Sumário

Cancro origina a partir de células que adquiriram mutações em genes críticos para controlar a proliferação celular, sobrevivência e diferenciação. Muitas vezes, os tumores continuar a depender desses chamados mutações motorista, proporcionando a justificativa para terapias anticâncer direcionados. Até à data, as análises de sequenciação de grande escala ter revelou centenas de mutações em tumores humanos. No entanto, sem a sua validação funcional ainda não é claro quais as mutações que correspondem à condutor, ou em vez espectador, mutações e, portanto, se o gene mutado representa um alvo para intervenção terapêutica. Nos tumores colorretais humanos, o receptor TrkB neurotrófico foi encontrado mutado em dois locais diferentes no seu domínio quinase (TRKB

T695I e TRKB

D751N). Um outro local, na parte extracelular de trkB é mutado em uma linha de células de adenocarcinoma de pulmão humano (TRKB

L138F). Por último, a nossa própria análise identificou uma mutação proximal adicional ponto TRKB para o domínio de cinase (TRKB

P507L) numa linha de células de melanoma humano. As consequências funcionais de todas essas mutações pontuais, no entanto, até agora permaneceu uma incógnita. Anteriormente, mostrámos que TRKB é um potente supressor de anoikis e que as células que expressam trkB formar tumores altamente invasivo e metastático em ratinhos nus. Para avaliar as consequências funcionais destas quatro mutações TrkB, determinou-se o seu potencial para suprimir anoikis e formar tumores em ratinhos nus. Inesperadamente, os dois mutantes derivadas de cancro do cólon, TRKB

T695I e TRKB

D751N, apresentaram atividade reduzida comparada com a de tipo selvagem TRKB. Consistentemente, após estimulação com o ligando TRKB BDNF, estes mutantes foram prejudicados na ativação TRKB e sua efetores a jusante AKT e ERK. Os dois mutantes derivados de linhas celulares de tumores humanos (TrkB

L138F e TRKB

P507L) eram funcionalmente indistinguíveis do tipo selvagem TRKB tanto em

in-vitro

e

in vivo

ensaios. Em conclusão, não conseguimos detectar qualquer ganho de função de quatro mutações pontuais TRKB derivadas de câncer

Citation:. Geiger TR, Song JY, Rosado A, Peeper DS (2011) Caracterização funcional de Câncer Humano Mutações trkB derivadas. PLoS ONE 6 (2): e16871. doi: 10.1371 /journal.pone.0016871

editor: Pendure Nguyen, da Universidade Emory, Estados Unidos da Ameica

Recebido: 21 Setembro, 2010; Aceito: 17 de janeiro de 2011; Publicação: 17 de fevereiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Geiger et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção da União Europeia FP6 a TRG, AR e D.S.P. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é uma doença genética, em muitas mutações somáticas no proto-oncogenes e genes supressores de tumores que contribuem para o fenótipo maligno [1]. Estes genes normalmente controlar os processos vitais, incluindo a proliferação celular, sobrevivência ou diferenciação [2]. A sua mutação dota células tumorais com uma vantagem selectiva, resultando na expansão clonal e neoplasia. Embora os tumores geralmente abrigam várias aberrações genéticas [1], a inibição de apenas um ou alguns produtos de genes podem ser suficientes para suprimir em grande parte, a proliferação de células tumorais ou a viabilidade [3]. Isto tem sido demonstrado para causar a regressão do tumor em vários modelos de ratinho do cancro [4] – [6] e deu origem ao conceito de “dependência oncogene” e “tumor hipersensibilidade gene supressor” [3]. A dependência de células tumorais em certos oncogenes e vias de sinalização expõe um “” calcanhar de Aquiles “do cancro, que pode ser alvo para terapia anti-cancro [7]. Com base neste conceito, várias novas terapias têm sido desenvolvidas e são utilizadas na clínica [8]. Eles incluem mesilato de imatinibe (ou “Gleevec” /”Glivec”) para a inibição de BCR-ABL em leucemia mielóide crónica (LMC) [9] e para a inibição da KIT em tumores estromais gastrointestinais (GIST) [10], respectivamente. De modo semelhante, em pacientes com cancro da mama com ERBB2 (também chamado de HER-2 /NEU) a sobre-expressão, o anticorpo monoclonal trastuzumab [11] – [13] e a pequena molécula inibidora lapatinib [14] são eficazes. Um papel crítico para mutações oncogénicas é ilustrado pelo exemplo de receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR /ErbB1) em não pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC), em que apenas um subconjunto de pacientes respondem ao inibidor de EGFR gefitinib. As análises sequenciação revelou que os tumores responsivos abrigar mutações específicas em EGFR, aumentando a sua activação por EGF [15].

