Abstract

A metástase e resistência às drogas são as principais barreiras para o tratamento de não- cancro do pulmão de pequenas células (NSCLC). Para explorar novas opções terapêuticas, nós encapsulado com sucesso MicroRNA-34a (miR-34a), um supressor de tumor endógeno potente no NSCLC em S6 dendrimer aptâmero conjugado para formar nanopartículas de entrega de genes segmentados por cancro do pulmão (PAM-AP /PN PMIR-34a) . NPs PAM-AP /PMIR-34a tinha um diâmetro de 100-200 nm e potencial zeta de ~ 30 mV em relação a /P N aplicado. A conjugação aptâmero melhorou significativamente a absorção celular, bem como a eficiência da transfecção do gene da MAP-AP PN /PMIR-34a em células NSCLC cultivadas. Nós mostramos que PAM-AP /PMIR-34a NPs reforçada a regulação dos genes-alvo, BCL-2 e p53

in vitro

. Além disso, revelou PAM-AP PN /PMIR-34a inibiu significativamente o crescimento celular, migração, invasão e apoptose induzida de células de câncer de pulmão em comparação com NPs não-alvo. O método proporcionado um nova estratégia terapêutica para o tratamento de NSCLC experimental

citação:. Wang H, X Zhao, Guo C, Ren D, Zhao Y, Xiao W, et al. (2015) Aptamer-dendrímeros bioconjugados para administração orientada de miR-34a Expressando plasmídeo e efeitos antitumorais em Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (9): e0139136. doi: 10.1371 /journal.pone.0139136

editor: Valentin Cena, Universidad de Castilla-La Mancha, Espanha

Recebido: 05 de maio de 2015; Aceito: 08 de setembro de 2015; Publicação: 25 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pela Ciência e Tecnologia de Desenvolvimento do Projeto Plano da província de Shandong (2013WS0273). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. Aproximadamente 85% de todos os casos de cancro do pulmão clínicos são o cancro do pulmão não pequenas (NSCLC) [2, 3]. Apesar de inúmeros avanços no tratamento cirúrgico, quimioterapia e agentes direcionados moleculares para NSCLC, metástase e resistência a múltiplas drogas ainda são as principais causas para as falhas no tratamento de pacientes com câncer de pulmão [4, 5]. Assim, é altamente desejável desenvolver novas abordagens terapêuticas para além do tratamento convencional para a NSCLC. MicroRNAs (miARNs) foram mostrados para desempenhar um papel importante no progresso de cancros humanos e podem ser alvos eficazes para a terapia do cancro [6]. MiRNAs são pequenos RNAs de ~ 22 nucleótidos de comprimento que são reguladores críticos da expressão do gene [7]. ARNm alvo miARNs maduro em locais complementares, o que leva à degradação do mRNA e supressão de translação [8, 9]. Entre as mais de 700 miARNs humanos identificados, miR-34a é um alvo transcricional de supressor de tumor p53 [10], e regulados negativamente a expressão de miR-34a correlacionam-se com uma probabilidade elevada de recidiva em doentes com NSCLC [11]. Além disso, a sobre-expressão de miR-34a inibe o crescimento e a metástase de NSCLC, regulando diversas supressores de tumores ou oncogenes, tais como p53, BCL-2, c-Met e CDK4 [12]. Relatórios anteriores revelaram que a sobreexpressão de miR-34a pode evitar a progressão e metástase de NSCLC, bem como aumentar a sensibilidade quimioterapia.

O desenvolvimento de terapias baseadas em miARN tem-se tornado uma estratégia alternativa promissora para o tratamento convencional, incluindo quimioterapia e radioterapia para tratamento de NSCLC. No entanto, a aplicação clínica de miARNs encontra muitos desafios biológicos, tais como a depuração rápida do sangue, fraca estabilidade no soro e a absorção celular inadequada [13]. sistemas de entrega de nano-tumorais direccionamento têm sido desenvolvidos para superar estes problemas [14, 15]. nanocomplexes carregado-Gene são considerados como sendo um melhor ajuste para a terapia do cancro, devido à sua acumulação passiva em tumores sólidos por sua permeabilidade aumentada e propriedades de retenção (EPR), em que os tumores de crescimento rápido [16]. A funcionalização dos polímeros com ligandos de direccionamento celular específicos podem aumentar a sua acumulação do tumor mais de efeito EPR [17], o que melhora a eficiência da transfecção e biocompatibilidade destas nanocomplexes carregado para o gene.

