Abstract

Vários estudos têm trazido cada vez mais provas para apoiar a hipótese de que miRNAs desempenhar um papel central em vários processos de carcinogênese, incluindo o crescimento celular, apoptose, diferenciação e metástase. Neste estudo, foram investigados o papel potencial de miR-31 em cancro colorrectal (CRC), agressividade e os seus mecanismos subjacentes. Descobrimos que miR-31 aumentou em células CRC originado de focos metastáticos e tecidos CRC primários humanos com metástases linfáticas. Além disso, a expressão de alto nível de miR-31 foi significativamente associada com um fenótipo de prognóstico mais agressivo e pobre de pacientes com CRC (

p Art 0,05). O estábulo sobre-expressão de miR-31 em células CRC foi suficiente para promover a proliferação celular, invasão e migração

in vitro

. Ele facilitou o crescimento de tumores e metástases

in vivo

também. Outros estudos mostraram que o miR-31 pode ligar-se directamente à região 3’untranslated (3’UTR) de ARNm e subsequentemente SATB2 reprimir tanto do ARNm e da proteína de SATB2. A expressão ectópica de SATB2 por transientemente transfectadas com o vector pCAG-SATB2 que codifica toda a sequência de codificação SATB2 poderia reverter os efeitos do miR-31 no CRC tumorigénese e progressão. Além disso, a sobre-expressão ectópica de miR-31 em células de CRC induzidas transição epitelial-mesenquimal (EMT). Nossos resultados ilustrado que o aumento da regulação do miR-31 desempenhou um papel importante na proliferação de células CRC, invasão e metástase

in vitro

e

in vivo

através repressor directo SATB2, sugerindo um potencial aplicação de miR-31 na previsão do prognóstico e aplicação terapêutica no CRC

citação:. Yang MH, Yu J, Chen N, Wang XY XY Liu, Wang S, et al. (2013) Elevated MicroRNA-31 Expressão Regula Colorectal Cancer Progressão reprimindo seu alvo Gene SATB2. PLoS ONE 8 (12): e85353. doi: 10.1371 /journal.pone.0085353

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de agosto de 2013; Aceito: 25 de novembro de 2013; Publicação: 30 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81000953, 81172242, 81071735), os projetos principais da National Science Foundation Natural da China ((n. 81.090.422), Programa de Key State of National Natural Science Foundation da China (U1201226), Programa nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa, No. 2010CB529402), Programa chave da National Science Foundation Natural de Guangdong, China (2010B031500012) e nacional de Ciências Naturais da Fundação de Guangdong, China (10451051501004710). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo , coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

competir interesses:. Todos os autores leram o papel e aprovados de enviá-lo para PLoS ONE os autores declararam que não existem interesses conflitantes..

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é um dos cancros mais comuns no mundo. Embora vários tipos de tratamentos têm sido desenvolvidas recentemente para os pacientes com CCR, prognóstico pobre continua a ser em pacientes com CCR avançado [1]. A maioria das mortes CRC ter sido associado com a invasão tumoral e metástases. Assim, a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à CRC metástase é de importância crucial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para pacientes avançados CRC.

microRNAs (miRNAs) são uma classe abundante de altamente conservada, short, regulamentar (cerca de 22 nt) RNAs não-codificantes que são amplamente expressos em organismos vivos. Ligam-se o 3 ‘UTR do mRNA, fazendo com que qualquer molécula de ARNm ou inibição de degradação de translação [2]. miARNs têm diversas funções, incluindo a regulação da diferenciação celular, proliferação e apoptose [3,4]. Portanto, muito poucos estudos têm relatado o papel central dos miRNAs nos múltiplos processos de carcinogênese, incluindo metástase [3,5,6]. Além disso, a expressão análises revelaram assinaturas miRNA característicos em cancros humanos específicos [7-9].