Estes e outros exemplos ilustram que a identificação de oncogenes criticamente necessários para a proliferação celular e sobrevivência do tumor pode levar a anticancerígeno eficaz terapêutica. Por isso, vários grupos de pesquisa têm realizado sistemática sequenciamento em larga escala análises para triagem de genes que são mutados no câncer. Esta estratégia conduziu em primeiro lugar para a identificação da quinase BRAF como um oncogene crítico num grande percentagem de melanomas e vários outros tipos de cancro [16]. Em 2003, o grupo de Vogelstein, Kinzler e Velculescu sequenciado sistematicamente os domínios quinase de todas as tirosina-quinases em uma coleção de cancro colorectal humanos. Eles descobriram 7 de 138 genes analisados ​​para ser mutado em mais de um tumor [17]. O mesmo grupo posteriormente analisadas mais de 1000 genes diferentes na mama e cancro do cólon [18], identificando-se a 189 novos e os genes do câncer candidato conhecidas. Da mesma forma, Stratton, Futreal e colaboradores no Instituto Sanger sequenciado primeiro 518 quinases full-length em tumores de pulmão e linhas de células tumorais [19] e, posteriormente, o kinome completa em dez tipos diferentes de câncer [20]. Estas e outras análises identificaram centenas de novas mutações somáticas em vários tumores malignos humanos [21]. No entanto, algumas exceções à parte, as conseqüências funcionais dessas mutações têm permanecido praticamente imperceptíveis. Para selecionar as metas apropriadas para futuras terapias anticancerígenas, será necessário testar experimentalmente qual destas mutações são genes oncogénicos e em que mutantes tumores dependem.

Nós escolhemos para investigar o receptor TrkB neurotrófico (NTRK2), por que três somáticas, mutações pontuais não-sinônimas foram relatados nos estudos mencionados acima [17], [19], enquanto a nossa própria análise revelou uma outra mutação pontual TRKB em uma linha de células de melanoma humano. TRKB é um de três membros da família do receptor de TRK, que também inclui TRKA e trkC. TRKB liga-se preferencialmente o factor neurotrófico derivado do cérebro neurotrofina (BDNF) e NT4 /5, enquanto TRKA e trkC têm elevadas afinidades para o factor de crescimento do nervo (NGF) e NT3, respectivamente [22]. O pan-TRK p75NTR receptor modula ainda mais a capacidade de resposta dos receptores trk com neurotrofinas [22]. TRKB foi encontrado sobre-expresso num certo número de tipos de cancro humano agressivos (para revisão ver [23]). Anteriormente, mostrámos que TRKB é um potente supressor de anoikis (apoptose induzida pela inadequada ou inexistente adesão celular) em células epiteliais de rato, e que as células que sobre-expressam trkB formar tumores altamente invasivo e metastático em ratinhos nus [24]. Além disso, a nossa análise de estrutura-função relatado anteriormente demonstrado que todas estas funções dependem da actividade TRKB cinase neste sistema experimental [25]. Mais recentemente, temos demonstrado para as células epiteliais do rato transforma-TrkB que aumentaram os sinais de atividade MAPK através de torção e caracol para induzir epitelial-mesenquimal Transição (EMT) transformação -como, anoikis supressão e metástase [26]. Como as duas mutações pontuais de trkB derivadas de cancro identificados mapa dentro do domínio da cinase, possivelmente afectando a sua actividade enzimática, é concebível que actuam oncogenicamente e correspondem a mutações do controlador. O objetivo deste estudo foi, portanto, para avaliar as consequências funcionais de quatro mutações pontuais independentes humanas derivadas de câncer TrkB.