Poliamidoamina (PAMAM) são catiônicos com dendrítica estrutura. Por meio de interacções electrostáticas, PAMAM e carregados negativamente nanocomplexes forma pADN que são amplamente utilizados como vectores de genes não virais para transfectar ADN ou ARN exógeno em células [18]. Mais importante, o peso molecular e a densidade de carga de PAMAM pode ser facilmente manipulado para ter segurança superior. Até à data, uma ampla variedade de potenciais marcadores para cancro do pulmão foram identificadas, tais como EGFR, TP53, CA-125 e CEA, mas a ausência de especificidade e sensibilidade era ainda um problema na prática de administração de fármaco alvo [19].

Os aptâmeros são curtos, os oligonucleótidos de cadeia simples (DNA ou RNA) seleccionado a partir de processo de SELEX (evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial). Comparado com os anticorpos, as vantagens de aptâmeros são distintos, tais como a síntese e modificação conveniente, de elevada afinidade e especificidade para as moléculas alvo, de baixa imunogenicidade, menor toxicidade, maior estabilidade e rápida penetração dos tecidos [20, 21]. Portanto, nanocomplexes aptâmeros-conjugado pode entregar oligonucleótidos de uma forma específica do tipo de células com a eficácia de transfecção melhorada e /ou efeitos colaterais reduzidos para as células normais [22]. Vários aptâmeros específicos de células têm sido utilizados para a entrega de genes, mas um aptâmero Nano-conjugado utilizado no tratamento de NSCLC é limitada. Em nosso trabalho, nós desenvolvemos conexão PAMAM-PEG-aptâmero (PAM-Ap) usando S6, um aptâmero selecionados contra as células cancerosas do pulmão A549 por células-SELEX [23] e adotado para funcionalizar PAMAM G5.0, então eu misturei o PAM Ap com PMIR-34a para construir o NPS (PAM-AP /PMIR-34a) nanopartículas PAM-AP /PMIR-34a para entregar de pDNA para as células de câncer de pulmão. Em seguida foi avaliada a eficiência e antitumor efeito transfecção gene da PAM-AP PN /PMIR-34a em células A549. Nossos dados mostram o sistema bioconjugates-dendrimer Aptamer é uma maneira eficiente para entregar o miR-34a expressando plasmídeo para células de câncer de pulmão de células não-pequenas.

Materiais e Métodos

Materiais

Poliamidoamina (PAMAM, núcleo de etileno diamina, G5.0) e 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). polietileno glicol succinimidil éster maleimida (Mal-PEG-NHS, Mw 2000) foi adquirido a Bio-matriz Inc. (Jiaxing, China). GelRed

mancha de gel de ADN TM foi adquirido a Biotium (CA, EUA). de soro bovino fetal (FBS), meio de cultura RPMI-1640, solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), tripsina, penicilina-estreptomicina e YOYO-1 foram adquiridos a partir de iodeto de Invitrogen /Life Technologies (Carlsbad, CA). Anexina V-FITC e kit de coloração com iodeto de propídio (PI) foram da BD Biosciences (San José, CA). Kit de contagem celular 8 (CCK-8), RIPA tampão de lise e a proteína de BCA kit de ensaio de proteínas foram adquiridos a Beyotime (Nanjing, China). celular A549 aptâmero de ligação (S6, sequência: GTGGCCAGTCACTCAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG) com o grupo sulfidrila na extremidade 5 ‘foi sintetizado por RiboBio Co. Ltd. (Guangzhou, China). O miR-34a e reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) que co-expressam o plasmídeo (PMIR-34a, sentido: 5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3 ‘, anti-sentido: 5′-AACCAGCUAAGACACUGCCAUU-3′) e plasmídeo de controlo negativo (PMIR-NC, sentido: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘, anti-sentido: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’) foram obtidos a partir de SunBio Co.Ltd (Xangai, China). A linha de células NSCLC humano A549 foi obtido a partir do Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, CAS (China). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, penicilina (100 UI /mL) e estreptomicina (100 mg /mL) a 37 ° C incubadora com 5% de CO

2.

