Abstract

intratumoral heterogeneidade (ITH) leva a uma subestimação da paisagem mutacional retratado por uma única agulha de biópsia e, consequentemente, afeta a precisão do tratamento. A extensão do cancro (CRC) ITH genética colorectal não é bem compreendido em pacientes chineses. Assim, realizamos profunda sequenciamento utilizando o OncoGxOne

™ painel Além disso, a segmentação 333 genes específicos do cancro em biópsias de multi-região de tumores metastáticos primárias e fígado de três pacientes CRC chineses. Determinou-se que a extensão da ITH variou entre os três casos. Em média, 65% de todas as mutações detectadas eram comuns dentro dos tumores individuais.

KMT2C

aberrações e

NCOR1

mutação eram os únicos eventos ubíquos. análise filogenética subsequente revelou que os tumores desenvolveram de uma forma ramificada. Comparação dos tumores primários e metastáticos revelou que

ppp2r1a

(E370X),

SETD2

(I1608V),

SMAD4

(G382T), e

AR

mutações no local splicing podem ser específicos para câncer metastático de fígado. Estas mutações podem contribuir para a iniciação e progressão de metástases à distância. Colectivamente, a nossa análise identificou um nível substancial de ITH genética no CRC, que devem ser considerados para estratégias terapêuticas personalizadas

Citation:. Lu YW, Zhang HF, Liang R, Xie ZR, Luo HY, Zeng YJ, et ai. (2016) Colorectal Cancer Heterogeneidade genética delineada por Multi-Região Sequencing. PLoS ONE 11 (3): e0152673. doi: 10.1371 /journal.pone.0152673

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 23 de novembro de 2015; Aceito: 17 de março de 2016; Publicação: 29 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Lu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Dados Sequencing estão disponíveis a partir da sequência Recuperar Archive (SRA) do banco de dados (número de acesso SRP065361)

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Medicina Talent Leading da província de Yunnan (No. L-201.205) KHW, Fundação de Yunnan Instituto de Doenças do Aparelho digestivo (No. 2014NS122) KHW, Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Yunnan-Kunming University Medical (NO. 2015FB100) HFZ, National Natural Science Foundation da China (81.460.007) XYK. https://www.nsfc.gov.cn/. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 1,2 milhões de novos casos e 600.000 mortes por ano [1]. CRC é o terceiro câncer mais prevalente e a quinta maior causa de morte por câncer na China. A incidência de CRC também tem aumentado na população chinesa nos últimos anos [2]. Embora um progresso considerável tem sido feito em relação ao tratamento CRC, incluindo terapia-alvo, a sobrevivência relativa de cinco anos de pacientes com metástases à distância é de apenas 12,5% [3]. Por conseguinte, um grande conhecimento da biologia molecular de CRC é altamente desejável. Estes novos insights seria posteriormente melhorar o tratamento do CRC.

intratumoral heterogeneidade (ITH) leva a uma subestimação da paisagem mutacional retratado por uma única agulha de biópsia e, consequentemente, afeta a precisão do tratamento. Com o desenvolvimento de sequenciamento de última geração (NGS), ITH foi recentemente esclarecido em pormenor substancial em vários tipos de câncer [4-7], incluindo CRC [8, 9]. Kim et al. [8] realizado biópsias multi-região de regiões metastáticos primárias e fígado a partir de cinco CRCs através de sequenciação de todo o exome e observaram que apenas 19,8% -53,9% das mutações em uma dada amostra foram universal. Eles também identificaram

APC

,

KRAS

, e

TP53

mutações em todas as biópsias regionais. A cobertura sequenciamento de seu estudo é relativamente baixo, o que pode levar a ignorar a mutação de baixa frequência. Considerando que, no estudo Kogita [9], eles só alvo 50 genes do câncer e, portanto, a identificação da extensão da CRC ITH genética foi limitado. Além disso, a extensão da CRC ITH genética não foi estabelecida em pacientes chineses.