Resultados

Identificação dos mutantes pontuais TRKB derivadas de câncer humanos e geração de sistemas de células de

Duas mutações pontuais não sinónimas dentro do domínio da quinase do

TRKB

gene foram descoberto em tumores colorretais: TRKB

T695I e TRKB

D751N [17] ( a numeração de todas as sequências de aminoácidos refere-se à proteína TRKB humana de comprimento total, o número de acesso NP_006171.2). Outra mutação pontual trkB TRKB

L138F, foi identificado na linha celular de adenocarcinoma de pulmão NCI-H2009 [19]. Esta mutação encontra-se dentro do domínio rico em leucina da parte extracelular do receptor, o que foi mostrado para ser necessária para a ligação do factor de ligando TRKB neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e a activação do receptor TRKB [25], [27 ], [28]. Foi confirmada a presença desta mutação por sequenciação de ADN genómico (ADNg) isolado a partir de células NCI-H2009 (Figura 1A, painel esquerdo). A presença de um pico duplo (timidina e citosina) indica que a mutação é heterozigótica, consistente com o relatório original [19]. Isso resulta na substituição de leucina por fenilalanina. Para procurar mais

TRKB

ponto de mutações associadas ao cancro, nós sequenciaram os exons que compõem o

TRKB

domínio quinase a partir do DNA genômico de 28 linhas celulares de tumores humanos, a partir de várias origens de tecidos (dados não mostrados ). Esta análise revelou um

mutação pontual adicional TRKB

, na linha celular de melanoma MDA-MB-435. (A linha celular MDA-MB-435 parece ter sido classificadas de forma errada no passado [29]. Considerando que foi originalmente isolado a partir de um paciente com cancro da mama [30], [31], análise recente indicou que a linha de células actualmente disponíveis é de origem melanoma [32], [33]). O

TRKB

mutação identificada em células MDA-MB-435 é C1520T, resultando numa substituição de prolina 507 por leucina (TRKB

P507L). Neste caso, a sequenciação de ADNg revelou um único pico única (Figura 1A painel direito), o que sugere que a mutação é homozigótica. O resíduo P507 está localizada proximal ao domínio cinase na parte intracelular do receptor. A Figura 1B mostra uma visão esquemática das posições de todas as mutações pontuais humanas derivadas de câncer TrkB analisados ​​neste estudo.

(A) A análise de sequenciação de gDNA a partir de células NCI-H2009 portadoras do TRKB

L138F mutação ( painel da esquerda) e de células MDA-MB-435 que albergam TRKB o

P507L mutação (painel da direita). Asteriscos (*) indicam as respectivas bases mutadas. letras pretas significam resíduos de tipo selvagem, letras vermelhas significam resíduos mutantes. (B) Visão esquemática sobre todas as mutações pontuais TrkB derivadas de câncer analisados ​​neste estudo. LRM: Leucina-Rich Motif, Ig: Imunoglobulina-like domínio, TM: domínio transmembrana. Os números indicam as posições de resíduos de aminoácidos. (C) Os níveis de expressão de mutante ou de tipo selvagem em células RIE TRKB-1, analisadas em imunoblot (IB). Tubulina serve como controlo de carga. Os números representam quantificação de sinal TRKB, normalizados para alfa-tubulina, e em relação ao controle do vetor. ensaio (D) a biotinilação da superfície celular que mostra que, pelo menos, uma fracção significativa de todos os mutantes de trkB localiza na membrana celular. Total de proteínas da superfície celular foram biotinilados com Sulfo-NHS-LC-Biotina, lisadas, trkB foi imunoprecipitada (IP) com anticorpo TRK (C-14, C-13 para o controlo). Após electroforese em gel, TRKB biotinilados foi visualizada com estreptavidina-HRP, trkB total de anticorpo com TRK (C-14). Todos os do tipo selvagem e proteínas mutantes de trkB ficou biotinilado (painel superior esquerdo). No lado direito da especificidade do ensaio é demonstrada: sinal de biotina foi apenas detectada por TRKB de comprimento completo (painel superior direito, segunda pista), mas não para citosólica, truncada TPR-TRKB [25] (terceira faixa, esperado em ~ 50 kD), e não no PI controlo (pista 4) ou na ausência de Sulfo-NHS-LC-Biotina (pista 5). IP do total de comprimento completo e truncado TRKB é mostrado em painéis de fundo. As setas indicam full-length TRKB, seta indica truncada TPR-TRKB (logo abaixo Ig cadeias pesadas).