Síntese aptâmero de dendrímero conjugado (PAM-Ap)

Para sintetizar o conjugado aptâmero dendrímero, PAMAM 100mg (solução em metanol) foi seco sob azoto e dissolvidos em 5 mL de PBS (pH 7,2). Em seguida, 20 mg Mal-PEG-NHS (Mw 2000) foi adicionado à solução de PAMAM e agitou-se durante 6 h, e em seguida a mistura foi dialisada em água destilada utilizando uma membrana de diálise (MWCO 3500 Da) durante 24 h para remover Mal-PEG que não reagiu NHS, seguido de liofilização para obter PAMAM peguilado (PAM-PEG-Mal). Para a conjugação de aptâmero S6, 25 mg de PAM-PEG-Mal foi dissolvido em 2 mL de PBS (pH 7,2). Em seguida, 50 nM S6 aptâmero foram misturados com a solução durante 6 horas, o produto foi em seguida dialisado contra água destilada utilizando uma membrana de diálise (MWCO 7500 Da) durante 12 h e liofilizada para obter PAMAM-PEG-Ap (PAM-Ap).

Formulação e caracterização de pADN-carregado nanopartículas

para a avaliação capacidade de ligação de ADNp, 1 ug de ADNp foi misturado com a PAM-AP a relação N /P de 0,5 a 16 em PBS (pH 7,2 ). Cada amostra foi agitada em vórtex durante 20 segundos, incubadas durante 30 min à temperatura ambiente para formar PAM-AP /pADN PN. Em seguida, as amostras foram sujeitas a electroforese em gel de agarose a 1,5% contendo GelRed

TM durante 20 min (100 V), e as bandas de pADN foram visualizados sob luz UV. Para tamanho de partícula e potencial zeta de medição, PAM-AP /pADN NPs foram preparadas em diferentes relação N /P de água destilada e determinada por um Zetasizer Nano ZS (Malvern Inc., Westborough, MA). Para o teste de estabilidade no soro, o nu PMIR-34a, PAM /PMIR-34a e complexos /PMIR 34a-PAM-AP (N /P = 40) foram incubadas em 50% de FBS a 30 ug /mL. As misturas foram incubadas a 37 ° C durante intervalos de tempo diferentes. Depois disso, 20 uL das misturas foram tratadas com solução de heparina 10 ul (1000 U /mL) para libertar o ADNp carregado após electroforese num gel de agarose a 1,0% w /v contendo GelRed

TM durante 15 min. O pADN não degradado foram visualizados sob luz UV.

citometria de fluxo para absorção celular de ensaio

As células A549 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 3 x 10

5 células por poço e cultivadas durante 24 h. PAM-AP /pDNA ou PAM /pADN NPs foram preparados com pADN YOYO-1 marcado (1 molécula de YOYO-1 a 20 iodeto de pares de bases de nucleótidos) a relação N /P de 40. Antes da transfecção, o meio de cultura foi removido. Depois, 2 ml de meio isento de soro contendo meio RPMI 1640 PAM-AP /pDNA ou PAM /pADN NPs foram adicionados a cada poço (pADN 4 ug /poço). Após 4 h de incubação, o meio de transfecção foi removido. As células foram lavadas, tripsinizadas e novamente suspensas em DPBS e as amostras foram imediatamente determinada por citometria de fluxo (BD, San Jose, CA). Para estudo de competição de S6 aptâmero mediada captação celular de PAM-Ap, as células A549 foram semeadas em placas de 6 poços, 30 min antes do tratamento PAM-AP /pDNA NPs, um excesso de 50 vezes de S6 aptâmero foi adicionado ao meio de cultura e incubou-se durante 4 h antes de analisadas as células como acima.

microscopia confocal de varrimento de laser (CLSM) estudo

as células A549 foram semeadas em lamelas de vidro em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10

4 por poço e cultivadas durante 24 h. O YOYO-1 marcado PAM-AP /pDNA ou PAM /pADN NPs foram preparados com o mesmo método como descrito acima. As células foram transfectadas com o PAM-AP /pDNA ou PAM /pADN PN a uma concentração de 1 ug de ADNp /poço. Após 4 h de incubação, as células foram lavadas e fixadas com formaldeído a 4%, coradas com DAPI. Os polímeros /nanopartículas pADN extracelulares foram lavados com DPBS contendo heparina. As imagens foram tiradas com o laser confocal de varredura microscópio (Olympus, Japão).

A eficiência de transfecção de avaliação

Para avaliar a eficiência de transfecção, 1,5 × 10

5 de células A549 foram semeadas em 12 Bem placas e cultivadas durante 24 h. As células A549 foram transfectadas com o PAM-AP /PMIR-34a ou PAM /nps PMIR-34a (2 ug PMIR-34a por poço), a relação N /P de 10, 20 e 40 durante 4 h. Após a transfecção, o meio foi substituído e as células foram cultivadas durante mais 48 h. A EGFP células expressando foram fotografadas por microscopia de fluorescência (Leica, Alemanha) e quantificado por citometria de fluxo.

