente, incluindo as principais proteínas supressoras de tumor (PAT), tais como p53, FOXO, pRb, p21, p27, etc., assim como o inibidor de NF-kB, I-kB ou seja, [9], [13]. Estudos recentes têm relatado que CRM1 é expresso a um nível significativamente mais elevado no cancro do colo do útero em comparação com o tecido normal [14] e poderia servir como um fator prognóstico para câncer de ovário [15] e osteosarcoma [16]. Nosso recentemente publicado

in vitro

estudos usando células pulmonares normais epiteliais [17] e um modelo de rato bitransgenic [18] sugeriram que CRM1 desempenha um papel crítico no desenvolvimento do câncer de pulmão. Além disso, CRM1 foi sobre-expressa num modelo de ratinho de CA pulmonar induzida por carcinogénico do tabaco, e de pulmão humano CA (dados não publicados). Estes achados sugerem CRM1 poderia servir como um alvo molecular para o tratamento do cancro, incluindo o cancro do pulmão.

LMB é um inibidor altamente específico e potente da função CRM1 irreversivelmente por ligação com o grupo sulfidrilo de um resíduo Cys próximo ou no interior da domínio de ligação de carga de CRM1 (alquilação Cys 528) [19], [20]. Assim, pode impedir LMB localização citoplasmática e modulam as vias específicas do cancro, tais como a inactivação de importantes supressores tumorais, como p53 [10]. O nosso estudo recente demonstrou que a linha celular A549 do pulmão AC (p53 do tipo selvagem) foi mais resistente a LMB do que outras linhas de células com o mutante p53 nulo ou [12]. É bem conhecido que a p53 desempenha um papel importante na promoção da estabilidade genómica, paragem do ciclo celular, a apoptose, a reparação do ADN, e senescência. Estudos sugeriram que as funções de p53 do tipo selvagem em paragem do crescimento celular e a reparação do ADN pode aumentar a resistência à radio- ou quimio- agentes terapêuticos; Também é propenso a potenciar apoptose em resposta a danos no ADN grave [21], [22], [23]. Portanto, para sensibilizar células de câncer de pulmão para o efeito quimioterápico da LMB, nós aqui propor uma estratégia terapêutica combinando LMB com outras drogas através da indução de danos no DNA grave e ativação de p53 que poderia eventualmente levar ao aumento da função do p53 na apoptose em vez de no reparo do DNA. A doxorrubicina (DOX) é um agente quimioterapêutico largamente utilizado que induz apoptose em várias células cancerígenas através da activação de p53. Tem sido usado no tratamento de uma variedade de tumores sólidos. No entanto, a resistência aos medicamentos em DOX regimes contendo é um grande problema que impede melhores taxas de resposta e as curas e os efeitos colaterais cardiotóxicos foram reportados em pacientes com câncer tratados com DOX [24], [25], [26]. Os tratamentos individuais de DOX resultou em forte resistência em muitas linhas celulares de cancro incluindo A549, devido a vários mecanismos, incluindo a biodisponibilidade de drogas [27], [28] ou a activação de NF-kB [29]. Se DOX é combinado com outros fármacos quimioterapêuticos, doses mais baixas podem ser usadas para reduzir não só os efeitos secundários, mas também aumentam a eficácia [30].

Neste estudo, procurou-se reverter a resistência aos medicamentos de DOX e /ou LMB em células A549 através de diferentes regimes terapêuticos de um co-tratamento de DOX e LMB, bem como avaliar os seus mecanismos moleculares possíveis. Verificou-se que o pré-tratamento de DOX com o tratamento subsequente de LMB sensibilizados as células A549 resistentes a medicamentos para o efeito quimioterapêutico de LMB. Estas alterações podem resultar da activação inicial do p53 por tratamento DOX e, consequentemente, a função CRM1 bloqueio por tratamento LMB para acumular p53 activada no compartimento nuclear. Além disso, as vias de sinalização envolvendo diferentes de p53 moléculas também podem desempenhar um papel importante na promoção efeitos terapêuticos do tratamento combinado de DOX e LMB.