Vários investigadores relataram que miR-31-regulada no CRC [10-12] e carcinoma epidermóide de língua [13], mas regulada no cancro da mama [14], câncer gástrico [15], mesotelioma maligno [16] e câncer pancreático [17] utilizando qRT-PCR. Mas, o significado prognóstico clínico, função e atividade regulatória de miR-31 em CRC não foram totalmente compreendidos. Neste estudo, exploramos a função não ambígua de miR-31 em CRC e descobriram que a sobre-regulação de miR-31 estava associada com os fenótipos agressivas de CRC e mau prognóstico em pacientes. Investigações posteriores revelaram que a expressão excessiva de miR-31 em CRC levou a aumentar a proliferação de células tumorais e motilidade

in vitro

e

in vivo

. O presente estudo determina um papel positivo de miR-31 na carcinogênese, invasão e migração, através de reprimir a expressão SATB2 no CRC.

Materiais e Métodos

Ética declaração

A utilização de tecidos para este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Nanfang Hospital, Southern Medical University. Todos os pacientes assinaram o consentimento informado antes do uso destes materiais clínicos para fins de investigação. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Southern Medical (número de autorização: SYXK2011-0074). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Preparação do tecido e de cultura de células

,, amostras de tecido de tumor colorretal embebidos em parafina frescos e fixados em formol foram obtidos de pacientes com diagnóstico de CRC primário e, em seguida, passou por uma cirurgia eletiva em Nanfang Hospital, Southern Medical University (Guangzhou, China). A utilização de tecidos para este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Nanfang Hospital, Southern Medical University. Um total de 31 casos de tecido fresco CRC foram recém-congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. E 143 casos de amostras de tecido CRC arquivados foram coletadas e usadas na investigação clínico-patológico e prognóstico do miR-31. Nenhum paciente recebeu qualquer quimioterapia pré-operatória ou radioterapia. Um conjunto abrangente de dados clínico-patológicos foram possuídos, incluindo idade, sexo, tamanho do tumor primário, a diferenciação tumoral, estádio, metástases em linfonodos e metástases à distância. Acompanhamento completo, variando de 1-96 meses, estava disponível para a coorte de 143 pacientes, sendo que a sobrevida mediana foi de 56 meses.

As células de rim embrionário humano 293T e as linhas de células CRC humanos DLD-1 , HCT116, SW480, SW620, Lovo foram obtidos a partir de um banco de células da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Em estudos anteriores, nós descrevemos um subclone chamado M5 com habilidades metastáticos reforçada no fígado. Nós também descreveram um subclone chamado SCP 51 com altas habilidades metastáticos no nó de fígado e linfa. Estes subclones foram isolados por

in vivo

selecção de células SW480 através de um processo descrito em estudos anteriores [18-20]. Todas as linhas celulares de CRC foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD, EUA) com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, EUA) e 100 U /ml de penicilina /estreptomicina (Gibco). Eles foram mantidos numa câmara humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C. 293T foi mantida em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com FBS a 10%.

Isolamento de ARN e quantitativa PCR em tempo real

O ARN total foi extraído com Reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Sintetizou-se ADNc com o kit de reagentes PrimeScript RT (Promega, Madison, WI, EUA). Um quantitativa haste-laço RT-PCR foi realizado para detectar a expressão de maturidade miR-31 com a ABI TaqMan

® kit MicroRNA Assay (Applied Biosystems, Foster City, EUA) e primers específicos do gene (Applied Biosystems, Foster City , EUA), utilizando um real-Time PCR sistema ABI 7500. O ensaio foi realizado em triplicado para cada caso, para permitir a avaliação de variabilidade técnica.

A hibridação e a avaliação da coloração de miR-31

A hibridação in situ (ISH) in situ foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). secções embebidas em parafina (4 mm de espessura) foram desparafinados com xilol e reidratados com etanol diluída de grau reagente. Os slides foram tratados com proteinase K a 37 ° C durante 20 minutos. Em seguida, elas foram pré-hibridados em solução de hibridação a 50 ° C durante 2 horas. Subsequentemente, 40 nM de um ácido-modificado, 5 ‘digoxigenina nucleico bloqueado (DIG) marcado com oligonucleótido sonda de uma sonda de controlo scrambled (Exiqon) HSA-miR-31 em que foi adicionado à solução de hibridação e hibridou-se a uma temperatura de 50 ° C durante a noite. Uma fosfatase alcalina anticorpo anti-DIG conjugado (Roche, Mannheim, Alemanha) foi aplicada. Depois de ter sido lavada em solução de coloração, as secções foram incubadas em solução de NBT /BCIP em desenvolvimento (Roche) a 37 ° C durante 15 a 30 minutos. Em seguida, eles foram contra-coradas com vermelho rápido nuclear.