Foi avaliado se esses quatro mutações pontuais TRKB derivadas de câncer correspondem a ganho de função mutações associadas com o aumento do potencial oncogénico. Nós realizamos esta análise em ratos células epiteliais em primeiro lugar, porque eles são altamente sensíveis a transformação oncogénica mediada por TRKB, como marcado por uma transformação morfológica EMT-like, anoikis resistência e formação de tumor metastático em camundongos nus [24] – [26]. Para este fim, clonado de tipo selvagem e mutante TRKB no vector de expressão retroviral pBabe-Puro e transduzidas epiteliais intestinais de rato (RIE-1) células, bem como células E1A-imortalizada epiteliais de rim de rato (RK3E). Ambas as linhas celulares imortalizadas são, ainda não oncogénico em ratinhos atímicos. Como controlo negativo, que expressa um mutante quinase inactiva do TRKB, TRKB

K588M [34], que anteriormente demonstrado ser incapaz de oncogenicamente transformar células RIE-1 [25], [26]. Foi confirmada por análise de Western blot que todos os mutantes de trkB foram expressas a níveis similares como de tipo selvagem TRKB (Figura 1C para células RIE-1, Figura S1A para células RK3E). Consistente com as nossas observações anteriores [25], que detectado TRKB como múltiplas espécies num gel de SDS-poliacrilamida, provavelmente reflectindo a espécie diferencialmente glicosiladas [35]. Além disso, através da realização de um ensaio de biotinilação da superfície celular que garantir-se que, pelo menos, uma fracção detectável de todos os mutantes de trkB adequadamente localizada na membrana celular [36] (Figura 1D). Nós, portanto, gerou um sistema de células que nos permite comparar as atividades e funções do lado diferente mutantes TrkB a lado.

potencial transformador de mutantes pontuais TrkB derivadas de cancro humanas in vitro

Como a maioria das quinases , TRKB necessita de um nível mínimo de activação para transformar células epiteliais. Colocámos a hipótese de que se as mutações derivadas TrkB-cancerosas conferir um ganho de função, eles podem transformar células epiteliais mesmo na ausência (ou com níveis reduzidos) de BDNF. No entanto, quando se testaram os vários mutantes trkB na ausência de ligando de co-expressa, nenhum deles induziu uma morfologia de células em forma de fuso (Figura 2A para RIE-1 células, Figura S1B para RK3E células) ou anoikis suprimidas (Figura 2B, Figura S1C) na ausência de BDNF. Isto estava em contraste com o que foi observada para o mutante TPR-TRKB constitutivamente activa e independente do ligando, que se transformou RIE-1 e células RK3E e suprimiu anoikis na ausência de exógeno BDNF, consistente com o nosso relatório anterior [25].

(a) Morfologia das células RIE-1 que expressam de tipo selvagem ou mutante tRKB, fotografada na ampliação de 50x. (B) Ensaio anoikis, no qual as células descrito em (A) foram semeadas em placas de ULC e digitalizados em 1x ampliação 9 dias mais tarde (7 dias para TPR-TRKB).

Em seguida, ativamos o de tipo selvagem e mutantes de receptores de BDNF humano estavelmente que co-expressam, tanto em RIE-1 (Figura 3A) e células (Figura RK3E S1d). Consistente com as nossas observações anteriores [24] – [26], de células que expressam o tipo selvagem TRKB + BDNF isso resultou em EMT-como transformação morfológica (Figura 3B, Figura S1E), a regulação negativa de E-caderina (Figura 3C e Figura S1F) e supressão anoikis (Figura 3D, Figura S1G). O mesmo foi observado para as células que expressam TRKB

L138F + BDNF e TRKB

P507L + BDNF. Por outro lado, TRKB

T695I- e TRKB

células que expressam D751N foram prejudicados na sua resposta a BDNF (Figura 3B, C, D, Figura S1E, F, G). Estes resultados mostram que, inesperadamente, TRKB

T695I e TRKB

D751N são prejudicados na sua capacidade de transformar células epiteliais do rato

in vitro

. Além disso, TRKB

L138F e TRKB

P507L são indistinguíveis das de tipo selvagem TRKB neste cenário.