Materiais e Métodos

Reagentes

A doxorrubicina (DOX) e dimetilsulf óxido (DMSO) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO. LMB (1 mM) foi comprado de LC Labs, Woburn, MA. Os stocks de DOX (10 mg /mL) e LMB foram diluídas até à concentração desejada imediatamente antes da utilização com meios de crescimento. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi comprado de Corporação USB. RPMI-1640, penicilina /estreptomicina, e soro fetal de bovino (FBS) foram adquiridos a Thermo Scientific, Logan, UT. Os anticorpos primários, incluindo p53, fosfo-p53 (Ser15), fosfo-p53 (Thr55), p21, sequestosome 1 (SQSTM1 /p62), e a survivina, foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. policlonal primário de coelho anti-α-tubulina foi comprado de Abcam, Cambridge, MA. A peroxidase de rábano (HRP) anti-IgG de coelho de burro -conjugated e um kit de quimioluminescência aumentada (ECL) foram adquiridos da GE Healthcare, Piscataway, NJ. ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão de lise foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology.

Células e Cultura Celular

pulmão humano adenocarcinoma epitelial linhas de células A549 e NCI-H358 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC ). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 50 U /mL de penicilina, e 50 mg /ml de estreptomicina. As células foram incubadas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 95% de ar e 5% de CO

2 em volume. As células foram sub-cultivadas ou revestida para o tratamento subsequente, até eles se aproximaram aproximadamente 80% de confluência.

Viabilidade Celular Ensaio

A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio MTT como descrito anteriormente [17]. Resumidamente, as células foram colocadas em placa a 5 x 10

3 células por poço em placas de 96 poços. Com base na citotoxicidade de DOX ou LMB observado no presente estudo e relatórios anteriores [9], [12], [26], [31], [32], [33], 0,5 nM LMB ou 0,5 pM de DOX foi seleccionado para co -Tratamento ou pré-tratamento. As células foram tratadas com o seguinte: 1) DOX sozinha (0-5? M) durante 24 e 48 h; 2) LMB sozinho (0-10 nM), durante 24 e 48 h; 3) co-tratamento de 0,5 nM LMB e DOX (0-5? M) simultaneamente (DOX + LMB (0,5 nM)), durante 24 e 48 h; 4) co-tratamento de 0,5 ^ M de DOX e LMB (0-10 nM), simultaneamente, (+ LMB DOX (0,5 uM)) durante 24 e 48 h; 5) o pré-tratamento de 0,5 nM LMB durante 24 h (pré-LMB) e subsequente DOX (0-5? M) durante 48 h (pré-LMB + DOX); e 6) o pré-tratamento de 0,5 ^ M de DOX durante 24 h (pré-DOX) e subsequente LMB (0-5 nM) durante 48 h (pré-Dox + LMB). O etanol (EtOH, 0,1%) foi usada como o controlo de veículo para LMB. Três horas antes do final de cada ponto de tempo, 15 ul de MTT (10 mg /mL) foi adicionado a cada poço e incubou-se a 37 ° C. Em cada ponto de tempo, quando precipitado púrpura foi claramente visível ao microscópio, com 100 mL de 100% de DMSO foi adicionado a todos os poços e a viabilidade celular foi determinada medindo a absorvância a 570 nm (comprimento de onda de referência de 630 nm =) usando um SpectraMax Além disso espectrometria fotómetro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Seis repetições em cada ponto de concentração e do tempo foram analisadas. As experiências foram realizadas de forma independente em triplicado. de controlo e brancos tratados com veículo foram incubadas na mesma placa sob as mesmas condições. absorção fracionada foi calculada usando a seguinte fórmula:. viabilidade celular% = absorvância média em poços de teste /absorvância média em poços de controlo × 100

Análise do ciclo celular e apoptose por citometria de fluxo

Células foi dado primeiro o pré-tratamento de 0,5 ^ M de DOX durante 24 h e, em seguida, foram tratados com LMB durante mais 48 h. Portanto, as células foram recolhidas depois de um total de 72 h de tratamento. Com base no ensaio de viabilidade de células, um total de 6 grupos de células A549 com diferentes tratamentos foram analisados, incluindo o controlo, 0,5 ^ M de DOX (pré-Dox), 1 nM LMB (LMB1), pré-DOX e LMB 1 nM (pré- DOX + LMB1), 5 nM LMB (LMB5), e pré-DOX e 5 nM LMB (pré-Dox + LMB5). Para a análise do ciclo celular, com um total de 2 x 10