Para avaliar as características clínicas dos pacientes, as secções de tecido ISH manchadas foram examinadas e avaliadas separadamente por dois patologistas cegos. A coloração para miR-31 foi avaliada utilizando um método relativamente simples, reprodutível de pontuação [21,22]. Numa escala de 0 a 3, a intensidade da coloração foi pontuada como segue: negativa (sem coloração, 0), fraca (luz azul, 1), média (azul, 2), ou forte (azul escuro, 3). A extensão da coloração é definida como a percentagem de áreas de coloração positiva de células tumorais ou células epiteliais do cólon normais em relação à área do tumor total ou secção inteira de amostras normais. O grau de coloração foi pontuada numa escala de 0 a 4 como se segue: 0, 0%; 1, 1-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; e 4, 76-100%. A soma das pontuações de coloração de intensidade e coloração-medida foi usada como pontuação coloração final para miR-31 (0-7). Para a análise estatística, uma pontuação de coloração final ≥ 3 foi considerado elevado.

preparação Vector

Um fragmento de DNA de 184 pb, correspondente a pré-miR-31 foi selecionado, eo flanqueando sequência foi amplificado e clonado em um vector lentiviral pLVTHM (https://www.addgene.org/Didier_Trono) para gerar PLV-miR-31 vector de expressão. pLVTHM lentiviral vector codifica verde melhorada proteína fluorescente (EGFP) que foi optimizado para a fluorescência brilhante e uma maior expressão em células de mamífero. O vector anteriormente descrito pCAG-SATB2 [19] foi usado para sobre-regular a expressão SATB2.

A 3’UTR de comprimento completo de SATB2 (2711bp) foi clonado e, em seguida, inserido no jusante do gene repórter de luciferase de controlo pGL3-Vector (Promega, Madison, WI, EUA). Isto foi feito para gerar pGL3-SATB2-3’UTR. Dois sítios de ligação putativos de miR-31 na 3’UTR de SATB2 foram Site-Directed e mutada, respectivamente usando GeneTailor Site-Directed Mutagenesis Sistema (Invitrogen). Todos os plasmídeos foram verificados por sequenciação. Todas as sequências de iniciadores para a detecção de sequências de miARN e são fornecidos na Tabela S1.

Lentivírus produção e infecção

partículas virais foram colhidas 48 horas após o PLV-miR-31 transfecção com o plasmídeo envelope pMD2.G eo psPAX2 embalagem vector em células 293T utilizando o reagente lipofectamina 2000 (Invitrogen ). células de CRC foram infectadas com as unidades de transdução de lentivírus recombinantes além de 8 mg /ml de polibreno (Sigma, St. Louis, Missouri, EUA) e, em seguida, submetido a análise FACS para a expressão de GFP para obter células de CRC com estável sobre-expressão de miR-31. O pLVTHM vector lentiviral vazio foi utilizado como controle (miR-con).

transfecção Oligonucle�ido

miR-31 imita e inibidores anti-sentido contendo 2′-OMe (

O

metil) modificações foram sintetizados por GenePharma (Xangai, China). Oligonucleótido transfecção foi realizada com reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

repórter luciferase ensaio

Na presença de qualquer miR-31 ou miR-con, a construção de luciferase de pirilampo foi co-transfectado com um controle

Renilla luciferase

vector pRL- CMV (Promega) em células SW480. Um ensaio de luciferase duplo (Promega) foi realizada 48 horas após a transfecção. As experiências foram realizadas em triplicado, de forma independente.

ensaio de proliferação celular e análise do ciclo celular

As células foram semeadas em placas de 96 poços a 2 x 10

3 por poço. A proliferação celular foi avaliada utilizando células de contagem Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para a análise do ciclo celular, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços a 5 x 10

5 por poço. A distribuição do ciclo celular foi analisada por iodeto de propídio (Sigma-Aldrich) e coloração de citometria de fluxo [23].