(A) RIE-1 células que expressam TRKB mutante ou do tipo selvagem foram transduzidas com BDNF e analisados em imunoblot (IB). Arrowhead indica a posição de BDNF. Tubulina serve como controlo de carga. (B) a transformação morfológica de células RIE-1 co-expressando TRKB mutante ou do tipo selvagem e BDNF, fotografada na ampliação de 50x. (C) O marcador de E-caderina epitelial é regulada negativamente em células induzidas por trkB, morfologicamente transformados, tal como avaliado por análise de imunotransferência (IB). β-actina serve como controlo de carga. (D) anoikis supressão de mutante ou de tipo selvagem TRKB + BDNF em células descrito em (a). As células foram feitos a varredura em 1x ampliação 9 dias após a semeadura em placas de ULC.

Capacidade de resposta dos mutantes TrkB derivadas de câncer humano para BDNF

Temos anteriormente demonstrado que a transformação oncogénica mediada por TRKB de células RIE-1 depende criticamente sobre a atividade TRKB quinase [25], [26]. Em busca de uma explicação bioquímica para os resultados imprevistos descritos acima, determinou-se os mutantes TrkB derivadas de câncer diferem das do tipo selvagem TRKB na sua capacidade de resposta a BDNF. Para medir a activação TRKB, utilizou-se células expressando RIE-1 de tipo selvagem ou mutante, mas não TRKB ligando, e as células estimuladas com uma gama fisiologicamente relevante de BDNF recombinante. De acordo com os nossos estudos anteriores [25], [26], esta auto-fosforilação induzida de tipo selvagem TRKB (Figura 4A e 4B), e levou à activação de duas grandes vias de sinalização a jusante [22]: a via PI3K (resultando em fosforilação de AKT /PKB; Figura 4C) e a via de MAPK (resultando na fosforilação de MAPK /ERK; Figura 4D). A exposição a 1 ng /ml de BDNF foi suficiente para induzir auto-fosforilação do tipo selvagem TRKB e activar a via de MAPK, enquanto que as concentrações mais elevadas de BDNF foram necessária para activar AKT (Figura 4B, C, D e dados não apresentados). TRKB

L138F e TRKB

P507L respondeu a BDNF semelhante ao tipo selvagem TRKB. Coerente com a sua incapacidade de suprimir anoikis, TRKB

T695I foi apenas parcialmente ativadas por BDNF, enquanto TRKB

D751N era completamente indiferente para BDNF, idêntica à quinase inactiva TRKB

K588M (Figura 4). Estes resultados mostram que TRKB

T695I e TRKB

exibição D751N reduzida capacidade de resposta à estimulação BDNF em células epiteliais de ratos, enquanto TRKB

L138F e TRKB

P507L se comportar de forma indiferenciada a partir do tipo selvagem TRKB.

(a) células RIE-1 que expressam o tipo selvagem ou TRKB mutante foram estimuladas com 10 ng /ml de BDNF recombinante e analisados ​​para fosfo-tirosina (pi) e teor total de TRK por imunoprecipitação (IP) e análise de imunotransferência subsequente (IB) . células (B) RIE-1 que expressam de tipo selvagem ou mutante TRKB foram estimuladas com 1 ng /ml de BDNF recombinante e analisados ​​para fosfo (P) e TRK total. (C) RIE-1 expressando células de tipo selvagem ou mutante TRKB foram estimuladas com 10 ng /ml de BDNF recombinante e analisados ​​para fosfo- (P) AKT e AKT total. inibidor de PI3K LY294002 foi aplicado para confirmar a identidade do sinal de pAKT indicado pela seta. Asterisco (*) indica uma banda de não-específica. As amostras carregadas em pistas dois e três servir como controlos, e foram derivados a partir de um experimento repetição realizada sob condições idênticas. células (D) RIE-1 que expressam de tipo selvagem ou mutante TRKB foram estimuladas com 1 ng /ml de BDNF recombinante e analisados ​​para fosfo- (P) de ERK e ERK total. Para todos os painéis, os números indicam debaixo quantificação dos sinais específicos de fosfo, normalizados para os sinais totais e relativas aos de tipo selvagem TRKB.