Foi realizado sequenciamento cobertura profunda, utilizando o Kit SureSelect alvo enriquecimento e OncoGxOne

™ painel Além de DNA a partir de biópsias multi-região de tumores primários e metastáticos do fígado de três pacientes CRC chineses para caracterizar CRC ITH em pacientes chineses. Nós determinamos a paisagem mutação e identificou o nível substancial de ITH genética no CRC.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras

Três pacientes com carcinoma de cólon primário multi-regionais cirurgicamente ressecado no Hospital das primeiras pessoas da província de Yunnan, entre Outubro de 2013 e abril 2014 foram incluídos no estudo. estadiamento do tumor patológico foi conduzido de acordo com a classificação TNM (Tabela 1). Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital das primeiras pessoas da província de Yunnan (2014YXLH029). Todos os pacientes do estudo forneceu consentimento informado por escrito para o uso de tecido ressecado.

isolamento de ADN

Os espécimes, fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE) foram submetidos a avaliação histológica , foram seleccionados apenas os que contêm células tumorais suficiente (pelo menos 70% de células tumorais), como determinado por coloração com hematoxilina e eosina, e os tecidos normais correspondentes para o isolamento de ADN. O ADN genómico foi isolado usando o QIAamp

® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o procedimento do fabricante com ligeiras modificações. amostras de ADN genómico foram quantificados usando o espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Agilent, Santa Clara, CA, EUA). O ADN isolado foi armazenado a -80 ° C até análise.

testes de microssatélites

A instabilidade de microssatélites status (MSI) foi determinada para cada caso, utilizando cinco mononucleotídicos ou dinucleótido marcadores microssatélites (BAT25, BAT26, D17S250, D2S123 e D5S346) [10]. Iniciadores foram 5′-etiquetado com HEX, FAM, ou TET (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China). Todos os loci foram amplificados a partir de microssatélites ADN normal e tumoral combinados através de reacção em cadeia da polimerase em multiplex fluorescência (PCR). Em seguida, os produtos de PCR foram sequenciados no sequenciador automatizado ABI 3730XL usando um software de análise de fragmentos (Gene Scan Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). estabilidade marcador microssatélite foi analisada utilizando o software GeneMapper. O estado MSI foi classificada como MSI-alto se ≥30% dos marcadores eram instáveis, MSI-baixa se. 30% dos marcadores eram instáveis, e há mudanças ou picos adicionais para estável microssatélite (MSS) cancro do cólon

alvo enriquecimento e sequenciamento

enriquecimento sequência de amostras e biblioteca preparação foi conduzida usando o SureSelect alvo enriquecimento Kit (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) e OncoGxOne

™ painel câncer Plus (GENEWIZ, Inc ., South Plainfield, NJ, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. OncoGxOne Além disso, um painel de oncologia alvo, contém 333 genes específicos do cancro (incluindo todos os genes do controlador de câncer conhecidos e 64 genes-alvo e quimioterapia relacionadas). Resumidamente, 200 ng de ADN genómico a partir de cada amostra foi fragmentado por cisalhamento acústica num instrumento Covaris. As fracções de 150-200 pb foram ligados ao adaptador SureSelect Oligo e amplificado por PCR durante 10 ciclos. Para o enriquecimento de alvo, a totalidade da biblioteca foi hibridizada utilizando o kit de captura de SureSelect Oligo durante 16 ou 24 h a 65 ° C. híbridos biotinilados foram capturados, e as bibliotecas enriquecidas foram concluídas com menos de 16 ciclos de PCR. As bibliotecas resultantes foram purificadas reunidas e sequenciado usando o Ilumina

® MiSeq

™ instrumento NGS durante 2 × 150-fim emparelhado sequenciação lê (Illumina, San Diego, CA, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante. Os genes no OncoGxOne

™ painel câncer Plus são listadas na Tabela S1.

Bioinformatics análise

Os dados de sequenciação foram acessados ​​através do Reporter MiSeq. A qualidade dos dados foi verificada usando FastQC (https://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) e, em seguida alinhado para o genoma humano de referência (hg19) utilizando a ferramenta de alinhamento Burrows-Wheeler para gerar um bam arquivo [11]. Variante de chamada foi conduzida usando o Genome Analysis Toolkit, por padrão [12]. chamadas variantes matérias foram filtradas usando freqüências alélicas 5% e alterada lê 7X. Em seguida, as variantes resultantes foram anotados pelo Illumina Variant Studio versão 2.2.3 (Illumina, San Diego, CA, EUA) e ANNOVAR [13]. polimorfismos de nucleotídeo único conhecidos foram excluídos usando variantes inthedbSNP 137 (hg19) [14] e SNPs apresentados nos dados de 1000 genomas. Os potenciais mutações germinais foram sequenciados em tecidos normais correspondentes.

A análise filogenética

Nós inferir relações ancestrais entre tumores primários e metástases do paciente 3 por perfis de mutação. árvores Neighbor foram construídos como previamente descrito por Kim et ai. [8], com algumas modificações. Usamos phytools [15] para calcular distâncias vizinhos e algoritmo do vizinho implementadas no pacote PHYLIP [16] software para inferir a árvore filogenética.