Colónia ensaio de formação de

As células foram plaqueadas em placas de 6 poços a 2 x 10

2 por poço e mantidas em RPMI 1640 contendo FBS a 10% durante 2 semanas. Após 2 semanas, as células foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal a 0,5%. O número de colónias foi contado sob um microscópio [24].

Wound healing e ensaios de invasão

A migração celular foi avaliada através da medição do movimento das células em um raspado, área acelular criado por um tubo de pipeta de 200 uL, e observou-se a propagação de encerramento de feridas após 0 e 48 horas, respectivamente. As fotografias foram tiradas para avaliar o nível de migração em cada grupo de células transfectadas. A migração foi quantificada através da contagem do número total de células que migraram para o campo ferida original. Para ensaio de invasão, foram utilizadas câmaras revestidas de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) contendo 8 mm poros. As células foram semeadas em câmaras superiores (revestido em matrigel) em 2 × 10

5 concentração em meio isento de soro. A câmara inferior do Transwell foi preenchido com meio de cultura contendo 10% de FBS como um quimio-atractor. Após as câmaras foram incubadas a 37 ° C durante 48 horas, as células não invadidos sobre o topo da transwell foram raspadas com um cotonete. Com sucesso células translocados foram fixadas com formalina a 10%. Em seguida, eles foram coradas com 0,1% de violeta de cristal durante 30 minutos e contadas sob um microscópio de luz.

In vivo

funções ensaios

Balb /C-nu /nu atímicos camundongos nus (4-6 semanas de idade) foram adquiridos a partir do Centro de animais de Laboratório da Universidade de Southern Medical. Os ratos foram alojados em condições livres de patógenos em um ciclo de 12 horas claro /escuro e

ad libitum

acesso a alimentos e água filtrada. Animais utilizados para a experimentação receberam cuidados. Para o ensaio de crescimento de tumor, com um total de 2 x 10

6 células SW480 de células com estabilidade de expressão ao longo de miR-31, ou de controlo, foram injectados por via subcutânea no flanco esquerdo e direito de ratos (n = 6 por grupo). Em seguida, a fluorescência emitida por células foi recolhido e as imagens foram analisadas por meio de um sistema de imagem de corpo inteiro de GFP (Lighttools, Encinitas, CA) que podia visualizar o crescimento do tumor em tempo real. O tamanho do tumor foi medido utilizando calibradores digitais de três em três dias. Após 30 dias de acompanhamento, os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical e os tumores foram dissecados. O volume do tumor foi calculado da seguinte forma:. Volume = (D × d

2) /2, em que D significa o diâmetro maior e d significava o diâmetro mais curto

Para estabelecer modelo metastático, ceco do rato foi exteriorizado pelo laparotomia sob anestesia pentobarbital sódico (6 mg /100 g de peso corporal). Os tumores subcutâneos foram cortadas em 1 mm