potencial oncogénico dos mutantes derivados de trkB cancerosas humanas expressas em células epiteliais de ratos

em seguida, testamos o potencial oncogénico do TRKB mutantes

in vivo

, em experimentos rato de xenotransplante. Nós inoculados subcutaneamente ratinhos Balb /c nus com células que expressam trkB mutantes de tipo selvagem ou. Na ausência de BDNF, só de tipo selvagem TRKB-, TRKB

L138F-, trkB

P507L células que expressam RIE-1 (Figura 5A, B, Figura S2a, B) e as células RK3E (Figura S2E, F ) formado tumores grandes com latências curtas, mas nenhum dos TRKB

T695I- ou TRKB

células que expressam D751N fez. Semelhante a este, também na presença de co-expressa o BDNF, TRKB

L138F, trkB

P507L tumores causados ​​semelhante ao tipo selvagem TRKB em RIE-1 e células RK3E (Figura 5C, D, Figura S2C, D e Figura S2G, H). Nesta configuração, RIE-1 TRKB

T695I + BDNF células que expressam também formados tumores, mas com um atraso estatisticamente significativo, em comparação com RIE-1 TRKB

em peso + células (Figura 5C, S2C) O BDNF expressa. É de notar, quando 1 * 10

5 células foram inoculados, também RIE-1 TRKB

D751N + BDNF-expressando células de tumores formados, mas com uma significativa mais latência do que os induzidos por RIE-1 TRKB

wt + células que expressam BDNF (dados não mostrados). Em células RK3E, expressão de TRKB

D751N não conduzir à formação de tumores, mesmo com elevados números de células e na presença de BDNF, enquanto que RK3E TRKB

células de tumores formados com um aumento da latência significativa T695I + BDNF-expressando comparado para RK3E TRKB

wt + células (Figura S2G) BDNF expressa. Não obstante algumas diferenças entre as duas linhas celulares, em geral, estes resultados indicam que TRKB

T695I e TRKB

D751N estão comprometidas em transformar células epiteliais do rato também

in vivo

. Além disso, nem TRKB

L138F nem TRKB

P507L exibe aumento da actividade oncogénica em comparação com o tipo selvagem TRKB.

(A) 1 * 10

6 células RIE-1 expressando TRKB (wild- tipo ou mutante) foram injectados por via subcutânea em ambos os flancos de ratinhos nus. n = 5 para P507L em peso e, n = 4 para T695I e D751N. (B) 1 * 10

6 células RIE-1 que expressam TRKB (de tipo selvagem ou mutante) foram injectados por via subcutânea em ambos os flancos de ratinhos nus. N = 4 para ambas as linhas celulares. (C) 1 * 10

4 células RIE-1 co-expressam BDNF, trkB (de tipo selvagem ou mutantes) foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus. n = 6 para P507L em peso e, n = 3 para T695I e D751N. (D) 1 * 10

5 células RIE-1 co-expressam BDNF, trkB (de tipo selvagem ou mutantes) foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus. N = 4 para ambas as linhas celulares. Em todas as experiências, os ratinhos foram sacrificados quando a carga do tumor atingiu 2 cm

2 e a curva de sobrevivência de Kaplan-Meier é mostrado. A significância estatística foi determinada com um teste de Log-Rank.

BDNF capacidade de resposta do cólon humano TRKB derivadas de câncer

T695I TRKB

D751N e expresso em células cancerígenas do cólon

uma possível explicação para a actividade diminuída de TRKB

T695I e TRKB

D751N nos ensaios descritos acima é que realizamos-los em um contexto celular aphysiological. Com efeito, a ligação das redes de sinalização intracelular e o padrão de factores reguladores trkB expressão pode não ser idêntica em todos os tipos de células. Idealmente, deve-se avaliar a função dos mutantes trkB no seu contexto original, isto é, nas células de tumor em que foram originalmente identificados. No entanto, não há linhas celulares disponíveis que expressam TRKB

T695I ou TRKB

D751N endogenamente. Além disso, a nosso conhecimento não há nenhuma linha de células primárias humanas epiteliais do cólon disponíveis. Com o objetivo de utilizar um sistema de célula fisiologicamente relevante, nós transduzidas COLO 205 e Caco-2 células de carcinoma do cólon humano com TRKB