Resultados

Visão geral dos dados NGS

Três pacientes de CRC (P1, P2, e P3) foram incluídos neste estudo. Em seguida, as amostras 10 a partir de 3 pacientes foram sequenciados, com uma cobertura média de 250 leituras. Foram identificados ~ 8.000 variações de nucleotídeo único somáticas (SNVS) (4.444 a 8.348) e ~ 850 (457 a 1154) inserções e deleções somáticas (indels) nas amostras de biópsia a partir de 10 casos de CRC 3 (Tabela 2).

paciente 1 |

Um homem de 62 anos de idade, foi diagnosticado com câncer de cólon MSS, com 3,5 cm × 3 cm × 1,2 centímetros tumor. Duas regiões (P1-1 P1-2) e de tumor primário exibiu um adenocarcinoma moderadamente diferenciado, e a fase patológico do tumor era T2N1M0. O paciente não recebeu nenhum tratamento prévio.

As mutações pontuais somáticas e nonsynonymous indels que levam a alterações de proteínas encontram-se resumidos na Tabela S2. Suas distribuições em diferentes regiões do tumor foram mapeados (Fig 1A). Por comparação dos espectros de mutação entre regiões primárias, determinou-se que 24% (11/45) das mutações eram específicos para P1-1, ao passo que 13% (6/45) das mutações eram específicos para P1-2. Os restantes 63% das mutações foram partilhados por ambas as regiões. Ao comparar o nosso resultado com os 127 genes mutantes significativamente identificados pelo Kandoth et al. [17], determinamos que P1-1 e P1-2 continha

APC

(428_429del),

KIT

(A755T),

KMT2C

(R909K, C391X, G315S D348N, P309S e .Y816_I817delinsX),

NCOR1

(S63L),

ARN

(G12D), e

PIK3CG

mutações (K344Q). P1-1 continha sete mutações adicionais, ou seja,

APC

(Q706X),

KMT2D

(3860_3861del),

KMT2C

(S338L, K306fs, e uma mutação sítio de splicing)

BRCA2

(T3030fs), e

ErbB4

mutação sítio de splicing. P1-2 continha outro

AR

(57_58del) mutação.

A ITH genética em Paciente 1. A distribuição regional de 45 variantes somáticas em 3 regiões do tumor primário (P1-1 e P1-2 ); B genética ITH na Paciente 2. A distribuição regional de 33 variantes somáticas em 3 regiões do tumor primário (P2-1, P2-2 e P2-3); C ITH genética em Paciente 3. A distribuição regional de 58 variantes somáticas em 3 primária e 2 regiões metastáticos. O mapa indica a presença de calor (cinza) ou ausência (azul escuro) de uma mutação em cada região. As barras coloridas acima do mapa de calor especificar as categorias de mutações.

O paciente 2

Uma mulher de 60 anos de idade, foi diagnosticado com câncer de cólon MSS, com 3,8 cm x 3,5 cm × 1,2 cm tumor. Três regiões (P2-1, P2-2 e P2-3) do tumor primário exibiu uma histologia moderadamente diferenciado e metástase lobo direito do fígado. Múltiplas metástases linfáticas (PN2) foram detectados, eo estágio patológico do tumor era T2N4M0. O paciente não recebeu nenhum tratamento prévio.

para o paciente 2, foi realizado resequenciamento alvo de ADN de três regiões de tumor primário. Este processo revelou 25 mutações pontuais nonsynonymous e 8 indels (S2 tabela). As suas distribuições em diferentes regiões de todo o tumor foram mapeados (Fig 1B), como descrito por Gerlinger et ai. [5]. Distinguimos os 33 mutações em 23 mutações ubíquos (aquelas que apresentaram em todas as regiões em cada CRC), 6 mutações privadas (aquelas que apresentou em apenas uma região), eo resto chamadas mutações compartilhadas. Em média, um único biópsia exibiu 28 mutações somáticas, sendo responsável por 85% de todas as mutações observadas neste tumor. As paisagens de mutação das diferentes regiões eram altamente semelhantes entre si.

Foram identificados vários genes significativamente mutantes, incluindo

ATRX

(P571A),

CHEK2

(P358S),

KDM6A

(A1038T),

NCOR1

(N208K, S63L),

KMT2C

(A746S, G892R, P309S, R909K, D348N, e Y816_I817delinsX), e

AR

(57_59del), que eram mutações ubíquos. O

TGFBR2

(E125fs) era específico para P2-1,

SETD2

(I1608V) mutação era específico para P2-2,

TP53

(T218P),

KMT2C

(K339N) era específico para P2-3.