3 cubos e foram implantadas no mesentério no terminal ceco de ratos. Em seguida, o intestino foi devolvido para a cavidade abdominal e fechados com coberturas cirúrgicas. almofadas de aquecimento foram usadas para ajudar a recuperação pós-operatória em ratos após o implante de enxertos. estado de saúde dos animais foi monitorada após a cirurgia diária, incluindo a sua atividade física, hidratação, alimentação e hábitos de consumo e deambulação. O peso corporal de controle e SW480 /miR-31 ratos também foi registrada a cada três dias. endpoints humanas havia sido planejado no final do experimento e como um meio para reviver a dor ou sofrimento. Um critério integrado para necessidade de eutanásia foi realizada no nosso estudo, incluindo déficit físico, doença, sofrimento, imobilidade, perda de peso e tamanho máximo de tumor. Quando apareceram défice físico evidente, como os olhos secos ou sem brilho, membranas mucosas brega, curvado, redução de deambulação, observador desconsiderada, dispneia ou caquexia, os ratos foram considerados como satisfazendo os critérios de eutanásia e foram sacrificados para minimizar o sofrimento e angústia. No final da experiência (8 semanas), os ratinhos ainda vivos foram sacrificados por deslocamento cervical. Os órgãos foram removidos e fixados com formalina a 10% tamponada neutra. Posteriormente, cortes de tecido consecutivos foram obtidos e corados com hematoxilina-eosina (H E) para observar os nódulos metastáticos dos órgãos sob o microscópio. Todos os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Southern Medical. Todos foram tomadas as medidas necessárias para minimizar o sofrimento e angústia para os ratos.

análise de Western blot

lisados ​​de proteína foram separados por electroforese em gel de SDS-PAGE a 10% e transferida para membrana de PVDF (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, EUA). A membrana foi sondada com os anticorpos seguintes: anti-SATB2 (Abcam, Cambridge, UK), anti-caderina-E (Cell Signaling Technology, Inc), anti-N-caderina (Cell Signaling Technology), anti vimentina-(Cell Signaling tecnologia), e anti-β-catenina (Cell Signaling Technology). Finalmente, a membrana foi sondada com HRP (peroxidase de rábano) marcado com IgG de cabra-anti-rato (Santa Cruz Biotechnology, EUA) e detectado por quimiluminescência. Um anticorpo policlonal anti-β-actina (Santa Cruz Biotechnology) foi utilizada como um controlo de proteína de carregamento. A intensidade dos fragmentos de proteína foi quantificada com o Um software Quantidade (4.5.0 básico, Bio-Rad).

imuno-histoquímica (IHQ)

Os blocos de tecido foram cortados em sec�es de 4 � e processada para IHC de acordo com um protocolo previamente descrito [19].

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software SPSS 16.0 estatística. Em pelo menos três experiências independentes, os dados foram apresentados em termos de média ± SEM. Diferenças entre as variáveis ​​foram avaliados pelos três testes estatísticos seguintes: χ

2, teste exato de Fisher ou ANOVA one-way. Para os pacientes com diferentes níveis de miR-31 expressão, curvas de sobrevida foram plotados utilizando o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. A análise multivariada foi realizada em todos os parâmetros que foram encontrados para ser significativos em análise univariada utilizando o modelo de regressão de Cox. A

p

valor inferior a 0,05 foi considerado como significância estatística.

Resultados

miR-31 foi regulado para cima em células de câncer colorretal metastático e tecidos CRC primários humanos com linfonodo metástases

O primeiro examinado miR-31 de expressão por uma haste-laçada quantitativa por RT-PCR num painel de linhas celulares de CRC e 31 pares de CRC e tecidos de mucosa não neoplásicas adjacentes. Os resultados mostraram que o miR-31 foi notavelmente regulados positivamente em tecidos de CRC em comparação com tecidos normais não neoplásicas adjacentes (

P

= 0,0004, Figura 1A). Observou-se que a sobre-regulação de miR-31 em amostras de tumores foi associado com a metástase do nó de linfa de forma significativa (

P

= 0,0045, Figura 1B). Em pacientes com metástases linfáticas, a expressão média relativa de miR-31 foi mais de 7,82 vezes maior do que em pacientes sem metástases (61,54 ± 16,68

vs

.7.87 ± 2,47). Além disso, o miR-31 foi baixa em SW480 e células DLD-1, que se originam a partir de tumores primários, enquanto que era relativamente elevada em SW620, Lovo, M5 e SCP51 células, que se originam a partir de focos metastáticos (Figura 1C), especialmente em M5 e linhas de células SCP51, que têm elevado potencial metastático entre as linhas celulares de CRC. Esta associação indicou que o miR-31 pode também ter um papel crucial na CRC metástase.

