Sumário
Estudos anteriores demonstraram que o ADN pode ser transferido a partir de morrer células manipuladas para células vizinhas através da fagocitose de corpos apoptóticos, que conduz a transformação celular. Aqui, nós fornecemos evidências de uma captação de células de câncer cervical derivada-apoptóticos por células mesenquimais humanas. Curiosamente, HeLa (HPV 18+) ou Ca Ski (HPV16 +) células, abrigando DNA do HPV de alto risco integrado, mas não C-33 células A (HPV-), foram capazes de transformar as células receptoras. fibroblastos humanos primários engolido os corpos apoptóticos eficaz no prazo de 30 minutos após a co-cultura. Este mecanismo é activa e envolve o citoesqueleto de actina.
In situ
hibridação de fibroblastos transformadas revelou a presença de DNA do HPV no núcleo de um subconjunto de células fagocitando. Estas células expressaram a /18 do gene E6 de HPV16, que contribui para a disrupção da via p53 /p21, e as células exibiram um fenótipo tumorigénico, incluindo um aumento da taxa de proliferação, o crescimento e poliploidia independência de ancoragem. Tal transferência horizontal dos oncogenes virais para as células que não possuem receptores para o HPV poderia facilitar a persistência do vírus, o principal factor de risco para o desenvolvimento de cancro cervical circundante. Este processo pode contribuir para a progressão da doença associada ao HPV
in vivo
Citation:. Gaiffe E, Prétet J-L, Launay S, Jacquin E, Saunier M, Hetzel G, et al. (2012) apoptose HPV Cancer positiva células exibem Transformar Propriedades. PLoS ONE 7 (5): e36766. doi: 10.1371 /journal.pone.0036766
editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 19 de julho de 2011; Aceito: 06 de abril de 2012; Publicado em: 04 de maio de 2012
Direitos de autor: © 2012 Gaiffe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Fellowships e obras foram apoiados por fundos públicos a partir da “Região de Franche-Comté”, “Institut National Cancer du” e “Ligue Contre Cancer le, Comité du Doubs.” os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
estudos epidemiológicos e experimentais têm destacado que de alto risco os papilomavírus humanos (HPV), especialmente de HPV 16 e 18, desempenham um papel importante na indução de carcinomas do colo do útero [1], [2]. Os aspectos mecanísticos da carcinogénese induzida por HPV são na maioria das vezes relacionado com eliminação do ORF de E2 como uma consequência da integração de DNA virai no genoma do hospedeiro [3]. Isto conduz a uma expressão desregulada de genes virais E6 e E7, que representam os principais genes transformantes. No coração desta transformação são a ligação de E6 para p53 e E6AP, o que favorece a degradação p53 [4] e a formação do complexo E7 com a proteína do retinoblastoma pRb [5], resultando na desregulamentação do controle do ciclo celular, reparo do DNA e apoptose .
Durante o desenvolvimento do tumor, uma grande porcentagem de células é perdido através de apoptose [6]. Tal morte celular é desencadeada por uma variedade de sinais extracelulares, incluindo a depleção de factor de crescimento /sobrevivência, hipoxia e uma perda de interacções célula-matriz, bem como sinais intracelulares, tais como danos no ADN [7]. Finalmente, as células apoptóticas são apuradas pela células fagocíticas especializadas que inativam e degradar os seus componentes celulares [8]. No entanto, as células apoptóticas também pode ser internalizada pelas células recipientes não-especializados. Assim, os fibroblastos são capazes de engolir neutrófilos apoptóticos [9], e corpos apoptóticos fígado células endoteliais pode ligar e fígado phagocytose [10]. Através deste processo de endocitose, as células apoptóticas podem actuar como um vector de ADN, e o ADN transferido horizontalmente podem conferir uma vantagem selectiva para a célula receptora.
Horizontal transferência de genes (HGT) tem sido bem documentada em procariotas e contribui para evolução, ecologia e resistência a antibióticos [revisto em [11], [12]]. Enquanto a transferência horizontal de informação genética entre dois eucariotas tem sido relatada em plantas [13], [14] e invertebrados [15], poucos estudos têm-se centrado na HGT entre as células de mamíferos. A troca de informação genética mediada por corpos apoptóticos foi demonstrado que ocorrem entre as células de cancro da próstata [16]. Os corpos apoptóticos de células linfóides transformadas portadoras de cópias integradas do vírus de Epstein-Barr também pode transferir sequências de ADN virais [17]. De modo semelhante, HIV-1 genes provirais são transferidos para as células sem receptores para a entrada viral [18]. ADN também foi relatado para ser transferido a partir de H-ras apoptóticas
V12- e células de c-myc-transfectados para p53 – /- de ratinho, fibroblastos embrionários que conduz à sua transformação [19]. Por outro lado, as células que expressam a p53 ou p21 fagocitando não são transformadas, sugerindo um mecanismo de protecção controlada pela via p53 [20]. Recentemente, J. Ehnfors
et ai.