Isolamento de ARN e análise de qPCR

Os níveis de BCL-2 e p53 ARNm foram determinados por quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR). As células A549 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 3 x 10

5 por poço e cultivadas durante 24 h. A transfecção de PAM-AP /PMIR-34a ou PAM /nps PMIR-34a foi realizada como descrito acima. Após 48 h de incubação, o meio de cultura foi removido e as células foram lavadas com PBS. O ARN total foi isolado utilizando RNeasy mini-kit (Qiagen, Germantown, MD) de acordo com o protocolo do fabricante. Os níveis de ARNm de p53 e BCL-2 foram quantificadas usando iScript

TM de uma etapa estojo de RT-PCR com SYBR Green (Bio-Rad, CA) utilizando

sistema de detecção de TM5 de RT-PCR iQ. níveis de expressão génica relativos foram calculados de acordo com um método comparativo Ct contra nível de expressão β-actina de controlo endógeno. Os dados estão normalizados para Bcl-2 ou a expressão de p53 nível de células não tratadas. As sequências de iniciadores específicos para o gene para qPCR são como se segue: β-actina (sentido) 5′-GGATCCGACTTCGAGCAAGAGATGGCCAC-3 ‘(anti-sentido) 5′-CAATGCCAGGGTACATGGTGGTG-3′; BCL-2 (de sentido) 5’-TTGGATCAGGGAGTTGGAAG-3 ‘(anti-sentido) 5′-TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3′; p53 (sentido) 5’-ACCAGGGCAGCTACGGTTTC-3 ‘(anti-sentido) 5′-CCTGGGCATCCTTGAGTTCC-3’.

análise de Western blot

células A549 foram cultivadas e tratadas como tal como descrito acima. A proteína total foi extraída de tampão de lise RIPA e foi quantificada pelo kit de ensaio de proteína BCA. 40 mg de proteína foram carregadas e separados em 10% Pronto Gel de Tris-HCl em gel (Bio-Rad, CA) e, em seguida, transferida para um fluoreto de polivinilideno (PVDF) de membrana (Millipore, Bedford, MA). A membrana de PVDF foi bloqueada com leite desnatado a 5% durante 1 h, e sondadas com anticorpos primários à temperatura ambiente durante 1 h. Subsequentemente, a membrana foi corada com anticorpo secundário conjugado com HRP e as bandas foram detectadas com o kit ECL Plus (Beyotime, Nanjing, China).

Ensaio de Citotoxicidade

citotoxicidade in vitro foi avaliada por CCK-8 de ensaio. As células A549 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 6000 células por poço e cultivadas durante a noite. As células foram transfectadas com o PAM-AP /PMIR-NC, PAM /PMIR-34a ou PAM-AP /NPs PMIR-34a por 4 h (2 ug /mL PMIR-34a), em seguida, o meio foi substituído e as células foram adicionalmente incubadas durante 24 h, 48 h, 72 h ou 96 h. Após a remoção dos meios de comunicação, 100 uL de meio de cultura contendo 10 uL de CCK-8 foi adicionado a cada poço e incubou-se durante mais 1 h, a absorvância de cada poço foi medido utilizando um leitor de microplacas (Thermo Scientific, MUTISKAN MK3) a 450 nm comprimento de onda . A viabilidade celular das células A549 foi expressa em relação às células não tratadas.

A análise celular apoptose

A apoptose de células A549 foram determinadas por citometria de fluxo como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, as células A549 foram semeadas em placas de 12 poços a uma densidade de 1 x 10

5 células por poço e incubadas durante a noite. As células foram transfectadas com o PAM-AP /PMIR-NC, PAM /PMIR-34a ou PAM-PA /PN PMIR-34a por 4 h (2 ug /mL de pADN), então o meio de transfecção foi substituído e as células foram incubadas durante mais 48 h. Em seguida, as células foram lavadas, tripsinizadas e colhidas por centrifugação. A apoptose das células foi avaliada por citometria de fluxo, após coloração com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) a coloração kit de acordo com o protocolo do fabricante.