(A) Os níveis de expressão de miR-31 madura em emparelhado CRC e tecidos normais adjacentes. (B) A expressão de miR-31 em tecidos de CRC com ou sem metástases em relação ao combinar-tecidos normais. nmCRC denota tecidos CRC sem metástases; mCRC denota tecidos CRC com metástases linfáticas. (C) A expressão do miR-31 em linhas celulares de CRC e subclones. miRNA abundância foi normalizada para U6 RNA. (D) Análise da expressão de miR-31 em mucosa colorretal normal e tecidos CRC pela

em

situ

hibridização. (A) Expressão negativa de miR-31 na mucosa colorrectal normal; (B) a baixa expressão de miR-31 em tecidos de CRC; (C, d) de alta expressão de miR-31 em tecidos de CRC; (E) controlo negativo; (F) análise de Kaplan-Meier para a sobrevivência de pacientes com CRC de acordo com a miR-31 expressão. Log Rank = 6,682,

p = 0,010

.

Sobre-expressão de miR-31 foi associada com um fenótipo agressivo e mau prognóstico de pacientes com CRC

para investigar ainda mais o significado clínico-patológico e prognóstico de miR-31 níveis, medimos o miR-31 de expressão de uma grande coorte de 143 arquivado CRC embebidos em parafina e tecidos normais do cólon usando ISH. Observamos que 75/143 (52,45%) CRCs tinha expressão de alto nível miR-31, enquanto que 11/55 (20%) tecidos de mucosa normais tiveram expressão de alto nível de miR-31 (

p Art 0,001). A análise de correlação entre as características clínicas e miR-31 de nível mostraram expressão de alto nível de miR-31 foi significativamente associada com T-estágio (

p

= 0,045), metástase ganglionar (

p

= 0,001), e metástases à distância (

p

= 0,026) em pacientes com CRC, no entanto, não associada com a idade, sexo, local do tumor, tamanho do tumor e grau de diferenciação do tumor (

p

. 0,05, Tabela 1)

Características

N

miR-31 expressão

baixa (%)

alta (%)

P

valor

Sexo Male8739 (44,83) 48 (55,17) 0,416 Female5629 (51,79) 27 (48,21) Idade (anos) 506535 (53,85) 30 (46,15) 0,169 ≥507833 (42,31) 45 (57,69) Tumor local proximal colon4220 (47,62) 22 (52,38) 0,369 colon3721 distal (56,76) 16 (43,24) Rectum6427 (42,19) 37 (57,81) O tamanho do tumor (cm de diâmetro) 54519 (42,22) 26 (57,78) 0,387 ≥59849 (50,00 ) 49 (50,00) diferenciação tumoral Good136 (46,15) 7 (53,85) 0,979 Moderate10450 (48,08) 54 (51,92) Poor2612 (46,15) 14 (53,85) T-stage1-22316 (69,57) 7 (30,43) 0,045 38740 (45,98) 47 (54,02) 43312 (36,37) 21 (63,63) N-stage05938 (64,41) 21 (35,59) 0,001 1-28430 (35,71) 54 (64,29) metastasis09451 Distante (54,26) 43 (45,74) 0,026 14917 (34,69) 32 (65,31) tabela 1. Correlação entre as características clínicas e expressão de miR-31.

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para avaliar o valor prognóstico de miR-31 para CRCs, analisamos a associação entre o miR-31 expressão e duração de sobrevivência usando Kaplan análise -Meier com o teste log-rank. Os resultados revelaram que a expressão de alto nível de miR-31 foi correlacionada com o tempo de sobrevida curta de pacientes com CRC (51,85 ± 3,78

vs

.76.64 ± 4,30,

p

= 0,010, Figura 1D ). Além disso, a análise de regressão de Cox multivariada indicou que a expressão de alto nível de miR-31 é um fator prognóstico independente para pior sobrevida de pacientes com CRC (Tabela 2).