5 células de cada grupo de tratamento foram colhidas e fixadas em etanol a 70% durante mais de 24 h a 4 ° C. As células foram coradas com Goiaba Reagente Ciclo Celular (Millipore) e executado em um Goiaba EasyCyte ™ Citómetro de fluxo (Millipore). Um total de 5 × 10

3 eventos foram contadas, e a percentagem de células na fase pré-G1, G0 /G1, S e G2 /M fases do ciclo celular foram determinados utilizando o software GuavaSoft (Millipore). Para a análise da apoptose, ensaio ViaCount foi realizada para determinar as células viáveis ​​e mortas. Resumidamente, a suspensão de células (5 × 10

5 células /mL) foi misturado com goiaba ViaCount reagente (Millipore), e a mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos para corar as células. As amostras de células coradas foram corridos num goiaba EasyCyte ™ Citómetro de Fluxo (Millipore). Um total de 5 × 10

3 eventos foram contadas e os dados foram adquiridos utilizando software de goiaba ViaCount (Millipore). Cada amostra foi corrida em triplicado e cada experiência foi repetida três vezes.

Western Blot

Os mesmos grupos 6 O tratamento das células A549, conforme descrito na citometria de fluxo foram analisados ​​por Western blot. As células de cada grupo foram submetidas a lise em tampão de lise RIPA em gelo. Os lisados ​​foram sonicadas e depois centrifugada a 13000 × g durante 5 min a 4 ° C, para recolher o sobrenadante. As concentrações de proteínas foram medidas utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad Bradford. Um total de 30 ug de proteína por amostra foi separado por 12% de SDS-poliacrilamida de electroforese em gel (SDS-PAGE) e em seguida, transferido para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). As proteínas imobilizadas foram então incubadas durante a noite a 4 ° C em tampão de bloqueio que continha 3% de leite em pó magro em 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 0,1% de Tween 20 (PBST, 1 ×). Após o bloqueio, as membranas foram sondadas com o anticorpo primário durante 1 h. A ligação do anticorpo foi detectada com burro anti-IgG de coelho-HRP a uma diluição de 1:1,000 durante 1 h à temperatura ambiente. Depois de uma breve incubação com ECL, os sinais sobre as membranas foram expostas a filmes de raios-X (FUJIFILM Corporation, Tóquio). análise digital Relativa densitométrica das bandas de proteína foram determinadas usando o software Quantity One (Bio-Rad) e normalizados pela intensidade do gene de manutenção (α-tubulina, 1:10,000 diluição) para cada amostra.

Efeitos de DOX e LMB em Proteína Nuclear perfil

Para avaliar os efeitos da DOX e LMB em proteínas, além daqueles na via p53, uma abordagem proteômica baseada em gel, electroforese em gel bidimensional-diferença (2D DIGE), foi o primeiro realizada para investigar perfis de proteínas nucleares após o tratamento LMB. manchas proteína que apresenta grandes mudanças foram identificados por espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC /MS /MS) e confirmada por Western blot. Alterações em proteína (s) foram ainda avaliadas em células com o tratamento combinado de DOX e LMB por Western blot.

Extracção proteína nuclear.

Para a análise proteómica, as proteínas nucleares foram extraídas como se segue os protocolos descrito por Lu

et al

[34]. Em resumo, com base no nosso estudo anterior [12], células A549 ou NCI-H358, tratada com controlo de veículo (0,1% de EtOH) ou 20 nM LMB durante 24 h (em duplicado), foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, colhidas, e suspensa em Tampão a arrefecido com gelo, contendo Tris-HCl 10 mM (pH: 7.4, Bio-Rad), 8 M de ureia (Bio-Rad), 4% (w /v) de 3 – [(3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanosulfonato (CHAPS, Bio-Rad), 0,5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, Bio-Rad), MgCl 2,5 mM