APC

(L693fs) e TP53 (R89W) foi compartilhado por P2-2 e P2-3.

NCOR1

(K85N) foi compartilhado por P2-2 e P2-1.

KMT2C

(Q755X) é compartilhada por P2-1 e P2-3.

O paciente 3

Uma mulher de 71 anos de idade, foi diagnosticado com MSS-alta e moderadamente cancro do cólon diferenciada, com 9 cm × 5 cm × 3 cm do tumor primário e um 1,5 cm metástases lobo hepático × 1 cm × 0,5 cm direita. Três regiões (P3-1, P3-2 e P3-3) do câncer primário e duas regiões metastáticos foram ressecados, eo estágio patológico do tumor era T3N2M2. O paciente não recebeu nenhum tratamento prévio. Para esse paciente, resequenciamento alvo foi realizado no ADN de três regiões (P3-1, P3-2, e P3-3) do tumor primário e duas regiões metastáticas. O processo revelou 47 mutações pontuais nonsynonymous e 11 indels (S2 tabela). Suas distribuições em diferentes regiões do tumor foram mapeados (Fig 1C).

Foi construída uma árvore filogenética (Figura 2), que mostrou uma ramificado, em vez de uma linear, a evolução do tumor, para representar a história evolutiva dos o CRC. P3-2 mutação espectros eram mais semelhantes a L1 e L2, indicando que as origens de metástases à distância poderia ser atribuída a um dos sítios primários.

comprimentos dos ramos da árvore são proporcionais ao número de mutações nonsynonymous em os ramos correspondentes.

no geral, sequenciamento alvo identificadas 45 mutações somáticas por biópsia, sendo responsável por 78% de todas as mutações observadas neste tumor. 60% de todas as mutações detectadas por sequenciação de regiões múltiplas no espécime colectomia eram mutações ubíquos presentes em todas as regiões. Quando analisamos o câncer primário, uma média de 45 mutações somáticas foram detectados por biópsia, que respondeu por 87% de todas as mutações identificadas neste tumor. Para os sítios metastáticos, uma única biópsia revelou 92% de todas as mutações detectadas neste tumor.

Nos genes mutados significativamente, determinamos que

KRAS

(G13D),

PIK3CA

(E545),

TP53

uma mutação sítio de splicing,

APC

(E854fs),

KMT2C

(E141G, K339N, P309S e Y816_I817delinsX),

SETBP1

(Q1558L), e

NCOR1

(S63L) eram mutações onipresentes, enquanto que

CDKN2A

(D74A),

SMAD4

(W168X),

NCOR1

(N208K),

KMT2C

(G315C e K306fs) e

INHBA

(V58I) eram específicos para o câncer primário.

ppp2r1a

(E370X),

SETD2

(I1608V),

SMAD4

(G382T), e

AR

splicing mutações no local eram específicos de câncer metastático de fígado . No entanto, estas mutações estavam ausentes nas regiões cancro primário. O

KRAS

,

TP53

, e

PIK3CA

mutações, que têm sido frequentemente utilizados como biomarcadores moleculares no CRC, também apresentou em todas as regiões.

mutações específicas do tumor metastático

ao comparar a paisagem mutação entre regiões primários e metastáticos, verificamos que várias mutações eram específicas para as regiões metastáticos. SMAD4 é um transdutor chave de factor de crescimento transformante-β superfamília de sinalização, que regula a proliferação celular, a diferenciação e a apoptose [18]. Perda de Smad4 está correlacionada com CRC metástase [19-21]. Enquanto isso, AR pertence a uma família de receptores nucleares que funcionam como factores de transcrição. Ar tem sido demonstrado que regulam a migração de células através da supressão do factor nuclear kappa B /matriz metalopeptidase e mais 9 via inibição da metástase de carcinoma hepatocelular [22, 23]. variantes de splice AR são conhecidos para promover a metástase do tumor [24]. O

gene ppp2r1a

codifica a subunidade estrutural do enzima de PP2A, o que é uma fosfatase de serina /treonina altamente conservadas que serve uma vasta gama de funções biológicas, incluindo a regulação negativa da transdução de sinal, progressão do ciclo celular [25] e expressão do gene. Ppp2r1a facilita interações células endoteliais células-linfática do tumor durante a metástase de células de melanoma [26].