Variáveis ​​

A análise univariada

análise multivariada

P

valor

HR

95% de intervalo de confiança

P

valor

HR

95% de intervalo de confiança

Gender0.516 0,826 0.464-1.471Age0.391 0,785 0.451-1.366Tumor site0.915 0,982 0.707-1.365Tumor size0.581 1.190 0.642-2.207Tumor differentiation0.074 1.648 0.953-2.850T-stage0.001 2,262 1.419-3.6060.032 1,695 1.045-2.750 N-stage0.041 1.563 0.846-2.7280.604 0,847 0.453-1.586M-stage 0.0014.338 2,441-7,707 0.0013.563 1.940-6.545miR-31 expression0.012 2.145 1.182-3.8900.048 1.877 1.007-3.488Table analisa 2. a sobrevida global por análise de regressão univariada e multivariada de Cox.

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exogenetic sobre-expressão de miR-31 promovido CRC crescimento células, invasão e migração

in vitro

Para explorar o potencial função biológica de miR-31 em CRC tumorigênese e progressão, SW480 e células DLD-1 foram infectadas com o PLV-miR-31 ou PLV-con, respectivamente. Isto foi feito para estabelecer duas linhas celulares de miR-31-superexpressão estável e duas linhas de células simuladas (MIR-con). Um aumento da expressão de miR-31 após a infecção em duas linhas de células foi confirmada por em tempo real de RT-PCR (Figura 2A). Tal como mostrado na Figura 2B-2D, a sobre-expressão de miR-31 aumentou a proliferação de células de cancro e a sua capacidade para formar colónias do que nas células pseudo-infectadas e células não de tipo selvagem (

P

0,001 ). A citometria de fluxo e análise do ciclo celular revelaram uma diminuição significativa na percentagem de células na fase G1 /G0 (

p = 0,004

em SW480

, p = 0,008 em

DLD1) e um aumento fase S de células CRC tratados com miR-31 (

p = 0,002

em SW480

, p = 0,001

em DLD1, Figura 2E).

(A) análise em tempo real de RT-PCR de miR-31 nível de expressão em células SW480 e DLD-1 após ectópica sobre-expressão de miR-31. (B, C) Efeito de miR-31 sobre a proliferação celular foi medida por ensaio de CCK-8. (D) Comparação de efeitos de formação de colónias das linhas celulares de CRC. (E) a distribuição do ciclo celular de células infectadas com o CRC miR-31 foi detectado por análise de citometria de fluxo. (F, G) Efeitos de miR-31 sobre-expressão ectópica em motilidades celulares e invasividade foram determinados utilizando a cicatrização de feridas (F) e ensaios de invasão de Matrigel (G). Os dados foram apresentados como média ± SD. Os resultados foram reprodutíveis em três experiências independentes. *

p Art 0,05, **

p

. 0,001

Depois de observar o engrandecimento crescimento miR-31 mediada, o efeito de miR-31 na capacidade invasiva de células CRC foi caracterizado por o ensaio de cicatrização de feridas e invasão de matrigel. Os resultados indicaram que a expressão exogenetic de miR-31 em células de CRC causou um aumento significativo na migração de células usando um ensaio de cicatrização da ferida (

p = 0,001

em SW480

, p

0,001 em DLD1, Figura 2F). ensaio de invasão de Matrigel também ilustrado que a sobre-expressão de miR-31 invasividade de células induzida marcadamente CRC (

P

0,001 em ambas SW480 e DLD1, Figura 2G). Estes resultados indicaram que a sobre-expressão de miR-31 foi suficiente para promover tanto a proliferação e migração celular

In vitro

.

miR-31 facilitou CRC crescimento de células de tumores e metástases

in vivo

Uma vez que miR-31 promove o crescimento, migração e invasão das células CRC

in vitro

, temos tentado determinar se miR-31 poderia facilitar o crescimento de tumores e metástases

in vivo

. Para este efeito, SW480 células com sobre-expressão estável de miR-31 (SW480 /miR-31) e células de controlo (SW480 /miR-con) foram inoculados subcutaneamente em ratinhos nus. Como mostrado na Figura 3A, a velocidade de crescimento do tumor no grupo SW480 /miR-31 foi significativa do que a do grupo SW480 /miR-CON (

P

0,05, Figura 3A e 3B). IHC coloração revelou que os tumores do grupo de controlo apresentado muito menor índice Ki-67 do que a do grupo de miR-31 sobre-expressão (Figura 3B).