In vitro

ensaio de migração e invasão

a capacidade de migração e invasão de células A549 foi avaliada utilizando a câmara transpoço 6,5 mm modificado com membranas de policarbonato (8,0 mm de tamanho de poro) (Costar, Cambridge, Mass). As células A549 (1 × 10

5 células) foram transfectadas durante 24 horas e foram tripsinizadas e suspensas em 200 uL de meio RPMI 1640 isento de soro. Em seguida, as células foram semeadas em câmaras de topo com o não revestidos ou pré-revestidos com 20 mg de Matrigel (para o ensaio de migração e invasão, respectivamente). O meio de cultura contendo FBS a 10% na câmara do fundo foi usado como o quimioatractor. Após 24 h de incubação, as células que não migraram ou não-invasoras foram limpas com cotonetes da câmara superior. As células na parte inferior da câmara foram fixadas com paraformaldeído a 4%, em seguida, coradas com solução de violeta cristal a 0,5% durante 1 h e contadas sob um microscópio em cinco campos predeterminados.

A análise estatística

Dados foram mostrados como a média ± DP. One-way análise de variância (ANOVA) foram conduzidas. Valor P 0,05 foi definido como estatisticamente significativo.

Resultados e Discussão

Síntese e caracterização dos materiais

bifuncional maleimida éster de polietilenoglicol succinimidil (Mal-PEG-NHS) foi adotado para ligar o grupo amino de PAMAM e 5′-tiolada aptâmero S6. A diálise foi usada para purificar o produto. A reacção de PAMAM e Mal-PEG-NHS foi monitorizada por 1H-RMN (300 MHz), com picos específicos para o PAMAM (2,3, 2,4, 2,7, 3,1 ppm) (Figura 1A), PEG (3,6 ppm), a MAL (5,8 , 6,3 ppm) (Figura 1B). Os

Dados 1H-RMN confirmou a formação de PAMAM-PEG-MAL. Utilizou-se as áreas integradas dos picos H-RMN para quantificar a relação entre cadeias de PEG e PAMAM. Com a suposição de 164 prótons metileno por PEG e 2032 por PAMAM, identificamos que o PAMAM-PEG-MAL tinha um rácio de protões PAMAM /PEG de 0,32, indicando que cada PAMAM teve uma média de 3,9 PEG conexão correntes.

Caracterização do PAM-AP nanopartículas /pADN

os conjugados PAM-AP preparados na hora foram dissolvidos em condições aquosas e misturado com pDNA para formar as partículas em escala nano. Os tamanhos médios de PAM-AP /pADN NPs variar de 100 a 200 nm, quando a relação N /P é superior a 5 (Fig 2A). Como relação N /P aumentou, o tamanho do PAM-AP /pDNA NPs caiu abaixo de 200 nm (Fig 2A), e sem alteração no tamanho depois disso. Estes resultados indicaram a formação de nanopartículas densas entre PAM-Ap e ADNp. Como mostrado na Fig 2B e 2C, o tamanho e potencial zeta foram ligeiramente alterado após a conjugação de PEG e aptâmero. O tamanho de PAM-AP /pDNA ainda aumentada para cerca de 150 nm, ao passo que o potencial zeta desceu para cerca de 31mV, indicando que o PEG e aptâmero rodeado superfície da nanopartícula. Além disso, PAM-AP /pADN PN teve distribuição de tamanho mais estreita em comparação com PAM /pDNA NPS. A capacidade pADN condensação do sintetizados PAM-Ap foi medida por retardamento em gel de agarose. As experiências de electroforese em gel mostrou um aumento da relação N /P de NPs PAM-AP /pADN (Figura 2D). E no relação N /P, de 4, retardo completa do PAM-AP /pDNA foi identificado.

(A) O tamanho e potencial Zeta das NPs PAM-AP foram medidos por DLS. (B) A distribuição de tamanho de PAM /pDNA e PAM-AP NPs no N /P = 40. (C) A distribuição de potencial Zeta da PAM /pDNA e PAM-AP NPs no N /P = 40. (D) retardo Gel eletroforese de PAM-AP /pADN NPS. Banda 1: pADN Nu, bandas 2-7: PAM-AP /pADN NPs foram preparadas a relação N /P de 0,5, 1, 2, 4, 8 e 16, respectivamente. (E) Ensaio de estabilidade sérica de ADNp, PAM /pDNA e complexos /PAM pADN-AP em condições FBS a 50% a 37 ° C. Os dados foram mostrados asmean ± SD (n = 3).