T695I ou TRKB

D751N e populações policlonais obtidos expressam de forma estável, quer do receptor. Nós estimulado essas células com BDNF recombinante e, subsequentemente, mensuradas autofosforilação TRKB e ativação de efetores a jusante. À semelhança do que foi observado em células RIE-1, em ambas as células COLO 205 e Caco-2, TRKB

T695I e TRKB

D751N eram menos abundantemente fosforilada do que o tipo selvagem TRKB por estimulação com BDNF (Figura 6). ERK foi fosforilada por estimulação TRKB apenas em células Caco-2, mas não em células COLO 205 (Figura 6C, d). Este é provavelmente porque as células COLO 205 abrigar um BRAF

mutação V600E (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic), que é constitutivamente ativa e estimula MAPK sinalização [16]. Após a estimulação das células Caco-2 com BDNF, nem TRKB

T695I nem TRKB

D751N induzida fosforilação ERK (Figura 6D). Juntos, estes resultados mostram que o TRKB

T695I, trkB

D751N mutantes são menos activos não só em células epiteliais de ratos, mas também em duas linhas celulares de carcinoma do cólon humano.

205 células (A) COLO e as células (B) Caco-2 que expressam o tipo selvagem ou mutante TRKB foram estimuladas com 10 ng /ml de BDNF recombinante e analisados ​​para fosfo-tirosina (pY) de conteúdo por imunoprecipitação (IP) e subsequente análise de imunotransferência (IB). Os lisados ​​(C) de células de células COLO 205 de (A) e (D), lisados ​​de células Caco-2 a partir de (B) foram analisadas para fosfo (P) e TRK total e (p) de ERK. A U0126 inibidor de MEK foi aplicado para confirmar a identidade dos sinais vantagem. β-actina serve como controle de carga.

Knockdown de TRKB endógena

L138F e TRKB

P507L em tumores humanos linhas celulares

O fato de que TRKB

L138F e TRKB

P507L são endogenamente expressa em linhas de células tumorais nos deu a possibilidade de investigar se eles são necessários para o seu fenótipo oncogénico. Nós empobrecido TRKB

L138F e TRKB

P507L do NCI-H2009 e MDA-MB-435 células, respectivamente, por interferência de RNA com duas não sobrepostos short hairpin (SH) construções independentes, RNA. Obtivemos -75% downregulation de TRKB em células NCI-H2009 (Figura 7A). No entanto, isso não alterou a morfologia celular (parte superior do painel Figura 7B), nem a resistência anoikis (painel inferior Figura 7B). Da mesma forma, ~ 80% de regulação negativa TRKB em células MDA-MB-435 (Figura 7C) não teve nenhum efeito sobre a morfologia celular (Figura 7D painel superior) e resistência anoikis (Figura 7D painel inferior). Consistente com estas observações, os níveis de E-caderina não foram alteradas após knockdown TRKB em qualquer linha de células (Figura 7E). Além disso, não se observou qualquer efeito sobre a proliferação celular (dados não mostrados). Não obstante TRKB não foi totalmente esgotado em qualquer linha de células, estes resultados sugerem que (mutante) TRKB em NCI-H2009 e células MDA-MB-435 não é um dos principais motores do seu fenótipo transformado.

(A) qRT-PCR demonstrando knockdown dos níveis de mRNA TRKB com dois grampos de cabelo curto não sobrepostos (SH). Os valores médios de três medições independentes sejam mostrados, as barras de erro representam os desvios padrão. (B) Queda de TRKB nem afecta a morfologia de crescimento aderente de células NCI-H2009, fotografado na ampliação de 50x (painel superior), nem a resistência anoikis de células NCI-H2009 em suspensão (painel inferior). placas ULC foram digitalizados em 1x ampliação 6 dias após a semeadura. (C) qRT-PCR demonstrando knockdown de ARNm TRKB níveis com dois ganchos curtos não sobrepostos. Os valores médios de três medições independentes sejam mostrados, as barras de erro representam os desvios padrão. (D) Queda de TRKB nem afecta a morfologia de crescimento aderente de células MDA-MB-435, fotografado na ampliação de 50x, nem resistência anoikis de células MDA-MB-435 em suspensão (painel inferior). placas ULC foram digitalizados em 1x ampliação 6 dias após a semeadura. (E) Queda de TRKB em NCI-H2009 e células MDA-MB-435 não afecta os níveis de proteína E-caderina, tal como avaliado por análise de imunotransferência (IB). As exposições longas e curtas do mesmo blot são mostrados. β-actina serve como controle de carga