2 (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), 0,5 mM de PMSF (Santa Cruz Biotechnology), 1 mistura de inibidores de protease × (Roche, Basileia, Suiça), e 1% (v /v) de NP-40 (Corporação USB, Cleveland, OH). A mistura foi homogeneizada com uma agulha de calibre 21, seguido por centrifugação do homogenato a 700 × g durante 10 min a 4 ° C para precipitar os núcleos. Os extractos citoplasmáticos em sobrenadantes foram recolhidos e os sedimentos foram ressuspensos em 1 mL de gelo frio de tampão B (20 mM de Tris-HCl, pH 8,5 e 1 × protease cocktail inibidor), sonicada em gelo, e misturou-se com 0,737 g de ureia, 0,267 g tioureia e 0,07 g (w /v) de CHAPS. Após incubação em gelo durante 1 h, os sobrenadantes contendo extractos nucleares foram recolhidos por centrifugação a 100000 × g durante 1 h a 4 ° C. As concentrações de proteína foram medidas pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad). Determinou-se a qualidade de extracção nuclear, e a proteína identificada foi confirmada por Western blot. α-tubulina (presente no citoplasma) e histona 3 (presente no núcleo) foram usadas para validar e confirmar a pureza das frações de proteínas.

2D DIGE.

extrações proteína nuclear para 2D- DIGE foram executados como anteriormente descrito [35]. Em resumo, extração de proteínas nucleares de A549 ou células NCI-H358 com ou sem tratamento LMB (em duplicado) foram inversamente marcado com Cy3 e Cy5, respectivamente (GE Healthcare). Os tubos contendo 50 ug de cada amostra foram combinados com 1 mL de Cy3 ou Cy5 diluída (400 pmol /mL em N, N-dimetilformamida, Sigma). Após a centrifugação, a mistura foi deixada em gelo durante 30 minutos sem exposição à luz. Em seguida, a reacção foi parada pela adição de 1 ul de 10 mM de lisina (Sigma) e a colocação das amostras em gelo durante 10 min no escuro. As amostras (contendo 100 ug de proteínas) marcado com Cy3 e Cy5, foram diluídas até 300 ml por adição de tampão de reidratação 2D (BioRad) que consiste em ureia 8 M, CHAPS a 0,5%, ditiotreitol 10 mM (DTT, Bio-Rad), 0,2% de biolytes ampholyte, e traçar azul de bromofenol. As amostras foram, em seguida, aplicado a 17 cm tiras de pH imobilizado linear 3-10 gradiente (IPG) (BioRad), para re-hidratação durante a noite. A focagem isoeléctrica foi conduzida a 250 V durante 20 min, gradualmente aumentada para 10.000 dentro de 2,5 h, e foi mantida a 10.000 V para um total de 50.000 horas de tensão (Vh). tiras de IPG foram subsequentemente equilibrada com tampão I (6 M de ureia, 2% de SDS, 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20% de glicerol, DTT 130 mM, e de rastreio de azul de bromofenol) e tampão II (6 M de ureia, 2% SDS, 375 mM de Tris-HCl, 20% de glicerol, 135 mM de iodoacetamida, e rastreio de azul de bromofenol). As proteínas foram então separadas com 12% de gel SDS-PAGE e visualizadas utilizando um Typhoon Trio Imager (GE Healthcare) em comprimentos de onda de excitação de 532 e 633 nm para Cy3 e Cy5, respectivamente. As imagens foram manipuladas e analisadas por software ImageQuant DeCyder e (GE Healthcare); Foram calculadas as diferenças de intensidade de proteína para cada local em cada gel.

In-gel a digestão.

Os géis 2D foram coradas com SYPRO-RUBY (Bio-Rad). Manchas de interesse foram isolados utilizando uma máquina desbastadora local, e colocados num tubo de Eppendorf de 0,5 ml para a digestão com tripsina em uma PROGEST soluções (genómico) da estação de trabalho [35]. Em breve, tampões de gel foram lavados com DIH

2O, e tratou-se com acetonitrilo (ACN) durante 15 min. Os pedaços de gel foram re-hidratadas com DTT 10 mM e bicarbonato de amónio 0,1 M (NH

