Abstract

Este estudo examinou o valor do marcador de sangue S100A1 na detecção de cardiotoxicidade induzida por agentes quimioterápicos; trastuzumab e lapatinib, no coração normal de rato. Os ratos foram divididos em três grupos: controlo (n = 8, sem tratamento), T (n = 8, um tratamento ip vez com 10 mg /Kg de trastuzumab) e L (n = 8, o tratamento oral com 100 mg /kg /lapatinib dia durante 7 dias). As actividades dos parâmetros de estresse oxidativo malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa (GSH) foram medidos a partir dos tecidos cardíacos extraídos. Os níveis de expressão e troponina i S100A1 foram medidos a partir de amostras de sangue. Todos os biomarcadores respondeu aos tratamentos como eles exibiram alterações a partir de seus valores normativos, validando a cardiotoxicidade induzida quimicamente. expressão S100A1 atenuou significativamente (75%), o que fez a detecção sensível de cardiotoxicidade viável. Avaliação de cardiotoxicidade com S100A1 pode ser uma alternativa valiosa em oncologia clínica dos casos de câncer em alguns órgãos, como mama e próstata, uma vez que não sobre-expressar-lo para competir contra

Citation:. Eryilmaz U, Demirci B, AKSUN S , Boyacioglu H, Akgullu C, Ilgenli TF, et ai. (2015) S100A1 como um diagnóstico potencial biomarcador para Avaliação de cardiotoxicidade e Implicações para a quimioterapia de certos cancros. PLoS ONE 10 (12): e0145418. doi: 10.1371 /journal.pone.0145418

editor: Daniele Generali, instituti Ospitalieri di Cremona, Itália

Recebido: 22 de junho de 2015; Aceito: 03 de dezembro de 2015; Publicação: 18 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Eryilmaz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. M. Bilgen é financiado pela Comissão Científica e Tecnológica Conselho de Investigação da Turquia (Research Grant TUBITAK 1001-113E177). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução proteínas

S100 são uma família de proteínas multifuncionais caracterizadas por expressões de tecidos e específicos de células em vertebrados [1]. S100A1 é um membro desta família e predominantemente expressa em coração, em menor grau no músculo esquelético e em níveis baixos na maioria dos tecidos normais [2]. expressão S100A1 aumenta a contratilidade do miocárdio e é regulada para baixo após lesão cardíaca [3]. Mas, se tal comportamento ocorrer em cardiotoxicidade ainda não foi validado. A pesquisa atual está focada em identificar biomarcadores confiáveis ​​sensível e específico para insuficiência cardíaca de diferentes causas [4-10]. Se confirmado, S100A1 pode tornar-se um biomarcador clínica tanto para diagnóstico ou diferenciação em conjunto com outros marcadores, v.g. proteína troponina i e C-reativa, para avaliar o estado do miocárdio expostos a toxicidade [11-13]. O objetivo do presente estudo é testar este potencial de S100A1 com experimentos realizados em ratos, utilizando agentes de quimioterapia; trastuzumab e lapatinib, que provaram registros de induzir cardiotoxicidade [14-19]

Materiais e Métodos

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal (Número do Documento institucional:. 4583101/2014 /168). As experiências foram realizadas com um total de 24 ratos Wistar (12 semanas de idade, machos albinos). Os ratos foram divididos em grupos experimentais. Medidas, indicativo de cardiotoxicidade, incluídos parâmetros bioquímicos sensíveis ao estresse oxidativo no miocárdio, e os níveis sanguíneos de S100A e troponina i. Troponina i foi incluído como um marcador de referência [20]. Os resultados foram depois analisados ​​estatisticamente e discutidos para inferências

Especificamente, os ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos:. Controle (C, n = 8), trastuzumab (T, n = 8) e lapatinib (G, n = 8) tratamentos. Os animais de controlo não foram tratados, mas os outros em grupos T e G foram administrados com os fármacos de quimioterapia. Trastuzumab (Herceptin

R, Istambul, Turkey) foi entregue uma vez a uma dose de 10 mg /kg /dia por meio de injecção intraperitoneal no primeiro dia do estudo. Lapatinib (Tykerb

®, GlaxoSmithKline, Istambul, Turkey) foi administrada diariamente a uma dose de 100 mg /kg /dia por gavagem oral, durante 7 dias consecutivos. As doses seleccionadas foram equivalentes aos usados ​​nas clínicas. No dia 8, a anestesia foi induzida por uma única injecção intraperitoneal de cetamina e xilazina (50 e 5 mg /kg, respectivamente). As amostras de sangue foram coletadas e os corações foram removidos para análise bioquímica.

análise bioquímica

O sangue coletado de cada animal foi centrifugado (Hettich Zentrifugen, Mikro 200 R, Tuttlingen, Alemanha) a 10.000 ×

g

durante 10 min a 4 ° C e o soro foi conservado a -80 ° C até a análise. O nível de troponina i no soro foi medido utilizando um imunoensaio em autoanalisador ADVIA Centaur CP (Siemens, Alemanha). O nível S100A1 soro foi determinada usando uma proteína do rato kit S100A1 ELISA (Sensibilidade 1,56 ng /ml; Cusabio Biotech, China), de acordo com as instruções dos fabricantes. A densidade óptica foi medida a 450 nm utilizando um leitor de placas de ELISA automático (Bioctech, EUA).