O pADN estabilidade em complexos é importante para a entrega eficiente de genes. Um ensaio em gel de agarose foi introduzido para determinar a estabilidade pDNA em soro de 50% para imitar

in vivo

condições. O efeito de protecção contra a degradação de complexos de ADN de soro foi mostrado na Figura 2E. O ADNp nu foi completamente degradada por 50% de FBS após 8 h, enquanto que a PAM /pDNA e PAM-AP /pDNA exibiram efeitos protectores contra soro durante 48 h (Figura 2E). Estes resultados sugerem que o PAM-Ap não só poderia ligar pDNA, mas também protegê-lo contra a degradação no soro, o que poderia contribuir para o potencial de aplicação do sistema de entrega de genes.

captação celular de nanopartículas

O desempenho dos vectores de entrega de genes não virais está intimamente relacionada com os níveis de absorção celular [25]. A fluorescência verde emitida a partir de pDNA /YOYO-1 foi analisada para avaliar a captação celular de PAM-AP /pADN NPS. As células A549 foram incubadas com ADNp nu, PAM /pDNA ou PAM-AP /pADN NPs, respectivamente, e, em seguida, as células positivas YOYO-1 foram quantificadas por citometria de fluxo que representa o grau de absorção celular [26]. A proporção de 1 YOYO-células positivas aumentou com a relação N /P, indicando a absorção celular de NPs foi submetido a relação N /P para uma grande extensão (Fig 3A e 3B). PAM-AP /pDNA PN apresentaram maior absorção celular do PAM nontargeted /pADN NPS. Quando tratados com PAM-AP /pADN PN em relação N /P 40, células A549 exibiram sinais de fluorescência notavelmente mais elevadas (94,2% 1 YOYO-células positivas) em comparação com células PAM /pADN NPs tratados (48,5%-1 YOYO células positivas). Estes resultados sugerem que os PAM-AP /pADN NPs ligam-se preferencialmente a células A549. Para provar ainda que a absorção mediada pelo receptor S6 de PAM-AP /pADN NPs nas células, foi realizada experiência de competição pelo pré-tratamento de células A549 com quantidade excessiva de S6 aptâmero e revelou uma absorção inferior significativo indicando o aptâmero livre bloqueou os locais de ligação de S6 na superfície cytolemma de células A549, que suprimiam a capacidade de segmentação de PAM-AP /pADN NPS.

as células não tratadas foram utilizados como controle. Os dados foram apresentados como média ± SD (n = 3). * P 0,05, diferença significativa entre esses grupos.

Os experimentos foram CLSM próxima realizados para confirmar ainda mais a internalização celular de entrega mediada pelo receptor alvo de PAM-AP /pADN NPs e distribuição de pDNA em células A549 porque trilha CLSM YOYO-1 marcado pDNA (fluorescência verde) formulada em nanocomplexes. Comparado ao PAM não-alvo /pADN PN, células A549 tratadas com PAM-AP /pADN PN apresentaram sinais de fluorescência verde mais fortes após incubação 4h, indicando maior absorção celular dos PN-alvo (Fig 4). Notebaly, sinal de fluorescência foi significativamente reduzida nos aptâmeros pré-tratados células A549 em condições semelhantes, sugerindo que o receptor de endocitose mediada S6 era a principal via de PAM-AP /pDNA NPs de internalização. Além disso, a maioria dos sinais de YOYO-1 foram observados no citoplasma, o que implica os efeitos esponja de protões de PAMAM desempenhou um papel crítico no processo de fuga endossomal /lisossomal [27]. Em conclusão, nossos dados sugerem que a PAM-AP /pADN NPs mostrar tanto célula boa segmentação e endossomal fuga /lisossômico propriedades.

células A549 tratadas com YOYO-1 pDNA rotulados complexados com PAM e PAM-Ap (N /rácio P: 40) com ou sem S6 aptâmero pré-tratados. As células foram incubadas a 37 ° C. Todas as barras de escala são 20 mm.