4HCO

3) durante 30 min a 60 ° C em banho de água. Seguindo o encolhimento novamente com ACN, uma solução contendo 55 mM de iodoacetamida (Bio-Rad) e 0,1 M NH

4HCO

3 foi adicionada durante 20 minutos sem exposição à luz, em seguida, substituído por 0,1 M NH

4HCO

3 durante 15 min. Os tampões de gel foram subsequentemente lavadas em 0,1 M de NH

4HCO

3, durante 5 minutos, enquanto a adição de um volume igual de ACN durante 5 min. Após a repetição do passo de lavagem, duas vezes, os pedaços de gel foram desidratados por ACN, e depois secou-se durante 30 min. pedaços de gel individuais foram re-hidratadas em tampão de digestão contendo 12,5 ng /mL de tripsina (Promega), 40 mM de NH

4HCO

3, e 10% de ACN a 37 ° C durante 4 h. O ácido fórmico foi adicionada para parar a reacção e o sobrenadante foi analisado directamente.

LC /MS /MS Identificação.

tripsinizadas péptidos foram analisados ​​por nano LC /MS /MS num ThermoFisher LTQ Orbitrap XL. Resumidamente, 30? L de hidrolisado foi carregado numa 5 ID mm x 75 uM C12 (Júpiter Proteo, Phenomenex) ventilada coluna a uma velocidade de fluxo de 10 mL /min. O gradiente de eluição foi realizado em um de 15 cm por 75 uM ID coluna C12 de 300 nL /min. Um gradiente de 30 min foi empregue. O espectrómetro de massa foi operado em um modo dependente de dados, e os seis íons mais abundantes foram selecionados para MS /MS. Os resultados de espectrometria de massa foram pesquisados ​​utilizando Mascot (www.matrixscience.com). As amostras foram processadas no algoritmo de andaime usando arquivos DAT gerados por Mascot. Parâmetros para dados LTQ Orbitrap XL exigem um mínimo de 2 peptídeo corresponde per proteína com probabilidades mínimas de 90% no nível de proteína.

Análises Estatísticas

ANOVA fatorial foi realizada para testar os efeitos da DOX e /ou as concentrações e tempos de incubação LMB sobre a viabilidade celular. análise Probit foi usado para calcular os 50% de concentração inibitória (IC50). Para os dados obtidos a partir de citometria de fluxo, as percentagens médias de células foram calculadas e a significância estatística foi determinada por meio de ANOVA de uma via e teste post hoc. Para os níveis de expressão de proteína entre controle, pré-DOX, LMB1, os testes post hoc de pré-DOX + LMB1, LMB5, e pré-DOX + LMB5, one-way ANOVA e Tukey foram utilizados para comparar a intensidade densitométrica das amostras individuais entre grupos. Para 2D DIGE, análise de imagens foi realizada com software DeCyder (GE Healthcare) e software ImageMaster. Para o software DeCyder, o diferencial em gel módulo de análise (DIA) foi utilizado para processar um par de imagens de um único gel, e realizar a detecção e quantificação local. A análise de variação biológica (BVA) foi utilizado para calcular os rácios entre as amostras e os controlos através da realização de uma correspondência de gel para gel do par de mapas no local de cada gel. As manchas com mais do que uma alteração de duas vezes em experiências duplicadas marcado com inversas em comparação com os controlos foram considerados como proteínas alvo. Todas as análises foram realizadas com software SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA) e diferenças com

P

. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

citotoxicidade de DOX ou LMB

O ensaio de MTT foi realizado para determinar a viabilidade celular em cada ponto de tempo. Como mostrado na Figura 1A e 1B, tanto DOX e a proliferação celular significativamente inibida LMB de A549 numa dose e forma dependente do tempo (

P

0,001). Os valores de IC50 de DOX e LMB às 48 h foram 2,2 uM e 10,6 nM, respectivamente (Tabela 1). Da mesma forma, tanto DOX e proliferação celular significativamente inibido LMB de NCI-H358 em uma dose e forma dependente do tempo (

P Art 0,001, Figura S1A e S1B)