(A), as imagens de fluorescência de corpo inteiro externas de SW480 /miR ratos e tumores (superior) e imagens de tumor subcutâneo de ratos -31 e SW480 /miR-con foram obtidos (inferior). As setas indicam os cancros subcutâneas. (B) Fotografias representativas de H E e coloração imuno-histoquímica para o Ki-67 de anticorpo de tecidos cancerosos primários (superior) e a curva de crescimento dos volumes tumorais (inferior). Cada ponto de dados representa a média ± DP. (C) As imagens de corpo inteiro de metástases em camundongos. P denota tumor primário. setas brancas apontam para os nódulos metastáticos. (E) imagens histológicas de nódulos metastáticos em órgãos. tumores de xenoenxerto com miR-31-sobre-expressão formado significativamente a invasão da parede cecal (a, b), semeando metástase do cólon (c), a parede do estômago (d), da parede abdominal (e) e o diafragma (f), e metástases da linfa nó (g), do fígado (h) e pulmão (I). (E) A incidência de metástases em ratinhos implantados com que SW480 /miR-31 ou células de miR-con. (F) A análise de sobrevida de camundongos /miR-31 e SW480 /miR-con SW480.

Para imitar CRC humana e avaliar o

in vivo

efeito de miR-31 em metástase da CRC, SW480 /miR-31 e células /miR-con SW480 foram orthotropically implantado no terminal ceco de indivíduos. Entre 4 e 8 semanas após a implantação xenotransplantes, 4/6 camundongos experimentais e 1/6 ratinhos de controlo apresentaram déficit físico evidente devido ao aumento da carga tumoral. Desde cumprir o critério de endpoint humano, estes ratos foram sacrificados para aliviar o sofrimento e angústia. Os ratinhos vivos restantes foram sacrificados no final da experiência (8 semanas). Os resultados da experiência em animais mostraram que as células SW480 miR-31-sobre-expressão dramática exibiram metástases do fígado e cavidade peritoneal, ao passo que as células SW480 /miR-con só causou aumentos de tumor sem qualquer metástases (Figura 3C). H E coloração mostrou claramente invasão na parede intestinal e metástase do estômago, diafragma, a parede abdominal, fígado, linfonodos e pulmão em grupos /MIR-31cells SW480 (

p Art 0,05, Figura 3D e 3E ). Além disso, foi revelado que o miR-31 sobre-expressão conduziu a menores tempos de sobrevivência globais dos animais (

P

0,05, Figura 3F)

A inibição de miR-31 reduzida. o crescimento, invasão e migração de células CRC

in vitro

Para confirmar os efeitos de miR-31 sobre a modulação dos fenótipos malignas de células CRC, nós também investigou a variação de fenótipos agressivas de células CRC depois reduzida expressão de miR-31. transfecção inibidor de miR-específica-31 foi empregue para inibir o miR-31 de expressão em células SW620 e M5, que tiveram alta endógena miR-31 de expressão. Como mostrado na Figura 4A, quando comparado com as células de controlo, uma taxa significativamente mais lenta proliferação foi observada em células de miR-31-inibidor transfectadas (

P

0,001). Além disso, a invasão de matrigel e ensaios para cicatrização de feridas confirmou que a inibição de miR-31 de expressão reduzida a invasividade e a migração das células SW620 e M5, em comparação com as células de controlo (

P

0,05, Figura 4B e 4C ).

(A) Inibição de miR-31 inibiu a proliferação de células de M5 e células SW620 por ensaio CCK8. (B, C) Inibição de miR-31 invasividade reduzida e migração celular como determinado pela câmara de invasão em matrigel (B) e cura de feridas ensaios (C). Os dados foram apresentados como média ± SD. Os resultados foram reprodutíveis em três experiências independentes. *

p Art *

p Art β-actina foi utilizado como um controlo de carga.