A eficiência de transfecção de nanopartículas

Depois de demonstrar a captação celular eficiente do PAM-AP /pADN PN, nós próxima medida a eficiência de transfecção de PAM-AP /NPs PMIR-34a em células A549 com um repórter EGFP. Uma vez que o vector de expressão contém PMIR-34a gene fluorescente verde (EGFP) cuja expressão é conduzida pelo promotor do mesmo melhorada, a expressão EGFP pode reflectir directamente os níveis de expressão PMIR-34a e pode ser utilizado para avaliar a eficácia de transfecção. Como mostrado na Fig 5A e 5B, a eficácia de transfecção do gene da MAP-AP PN /PMIR-34a foi muito mais elevada do que a de PAM /nps PMIR-34a em diferentes razões N /P. A expressão do gene exógeno EGFP aumentou com a relação N /P para ambas as nanopartículas. A eficiência de transfecção foi baixa em relação N /P de 10, mas aumentou em relação N /P de 20 e 40. A expressão EGFP de PAM-AP PN /PMIR-34a em células A549 foi claramente observado na proporção N /P de 40 , o que indica que as nanopartículas atingiu eficiência expressão genética eficaz. Da mesma forma, as medições quantitativas de células positivas para EGFP confirmou que 37,9% das células foram transfectadas com sucesso com PAM-AP PN /PMIR-34a quando a relação N /P foi de 40, enquanto era apenas 9,5% para as PN do PAM /PMIR-34a grupo. Além disso, não houve diferenças significativas da percentagem de células transf ectadas entre os dois grupos em todas as proporções de N /P. Estes resultados sugerem que a conjugação aptâmero melhorar significativamente a eficiência de transfecção de PAM-AP /pADN PN. Uma vez que a toxicidade também aumenta com a quantidade de polímeros catiónicos [28, 29], escolhemos nanopartículas em relação N /P 40 para as experiências seguintes.

Os dados foram apresentados como média ± SD (n = 3). Todas as barras de escala são de 200 uM. * P 0,05, diferença significativa entre esses grupos.

Influência da expressão do gene

Sobre-expressão de genes anti-apoptóticos em células cancerosas é considerado como um dos mecanismos de progressão do tumor. Como um regulador potente da apoptose, a BCL-2 foi identificada em vários tipos de cancros [30]. BCL-2 foi encontrado para ser frequentemente sobre-expressa em cancro do pulmão e o seu papel anti-apoptótico é firmemente associada com os seus níveis de expressão de [31, 32]. A sobre-expressão da sequência de BCL-2 em células cancerosas resistência à quimioterapia apoptose induzida por drogas [33]. BCL-2 foi previamente identificada como um alvo a jusante promissora de miR-34a [34]. Como um supressor de tumor, a inactivação de p53 em resposta a alguns sinais de stress cancro associado é uma alteração genética comum na maioria dos tipos de cancro [35]. p53 activado provoca inúmeros resultados biológicos, tais como a reparação de danos menores, regulação do ciclo celular, indução de senescência replicativa e apoptose. A interação entre p53 e miR-34a foi esclarecida em muitos tipos de cancros, incluindo NSCLC [36]. Para avaliar a actividade de activação BCL-2 supressão do gene e gene p53 de PMIR-34a transferidos células A549, que trataram células A549 com PAM-AP /PMIR-34a, PAM /PMIR-34a ou PAM-AP /PMIR-NC NPs e medidos os níveis de Bcl-2 e p53 mRNAs. Os resultados de qPCR mostrou que o nível de ARNm de bcl-2 foi significativamente regulada para baixo e ARNm de p53 significativamente sobre-regulada em células A549 (Figura 6A). Após 48 horas de incubação, observou-se 60,8% de diminuição de BCL-2 expressão do mRNA para o PAM-AP /PMIR-34a, mas apenas 26,5% de redução para PAM /PMIR-34a. Enquanto isso, /PMIR 34a-transfectadas células A549 do PAM-Ap resultou num aumento para o dobro 7,93 ARNm de p53, significativamente mais elevada do que a de PAM /PMIR-34a (2,1 vezes). Da mesma forma, o nível de p53 e proteínas Bcl-2 nas células A549 de expressão foram medidos por transferência Western (Fig 6B). Como esperado, as proteínas apresentaram a mesma tendência como o nível de expressão do mRNA, uma vez a expressão da proteína p53 foi desregulada e proteína BCL-2 foi reduzida nas células A549 PAM-AP /PMIR-34a transfectadas. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o NPS PAM-AP /PMIR-34a são capazes de influenciar genes relacionados e expressão de proteínas em células A549.

As células foram cultivadas durante 48 h depois transfectadas com PAM-AP /PMIR-NC PN PN, PAM /PMIR-34A e PAM-AP PN /PMIR-34a durante 4 h. a análise por PCR em tempo real quantitativo foi adoptada para quantificar a expressão de mRNA, e transferência de Western foi utilizada para determinar a expressão da proteína. As células não tratadas foram utilizados como controle. Os dados foram apresentados como média ± SD (n = 3). * P 0,05, diferença significativa em comparação com o PAM /PMIR-34a.