A, citotóxicos. efeitos de DOX e a DOX sozinha + LMB sobre a viabilidade celular das células A549, conforme determinado pelo ensaio de MTT. Os dados são expressos como a percentagem em comparação com o controlo de veículo para DOX e LMB (0,5 nM) durante DOX + LMB. Os valores são representados como média ± DP, n = 6. B, efeitos citotóxicos de LMB sozinho e LMB + DOX sobre a viabilidade celular das células A549, conforme determinado pelo ensaio de MTT. Os dados são expressos como a percentagem em comparação com o controlo de veículo para LMB e DOX (0,5 uM) para LMB + DOX. Os valores são médias ± DP, n = 6. C, efeitos citotóxicos de DOX sozinha e pré-LMB + DOX sobre a viabilidade celular de células A549 a 48 h conforme determinado pelo ensaio de MTT. Os dados são expressos como a percentagem em comparação com o controlo de veículo para DOX e pré-LMB para pré-LMB + DOX. Os valores são médias ± DP, n = 6. D, os efeitos citotóxicos de LMB sozinho e pré-Dox + LMB sobre a viabilidade celular de células A549 a 48 h conforme determinado pelo ensaio de MTT. Os dados são expressos como a percentagem em comparação com o controlo de veículo para LMB e pré-DOX para pré-Dox + LMB. Os valores são médias ± DP, n = 6. Experiências realizadas em triplicado obtiveram resultados semelhantes.

citotoxicidade do Co-tratamento de DOX e LMB

Semelhante ao DOX ou LMB grupos, DOX + LMB (0,5 nM) ou LMB + DOX (0,5 uM) inibiu a proliferação A549 numa dose e forma dependente do tempo (

P

0,001, Figura 1A e 1B). No entanto, os tratamentos simultâneos de DOX + LMB (0,5 nM) ou LMB + DOX (0,5 ^ M) não alterou os efeitos citotóxicos sobre as células A549, em comparação com DOX sozinha ou LMB sozinho em ambos os 24 e 48 h (

P

0,05, Figura 1A e 1B). Os valores de IC50 de DOX + LMB (0,5 nM) e DOX + LMB (0,5 uM) durante 48 h foram 2,1 uM, e 10,4 nM, respectivamente (Tabela 1). Da mesma forma, os tratamentos simultâneos de DOX + LMB (0,5 nM) ou LMB + DOX (0,5 ^ M) não alterou os efeitos citotóxicos sobre as células NCI-H358, em comparação com DOX sozinha ou LMB sozinho em ambos os 24 e 48 h (

P

. 0,05, Figura S1A e S1B)

a citotoxicidade de pré-LMB + DOX ou pré-Dox + LMB

Como se mostra na Figura 1C, a LMB pré-tratamento de 0,5 nM não aumentar os efeitos citotóxicos da DOX em células A549 a 48 h, em comparação com DOX sozinha (

P

0,05). Os valores de IC50 com 48 h de pré-LMB + DOX e a DOX sozinha foi de 2,8 e 2,2 ^ M, respectivamente (Tabela 1). No entanto, o pré-tratamento de 0,5 ^ M de DOX aumentou significativamente o efeito citotóxico de LMB sobre células A549 a 48 h (

P

0,05, Figura 1D). A IC50 em 48 h de pré-Dox + LMB foi de 4,4 nM, que foi significativamente menor do que a de isoladamente LMB (10,6 nM,

P

= 0,037, Tabela 1). Além disso, ambos os pré-LMB ou pré-DOX não melhorou os efeitos citotóxicos de DOX ou LMB nas células NCI-H358 (

P Restaurant 0,05, Figura s1c e s1d).

Effects de DOX e LMB no ciclo celular e apoptose

de inibição da proliferação celular pode ser o resultado quer de paragem do ciclo celular ou apoptose, assim, estes dois aspectos foram ainda analisados ​​por análise de citometria de fluxo de células A549 depois de LMB tratamento e DOX. A análise do ciclo celular revelaram que a percentagem de células em G2 /M foram de 15,1 ± 0,4, 26,9 ± 2,8, 22,7 ± 1,0, 22,9 ± 4,2, 22,5 ± 2,8, e 18,6 ± 1,3 no controlo, pré-DOX, LMB1, pré -DOX + LMB1, LMB5, e pré-Dox + LMB5, respectivamente (Tabela 2). Pré-DOX, LMB1, pré-Dox + LMB1, LMB5, e pré-Dox + LMB5 todos resultou numa acumulação na fase G2 /M versus controlo (