As actividades de malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa (GSH) foram medido através dos seguintes procedimentos, como nos nossos estudos anteriores [21-23]. O tecido do coração dissecados a partir de cada animal foi homogeneizada a 2000 rpm /min (10/01 w /v), utilizando um agitador de Teflon-vidro (agitador suspenso IKA, Alemanha) em 150 mM de tampão de fosfato (pH 7,4) em gelo. O homogeneizado foi centrifugado (Hettich Zentrifugen, Mikro 200 R, Tuttlingen, Alemanha) a 6000 × g durante 10 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram congelados a -80 ° C (temperatura do congelador geleira ultrabaixa, Japão) até à análise. O teor de proteína nos sobrenadantes foram determinados por um espectrofotômetro (Shimadzu UV-1601, Quioto, Japão), utilizando kits disponíveis comercialmente para o método do Biureto (Archem diagnóstico Ind. Ltd., Istambul, Turkey). As concentrações de MDA foram medidos a 532 nm de acordo com o método de Ohkawa et ai. [24]. A peroxidação lipídica do homogenato de tecido foi determinada pela formação de substâncias reactivas ao ácido thiobarbutric. Tecido MDA concentração expressa como proteína de tecido nmol /mg (coeficiente de absorvância ε = 1.56×105 /H /cm). actividade SOD foi determinada de acordo com o método de Sun et ai. [25], e a absorvância foi medida a 560 nm. Este método baseia-se na inibição da redução do azul nitro de tetrazólio usando a xantina: sistema xanthineoxidase como um gerador de superóxido. O valor medido indicado o grau de inibição desta reacção. Os resultados foram mostrados como U /mg de proteína de tecido. A actividade de CAT foi determinada por medição da decomposição do peróxido de hidrogénio a 240 nm e expressa como K /mg de proteína de tecido, em que k é a constante de velocidade de primeira ordem [26]. nível total de GSH nos sobrenadantes foram determinados de acordo com o método de Tietze [27]. O sobrenadante foi precipitado e medido com um ensaio cinético utilizando 5,5′-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzóico). A absorvância foi medida a 412 nm. A concentração de GSH medido foi comparado com o padrão de GSH solução aquosa (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, EUA) e expressa como proteína de tecido mg /g. Todos estes ensaios de atividade enzimática foram analisadas em duplicado, e as leituras foram em média para chegar a um valor final para cada ensaio.

Análise Estatística

Todas as medidas para os biomarcadores (MDA, SOD, CAT, GSH, troponina i e S100A1) foram tabulados para os grupos experimentais (C, T e G) e analisados ​​estatisticamente usando testes não paramétricos, assumindo distribuição não gaussiana devido ao tamanho reduzido grupo (n = 8). As diferenças estatisticamente significativas nas medições foram determinadas usando comparação de grupos múltiplos com o teste tanto Mann-Whitney U aplicada entre dois grupos (T ou G com C) e teste de Kruskal Wallis como aplicado a todos os três grupos. As estatísticas descritivas de cada marcador foram representados com diagramas de caixa (no mínimo, 25% percentil, mediana, 75% percentil, no máximo) e em uma tabela (média ± erro padrão) valores. Bicaudal

valores P

foram obtidos a partir dos testes estatísticos e relatados de forma explícita. O nível de significância estatística foi estabelecido em

P .

0,05

Resultados

Os ratos de todos os grupos tolerado os procedimentos e sobreviveram sete dias, sem efeitos colaterais visíveis ou complicações . As medições de parâmetros de todos os grupos foram resumidos, com parcelas na Fig 1 e Fig 2, e na tabela 1. As leituras do grupo de controlo estavam dentro da gama normal, tal como relatado na literatura [21-23]. Mas, aqueles nos grupos de trastuzumab e tratamento lapatinib indicaram mudanças substanciais na bioquímica dos corações (Fig 1 e Tabela 1). O nível de MDA aumentou significativamente, mas as actividades de SOD, CAT e GSH atenuada consideravelmente. Estes resultados confirmaram que a exposição aos fármacos de tratamento de quimioterapia; trastuzumab e lapatinib, de fato induzida lesão tóxica através de dano oxidativo nos corações de ratos

Painéis mostram gráficos para os marcadores bioquímicos malonildialdeido (MDA).; A superóxido-dismutase (SOD); Catalase (CAT); A glutationa (GSH). Grupo Multi teste de Kruskal Wallis rendeu

P

= 0,0003, 0,0003, 0,0002 e 0,0005, respectivamente. * Indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle C (ver Tabela 1).