Discussão

O multi-região de análise de mutação paisagem dos três tumores CRC forneceu evidência substancial de ITH, com o medida de ITH variando entre os três casos. No paciente 1, que sequenciou dois locais separados espacialmente de câncer primário. Os espectros de mutações exibiram uma sobreposição de 63%. No paciente 2, uma única biópsia exibiu 28 mutações somáticas, em média, respondendo por 85% de todas as mutações observadas neste tumor. Em contraste, no paciente 3, de 78% de todas as mutações foram observados neste tumor. De todas as mutações somáticas reveladas por sequenciação de multi-região, 30% a 40% eram heterogéneos e, portanto, não pode ser detectado em todas as regiões sequenciadas. Kim et al. [8] determinaram que 46% -80% das mutações foram indetectáveis ​​em todos os biópsias regionais na sua coorte. O nível de ITH genética nas suas amostras foi maior do que no nosso. Os resultados de sequenciamento dos cânceres primários de pacientes 1 e 2 foram mais semelhantes entre si do que os das amostras do estudo acima mencionado. Estes resultados implicam que biópsias de tumores individuais não pode representar com precisão paisagem mutacional genômica de um tumor, o que afeta significativamente terapia-alvo.

Foi construída uma árvore filogenética usando os dados do paciente 3. A árvore indicou que CRC evoluiu em um ramificada , em vez de uma forma linear, forma. O modelo de evolução ramificada foi validado em muitos tipos de cancro [27], incluindo [8] CRC. Tradicionalmente, CRC é considerada a evoluir de uma forma linear [28]. Estudos recentes mostraram que ambos os modelos de evolução existir no CRC [29].

evolução do tumor ramificada sublinha a necessidade de direcionar mutações localizadas no tronco principal da árvore filogenética. Nós determinamos que

KMT2C

e

NCOR1

(S63L) foram mutados em todas as regiões em comparação com os genes mutados significativamente relatados por Kandoth et al. [17]. KMT2C é um membro da trithorax /de linhagem mista de leucemia humana familiar [30] e está envolvida na modificação das histonas.

KMT2C

é freqüentemente alterada em muitos tipos de cancro, incluindo o cancro do fígado [31], carcinoma de células escamosas cutâneo [32], e câncer de células escamosas do esôfago [33]. Em nossa pesquisa, concluímos que cada paciente tem pelo menos sete mutações no

KMT2C

, o significado clínico dos quais continua a ser validado. Observou-se também um

NCOR1

mutação sem sentido. NCOR1 é um co-repressor de receptores nucleares 270 K [34] que participa na repressão transcricional dependente do ligando pelo receptor de estrogénio α [35].

KMT2C

e

NCOR1

podem representar dois genes segmentáveis ​​potenciais na definição de heterogeneidade.

KRAS

,

TP53

e

PIK3CA Quais são os genes mais significativamente mutantes no CRC [36]. No entanto, apenas paciente 3 teve estas mutações em nossa coorte. Estas mutações foram identificadas em todas as regiões obtidas a partir do paciente e mostrou alta concordância entre o primário e metastático combinados CRC. Este resultado é consistente com a de Brannon et ai. [37]. Os espectros de mutação câncer primário representar fielmente os das lesões metastáticas em termos de biomarcadores CRC previstos atualmente disponíveis.

ppp2r1a

(E370X),

SETD2

(I1608V),

SMAD4

(G382T), e

AR

splicing mutações no local foram determinados como sendo potenciais mutações específicas do tumor metastático. Supomos que estas mutações podem conduzir CRC metástase. Dada a dimensão limitada da amostra, a frequência destas mutações em metástases CRC deve ser avaliada em uma coorte maior. estudos funcionais adicionais são necessárias para enfrentar seus papéis no CRC metástase.

análise genômica de biópsias por agulha individuais podem subestimar a paisagem mutacional de tumores heterogêneos. ITH pode explicar em parte os pobres validação de biomarcadores CRC devido ao viés de amostragem. Reconstruir a estrutura clonal de tumores e identificação das alterações ubíquos localizados no tronco da árvore filogenética pode contribuir para a descoberta de biomarcadores mais eficazes e abordagens terapêuticas.

Em conclusão, foi identificada a extensão substancial de TIS na CRC. No contexto deste fenómeno, determinou-se que o CDC evoluiu de forma ramificada e vários eventos moleculares pode contribuir para a progressão da CRC. Nós investigamos apenas três casos por causa de restrições financeiras. Novos estudos com grandes amostras devem ser realizados para confirmar estes resultados.

Informações de Apoio

Tabela S1. lista gene Cancer OncoGxOneTMPlus

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152673.s001

(PDF)

S2 Table. alterações genéticas por paciente

doi: 10.1371. /journal.pone.0152673.s002

(XLSX)