Demonstraram que os fibroblastos e as células endoteliais são capazes de adquirir e replicando H-ras
V12 e o DNA de c-myc em células tumorais apoptóticas conter o vírus símio 40 T grande ( SV40LT) antigénio [21]. Estas observações comprovam que a eficiência de transformação está associada com a expressão de SV40LT inibir p53 [22]. Porque a maioria dos carcinomas cervicais expressar a oncoproteína viral E6, que promove a degradação da p53, como faz SV40LT, a hipótese de que a transferência horizontal de oncogenes de HPV poderia ser um mecanismo alternativo de carcinogênese.
Aqui, nós apresentamos provas de que células apoptóticas derivadas de células de cancro cervical derivado que albergam cópias integradas de HPV são capazes de transformar os fibroblastos primários humanos (HPF). Demonstramos ainda que as células de tumor receptor pode ser caracterizada por uma elevada taxa de proliferação e hyperploidy. Além disso, o material genético do vírus da inibição da via p53 /p21 é expresso nas células transformadas. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório da transformação de células primárias humanas através da captação de corpos apoptóticos de células de carcinoma cervical infectadas pelo HPV.
Resultados
células de carcinoma cervical apoptóticos são internalizados pela fibroblastos
A apoptose de células doadoras de carcinoma cervical foi induzida pela radiação UVB e exposição estaurosporina como descrito anteriormente [23], [24] e foi documentado por uma análise da exposição de fosfatidilserina (anexina V coloração), conteúdo de DNA ( coloração com iodeto de propídio) e fragmentação nuclear (coloração DAPI) (Métodos S1 e Figura S1A e S1B). O tratamento resultou na ausência de células vivas, capazes de proliferação nas suspensões de células apoptóticas (Métodos S1 e Figura S1C e SID). Estudos anteriores têm demonstrado que os corpos apoptóticos derivados de linfócitos EBV-carrying B pode transmitir ADN por transferência horizontal e que o DNA integrado com EBV podem ser, preferencialmente, transferido em comparação com o ADN celular [17]. Neste estudo, nós questionou se HPF poderia engolfar células em apoptose derivados das linhas de células de carcinoma cervical HeLa (HPV18), Ca esqui (HPV16) e C-33 A (HPV-), independentemente do status virológica.
a presença de células apoptóticas fluorescentes nas células receptoras foi confirmada por microscopia confocal. As células apoptóticas HeLa contendo ADN foram enredados no citoesqueleto de actina do HPF dentro de 48 h (Figura 1A). As células apoptóticas Ca Ski e C-33-A também foram tomados de forma eficiente pelo destinatário (figura 1B). A incubação do HPF sozinho ou com o sobrenadante de células apoptóticas não resultou em CFDA, SE (5- (e 6 -) – carboxyfluoresceine éster diacetato succinimidil) coloração, sugerindo uma ligação entre a fluorescência verde e a presença de células apoptóticas (figura 1B ). Ao rastrear os corantes fluorescentes em momentos iniciais (a partir de 1 h para 3 h), observou-se o recrutamento de actina quando as células em apoptose foram obrigados a HPF (figura 1CI, seta branca). A membrana de fibroblastos expandido em torno de ambos os lados da célula apoptótica através da polimerização de actina (figura 1Cii, setas brancas). F-actina, então, cercado as células em apoptose para formar um copo fagocíticas e fechados em um anel (figura 1Ciii). Estas observações microscópicas são indicativos de fagocitose, embora não se tenha caracterizado especificamente este mecanismo [25], [26]. Utilizar marcadores específicos de filamentos intermediários para cada tipo de células, confirmou-se que as células apoptóticas foram células epiteliais (citoqueratina positivo) que foram internalizados pelos fibroblastos (vimentina positiva) (figura 1D). Usando a abordagem quantitativa de citometria de fluxo, foram avaliados o percentual de HPF que engolfou as células de carcinoma apoptóticos manchadas. Independentemente do tipo de células apoptóticas utilizado, a eficiência de internalização foi semelhante (12,5% com HeLa apoptótica; 13% com apoptótica Ca Ski; 14,5% com apoptótica C-33 A) (Figura 1E). No entanto, notou-se que 12 a 15% dos fibroblastos foram capazes de tomar-se as células apoptóticas, enquanto o número de células apoptóticas semeadas era dez vezes maior do que a dos HPF. Isto sugere que os fibroblastos têm um potencial limitado para a eficiência e /ou a quantidade de internalização celular por apoptose. Quando as células receptoras foram co-incubadas com células apoptóticas a 4 ° C durante 48 h, a percentagem de internalização caiu significativamente a 2%, sugerindo que o processo de internalização segue uma via dependente de energia (figura S2). Estes resultados indicam que os fibroblastos primários humanos pode envolver células em apoptose, independentemente do seu estatuto virológico, através de fagocitose.