Painéis mostram gráficos para os marcadores troponina i e S100A1. Grupo Multi teste de Kruskal Wallis rendeu

P

= 0,0280 e 0,0354, respectivamente. * Indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle C (ver Tabela 1).

troponina i e S100A1 foram detectadas nos soros adquiridos de todos os grupos, mas as suas expressões respondeu oposta a cardiotoxicidade, como visto na Figura 2 e na Tabela 1. o efeito foi positivo na troponina i, mas negativo para o nível S100A1.

drogas Discussão

Trastuzumab e lapatinib são clinicamente aprovados utilizados para o tratamento de tumores em pacientes humanos, mas eles também induzir efeitos secundários de toxicidade nos órgãos, incluindo o coração [28]. A exposição a estes agentes de quimioterapia resulta em excesso de produção de radicais livres de oxigénio e redução de actividades das enzimas antioxidantes em órgãos vitais. A geração de radicais livres constitui um dos mecanismos subjacentes à intoxicação do coração [18]. Em estágios pré-clínicos, o dano tecidual resultante e apoptose é normalmente identificado por ex vivo análises bioquímicas envolvendo os indicadores conhecidos (MDA, SOD, CAT, GSH). No estudo atual, as mudanças nas atividades desses marcadores indicaram que trastuzumab e lapatinib nas doses administradas induzida pelo dano oxidativo grave no tecido cardíaco de ratos. Estes achados apoiou os relatórios publicados anteriormente [15, 20].

biomarcadores de sangue com base são importantes na prática clínica como eles podem ser detectados por ensaios, que são fáceis de realizar e produzir tecido dados quantitativos específicos e reprodutíveis [17 ]. A presente investigação indicaram que o tecido cardíaco em resposta à intoxicação alterou as expressões de ambos troponina i e S100A1. Troponina i é um biomarcador de soro estabelecido, que se correlaciona com o dano em cardiomiócitos [29-32]. A amplificação de troponina i não foi uma surpresa, e no presente estudo, esta característica serve como prova de confirmação para referência que descreve a presença de lesão cardíaca. Em clínicas, a elevação da troponina i é considerado como um sinal comum de cardiotoxicidade em pacientes passando por quimioterapia [15, 30, 31, 33, 34]. Mas, o grau de disfunção cardíaca nestes doentes é tipicamente avaliada utilizando ferramentas radiológicas sensíveis [35].

lesão do miocárdio após um enfarte ou cocaína-uso ou disfunção neurológica, S100A1 expressão é conhecida por ser sub-regulada [36]. Mas, antes deste inquérito, não estava claro se essa resposta também poderia ocorrer por lesão digestiva induzido quimicamente. Os resultados deste estudo demonstraram a viabilidade da detecção de cardiotoxicidade com o marcador drived de sangue S100A1. Este resultado tem implicações importantes do ponto de vista da prática clínica, como explicado abaixo.

Conclusão e Trabalhos Futuros

O tratamento com trastuzumab e lapatinib induz dano oxidativo no tecido do miocárdio. A cardiotoxicidade resultante é detectável com a atenuação na expressão S100A1 ou aumento do nível de troponina i no sangue.

Em muitos tumores, as expressões de proteínas S100 são alterados [37]. No entanto, S100A1 é sobre-regulada apenas em cancros do rim, pele e ovário. Assim, o rastreio S100A1 após a quimioterapia destes cancros específicos não podem revelar com precisão a cardiotoxicidade. No entanto, avaliar de forma confiável cardiotoxicidade no tratamento dos cancros de outros órgãos, como mama e próstata ainda pode ser uma possibilidade e garante uma maior exploração [38]. Este estudo estabelece o primeiro passo nesta direção, demonstrando a resposta S100A1 a cardiotoxicidade induzida pelo trastuzumabe e lapatinib em ratos de outra forma normais.

Em investigações experimentais com camundongos transgênicos e knockout S100A1, down-regulação da proteína S100A1 foi mostrados para contribuir para contrátil disfunção após infarto do miocárdio [39]. Em miocárdio de camundongos knockout, severamente prejudicada Ca

2 + ciclismo e adrenérgico β sinalização estavam presentes no retículo sarcoplasmático. Além disso, a disfunção mitocondrial foi envolvido em induzida pelo estresse cardiomiopatia [40]. Assim, após o tratamento de quimioterapia, mecanismo fisiopatológico semelhante pode ser responsável pela perda de desempenho contráctil e propensão para a insuficiência cardíaca. Investigação deste aspecto potencial com modelos transgênicos e knockout também permanece para o futuro.