Inibição

crescimento de células cancerígenas

Em seguida, avaliou-se a

in vitro

efeito anti-proliferação do PAM NPs ap /PMIR-34a em células A549 usando ensaio de CCK-8. Após 24 h, 48 h, 72 h ou 96 h a transfecção, as taxas de inibição do crescimento celular foram medidos. Verificou-se que a PAM-AP PN /PMIR-34a exibiram os efeitos mais fortes antiproliferação em células A549 (Figura 7A). A viabilidade das células de PAM-AP PN /PMIR-34a tratada células A549 mostrou 29,8%, 49,7%, 57,5% e 62,4% inferior ao grupo de controlo após 24h, 48h, 72h e 96h de transfecção, respectivamente. Como o tempo de incubação prosseguiu, a diferença de viabilidade celular entre PAM-AP /PMIR-34a e outros grupos de aumentado, e isto pode ser devido à histerese do gene exógeno expresso por PMIR-34a. É digno de nota que o crescimento PAM-AP /PMIR-NC NPs ligeiramente inibido de células A549. Assim, o aptâmero também contribuiu para o efeito anti-proliferação do PAM-AP /PMIR-34a. Estes resultados experimentais indicaram que o aumento da transfecção de genes em células A549 afectado o crescimento celular. Assim, o NPS PAM-AP /PMIR-34a tem um potencial para ser um sistema de entrega de genes alvo no tratamento de cancro do pulmão.

(A) da citotoxicidade in vitro de PAM-AP /PMIR-NC, PAM /pMiR- 34a e PAM-AP PN /PMIR-34a em células A549 a diferentes pontos de tempo após a transfecção. (B) a apoptose celular de células A549 após o tratamento com NPs PMIR-34a para 48 h PAM-AP /PMIR-NC, PAM /PMIR-34a e PAM-AP /. CCK-8 ensaio foi utilizado para avaliar a viabilidade celular e citometria de fluxo foi utilizada para determinar a apoptose das células com coloração de anexina /PI. Os dados foram apresentados como média ± SD (n = 3). * P 0,05, diferença significativa entre os grupos.

A apoptose tem sido geralmente considerada como sendo um dos mecanismos de morte celular predominante [37, 38]. Como mostrado na Fig 7B, as células apoptóticas e necróticas no grupo de controlo não eram óbvios ( 10%). O tratamento de PAM /PMIR-34a e PAM-AP PN /PMIR-34a aumentou significativamente a percentagem de células apoptóticas precoces e tardias. Além disso, as células tratadas com o PAM-AP PN /PMIR-34a mostrou a maior percentagem de células danificadas no total, o que foi significativamente mais elevado do que o dos outros grupos (P 0,05). Os resultados demonstraram que o NPS PAM-AP /PMIR-34a foram mais eficazes na indução de apoptose de células A549 que não-alvo PAM /PMIR-34a.

In vitro

migração e invasão

Existem várias alterações nas células cancerosas e microambiente do tecido, e as alterações causar células para migrar ou invadir tecidos saudáveis, o que resulta na metástase de câncer [39]. Portanto, a migração e

in vitro

ensaios de invasão são essenciais para avaliar a tendência do processo de metástase. Após transfectadas com PAM-AP PN /PMIR-34a, a capacidade migratória e invasiva de células A549 foram investigados. Tal como mostrado na Fig 8A e 8B, verificou-se que a PAM-AP PN /PMIR-34a inibiu significativamente a migração e a invasão de células A549. Notavelmente, as taxas migratórias e invasivos de células /PMIR-34a tratada PAM-AP foram de 17,7% e 23,8% em comparação com células não tratadas, respectivamente. No entanto, houve um impacto muito mínimo sobre a migração e a invasão de células tratadas com o PAM-AP /PMIR-NC em comparação com os do grupo de controlo, que pode ser inferido que a expressão de miR-34a influenciado principalmente a migração celular e invasão em vez de S6 aptâmero.

As células foram pré-tratadas com PAM-AP /PMIR-NC, PAM /PMIR-34a e PAM-AP /PN PMIR-34a. As células não tratadas foram utilizados como controle. (A) imagens de microscopia representativos de migração e análise quantitativa das células migratórias. (B) As imagens de microscopia representativos de invasão e análise quantitativa de células invasivas. Os dados foram apresentados como média ± SD (n = 3). * P 0,05, diferença significativa entre esses grupos.

Conclusão

Embora a toxicidade de dendrímeros é um dos fatores que limitaram suas aplicações clínicas, dendrímeros foram considerados como portadores de “inteligentes” para a sua capacidade como veículo de entrega de gene intracelular.