P

0,05, Figura 2 e Tabela 2 ). Além disso, a análise do ciclo celular revelaram que a percentagem de células em pré-G1 foram de 5,4 ± 2,2, 9,0 ± 2,1, 8,2 ± 2,0, 18,6 ± 7,1, 10,2 ± 4,7, e 27,5 ± 2,8 no controlo, pré-DOX, LMB1, pré-Dox + LMB1, LMB5, e pré-Dox + LMB5, respectivamente (Tabela 2). Pré-DOX + LMB1 e pré-DOX + LMB5 resultou em um acúmulo definitiva na fase de pré-G1 contra não só o controle, mas também LMB sozinho (

P Art 0,01, Figura 2 e Tabela 2). Análise de apoptose revelaram que o tratamento LMB induziu significativamente a apoptose celular (

P

0,01, Quadro 2). A apoptose também foi aumentada após as células foram co-tratados com o pré-DOX e LMB comparação com LMB sozinho (

P

0,01, Quadro 2). A percentagem de células apoptóticas foram de 13,2 ± 1,6, 15,8 ± 2,6, 19,2 ± 2,4, 27,1 ± 0,6, 22,4 ± 4,0, e 29,6 ± 2,1 no controlo, pré-DOX, LMB1, pré-Dox + LMB1, LMB5, e pré -DOX + LMB5, respectivamente (Tabela 2).

histogramas representativos de análises do ciclo celular em células A549 e DOX-tratados LMB. De controlo, pré-DOX, LMB1, pré-Dox + LMB1, LMB5, e pré-Dox + LMB5 foram colhidas e marcadas com goiaba Reagente ciclo celular (Millipore) e analisadas por citometria de fluxo (pré-G1, G0 /G1, S, e G2 /M). O eixo dos y mostra o número de células contadas e o eixo dos X mostra uma quantidade crescente de goiaba Reagente Ciclo Celular incorporação /célula (esquerda para a direita). Experiências realizadas em triplicado produziu resultados semelhantes. LMB1: 1 nM LMB, LMB5:. 5 nM LMB

Análises de Western blot de p53, Phospho-p53 (Ser15), Phospho-p53 (Thr55), p21 e expressão da proteína survivina depois de DOX e Tratamento LMB

os níveis de expressão de p53, fosfo-p53 (Ser15), e p21 (um alvo a jusante de p53) foram significativamente aumentada em células tratadas com pré-DOX + LMB do que os dos controlos e mostrou um efeito de dose-resposta significativa (Figura 3A). Os níveis de expressão relativa de proteína p53 (unidades arbitrárias) foram 0,02 ± 0,00, 0,03 ± 0,00, 0,07 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,45 ± 0,01 e 0,44 ± 0,00 no controlo, pré-DOX, LMB1, pré-Dox + LMB1, LMB5, e pré-DOX + LMB5, respectivamente (Figura 3B,

P

. 0,05, LMB1

vs

controle;

P Art 0,01, pre -DOX + LMB1, LMB5, ou pré-DOX + LMB5

vs.

controle). Os níveis relativos de expressão de proteína de fosfo-p53 (Ser15) (unidades arbitrárias) foram 0,06 ± 0,00, 0,06 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,15 ± 0,01, 0,21 ± 0,01 e 0,77 ± 0,04 no controlo, pré-DOX, LMB1 , pré-DOX + LMB1, LMB5, e pré-DOX + LMB5, respectivamente (Figura 3B,

P Art 0,05, LMB5

vs

controle;.