Discussão

Três somática, mutações pontuais não sinónimas de TRKB foram relatados nos primeiros estudos de sequenciamento em larga escala em cânceres humanos:. dois em tumores colorretais, TRKB

T695I e TRKB

D751N [17], e um em uma linha de células de adenocarcinoma de pulmão, TRKB

L138F [19]. Foram identificados um ponto de mutação adicional TRKB, TRKB

P507L, na linha celular de melanoma humano MDA-MB-435. Embora alguns destes mutantes têm sido propostos como genes-condução cancerosas candidatos [17], de forma inesperada, a nossa análise em células epiteliais de rato e em linhas celulares de tumores humanos não conseguiram fornecer suporte para um efeito de ganho-de-função de qualquer um dos quatro TRKB mutações pontuais. Na verdade, as duas mutações pontuais trkB derivadas de tumores colo-rectais foram associadas a actividade de quinase ainda reduzida e potencial oncogénico, em comparação com o tipo selvagem TRKB. Como uma nota de advertência, tem de se ter em mente que nós não testar os mutantes TrkB derivadas de tumores colorretais em seu contexto original, ou seja, os tumores que expressam endogenamente TRKB

T695I ou TRKB

D751N, enquanto que as linhas celulares derivadas da mesma não estão disponíveis. No entanto, a exposição a BDNF de ambos epitelial de ratos e células cancerígenas do cólon humano que expressam estes mutantes resultou na ativação do receptor reduzido de TRKB

T695I e quase nenhuma ativação de TRKB

D751N. Isto sugere fortemente que estes mutantes possuem uma deficiente actividade enzimática no contexto da estimulação BDNF. Ele ainda levanta a possibilidade de que TRKB

T695I e TRKB

D751N pode agir de uma forma negativa dominante, e que tipo de TRKB selvagem podem também ter tumor actividade supressora (ou uma função dupla) no câncer de cólon, mas novos estudos ser obrigado a responder a estas questões importantes. Não podemos excluir a possibilidade de que a capacidade de resposta TRKB

T695I e TRKB

D751N a outros ligantes TrkB pode ser diferente daquele ao BDNF. Nós também não podemos excluir formalmente a possibilidade de que TRKB

T695I e TRKB

D751N pode ter sido selecionado para nos tumores originais, contribuindo para a formação de tumores com funções que são diferentes daquelas que nós testamos

in vitro

. Estas questões não obstante, nós sentimos que é justo dizer que estas mutações não satisfazem os critérios convencionais para activação mutacional de cinases receptoras.

Teoricamente, todas as mutações que residem na parte citoplasmática do receptor poderiam influenciar a ligação de proteínas adaptadoras ou substratos de trkB independentes do efeito sobre a actividade de quinase. A presença e a função destes parceiros de ligação dependerá do contexto celular e pode ser diferente em diferentes linhas celulares. Embora o mecanismo para a função oncogénica prototípico de tirosina-quinases é a actividade de cinase constitutiva ou melhorada com a sinalização a jusante alterada [37], do receptor de tirosina-quinases podem ter também funções independentes-quinase que contribuem para o cancro. Isto tem sido demonstrado para EGFR de tipo selvagem, que, independentemente da sua actividade de cinase, interage com e deste modo estabiliza sódio /co-transportador de glicose 1 (SLGT1) [38]. Regulação negativa, mas não a inibição enzimática, de EGFR conduz a níveis reduzidos SLGT1, reduziu a absorção de glicose e autofagia de células tumorais [38]. Se uma função semelhante está também associada com TRKB não é conhecido. Um estudo recente sugere que o TRKB-T1 variante de splicing deficientes em quinase, mediante a sobre-expressão artificial, pode estimular a metástase de células de adenocarcinoma pancreático [39]. Mais pesquisas são necessárias para elucidar funções independentes de quinase de TRKB e sua contribuição para a doença maligna, em particular para resolver qualquer papel da proteína endógena em células cancerosas.

Temos identificados e caracterizados também um ponto de mutação TRKB romance , TRKB

P507L, que isolado a partir da linha de células de tumor MDA-MB-435.