P

0,01, pré-Dox + LMB5

vs controle).. Além disso, a sobre-regulação de fosfo-p53 (Ser15) na pré-Dox + LMB5 foi significativa em comparação com o grupo LMB5 (

P

0,01). Os níveis de expressão relativa de proteína p21 (unidades arbitrárias) foram 0,29 ± 0,08, 0,69 ± 0,01, 0,85 ± 0,09, 1,07 ± 0,03, 1,14 ± 0,08 e 1,57 ± 0,02 no controlo, pré-DOX, LMB1, pré-Dox + LMB1 , LMB5 e pré-Dox + LMB5, respectivamente (Figura 3B,

P

0,01, pré-DOX, LMB1, pré-Dox + LMB1, LMB5, e pré-Dox + LMB5

vs.

controle). Além disso, o aumento da regulação do p21 na pré-DOX + LMB5 foi significativa (

P Art 0,05). Comparação com o grupo LMB5

A, Efeitos da pré-DOX + tratamento LMB sobre a expressão de proteína de p53, fosfo-p53 (Ser15), fosfo-p53 (Thr55), p21, e a survivina em A549. As células foram tratadas com 0,5 uM de DOX 24 h antes do tratamento com LMB (1 nM ou 5 nM). Depois de 48 h de tratamento LMB, as células foram colhidas para análise de Western blot para determinar os níveis de proteína. Blots também foram sondadas para α-tubulina para confirmar carga igual de proteína. B, as intensidades relativas de proteína de p53, p53 (fosfo-Ser15), fosfo-p53 (Thr55), p21, e a survivina, em comparação com a intensidade de α-tubulina. A intensidade de cada banda foi quantificada utilizando Quantity One Software. Os dados são médias ± DP, n = 3. Os experimentos foram realizados em triplicado. LMB1: 1 nM LMB; LMB5: 5 nM LMB; *,

P Art 0,05 em relação ao controle; **,

P Art 0,01 em relação ao controle; #,

P

0,05, comparado com LMB5; ##,

P

. 0,01, em comparação com LMB5

Ao contrário do p53, fosfo-p53 (Ser15), e os níveis de expressão de p21, fosfo-p53 (Thr55) e survivina (outro alvo a jusante de p53) foram significativamente os níveis de expressão e dependente da dose diminuiu nas células tratadas com pré-Dox + LMB em comparação com as dos controlos (Figura 3A). Os níveis relativos de expressão de proteína de fosfo-p53 (Thr55) (unidades arbitrárias) foram 0,67 ± 0,06, 0,56 ± 0,01, 0,65 ± 0,01, 0,57 ± 0,00, 0,56 ± 0,01 e 0,42 ± 0,00 no controlo, pré-DOX, LMB1 , pré-DOX + LMB1, LMB5, e pré-DOX + LMB5, respectivamente (Figura 3B,

P

. 0,01, pré-DOX + LMB5

vs

controle). Os níveis de expressão relativa de proteína de survivina (unidades arbitrárias) foram 0,28 ± 0,02, 0,23 ± 0,03, 0,23 ± 0,05, 0,14 ± 0,01, 0,12 ± 0,05 e 0,08 ± 0,00 no controlo, pré-DOX, LMB1, pré-Dox + LMB1, LMB5, e pré-DOX + LMB5 grupos, respectivamente tratados (Figura 3B,

P

. 0,05, pré-DOX + LMB5

vs

controle).

Efeitos de DOX e LMB no perfil proteico Nuclear

Extração proteína nuclear.

a pureza das proteínas nucleares e citoplasmáticos foi testada usando análise de Western blot com anti-histona 3 e anti-α-tubulina . A maioria dos α-tubulina foi encontrado apenas na fracção citoplasmática de células A549 e NCI-H358; histona 3 foi encontrado apenas na fração nuclear de A549 e as células NCI-H358, sugerindo que a preparação foi enriquecida para as proteínas nucleares (Figuras 4A e S2A).

A, Western blot de extração de proteínas nucleares e citoplasmáticos de A549; α-tubulina serviu como um controlo interno para as proteínas citoplasmáticas, e histona 3 serviu como um controlo para as proteínas nucleares. B, 2D DIGE análises de proteínas nucleares em células A549 e vistas em 3D de SQSTM1 em células A549 com o controle do veículo ou tratamento LMB. As proteínas nucleares tratados com LMB ou veículo de controlo foram marcados com Cy3 (canal verde) e Cy5 (canal vermelho), respectivamente. proteínas nucleares foram separadas com base no ponto isoelétrico (PI, eixo horizontal) e peso molecular (MW, o eixo vertical). Os dados são médias ± DP.