(A) Co-cultura de HPF e células HeLa apoptóticos. (B) HPF co-cultivados com células em apoptose Ca esqui (superior esquerdo), C-33 células A apoptóticos (canto superior direito), sozinho (canto inferior esquerdo) e o sobrenadante de células HeLa apoptóticos (canto inferior direito). (C) HPF foram cultivadas com células HeLa apoptóticos para diferentes períodos de tempo: 1 h (CI), 2 h (CII) e 3 h (CIII). As imagens mostram o recrutamento de actina e formação de expansão da membrana (setas). (D) HPF, células Ca esqui e HPF mais células Ca esqui ou HeLa apoptóticos foram coradas com anti-vimentina (TRITC) e anticorpos anti-citoqueratina (Cy2). Microscópio observações foram realizadas com um microscópio confocal (barra de escala: 1 uM). Todos os resultados são representativos de quatro experiências independentes. (E) HPF apoptótica foram incubadas com células HeLa, Ca Ski ou C-33 A células durante 48 h e a internalização celular por apoptose foi quantificada por citometria de fluxo.
células apoptóticas Apenas HPV positivos eficientemente transformar células receptoras
Ehnfors
et al.
demonstraram que o DNA de células em apoptose de fibrossarcoma de rato transfectadas com H-
ras
V12, c-
myc Comprar e SV40LT é transferido para e transforma fibroblastos primários [21]. Porque os oncogenes de HPV, como SV40LT, são capazes de eficientemente a transformação de células infectadas e bloquear a via da p53, entre outros efeitos, testámos se os fibroblastos em cultura com as células apoptóticas foram capazes de crescer com independência de ancoragem por medição da sua capacidade para formar colónias em um agar mole ensaio, como foi observado com o HeLa, Ca Ski e C-33 Um células cancerosas (Figura 2A, linha superior). Em contraste, os fibroblastos humanos primários não foram capazes de crescer sem uma matriz sólida (Figura 2A, linha superior). Embora os três tipos de corpos apoptóticos foram internalizados pelos fibroblastos, apenas as células que albergam o HPV apoptóticas (HeLa e Ca Ski células) transformado os HPF (Figura 2A, linha do meio). Os controlos com células apoptóticas não resultou na formação de colónias (Figura 2A, linha inferior). Estes resultados demonstram que a incubação de células em apoptose com DNA integrado-HPV efetivamente induzida crescimento independente de ancoragem de HPF, uma característica da transformação e um
in vitro
correlato de tumorigenicidade
in vivo
[27 ]. O status de transformação dos HPF foi ainda testada por ensaios de diluição limite-. De facto, em contraste com os fibroblastos primários, os fibroblastos transformados por HeLa apoptótica (FH) e Ca Ski células (FC) tinham a capacidade de formar colónias de camadas múltiplas quando foram cultivadas a uma densidade baixa (figura 2B). Nesta fase, o FH e FC começou a exibir um fenótipo transformado, com algumas das células aparecendo arredondada, ao contrário dos HPF de controlo, que apresentavam uma forma de fuso (Figura 2C). Além disso, os fibroblastos transformados consistia principalmente de pequenas células embaladas ou agregados tais como as células HeLa e Ca Ski, enquanto que os fibroblastos primários formado uma monocamada achatada
.
HPF (A) e HeLa, Ca Ski e C-33 A células cancerosas cervicais (linha superior); HPF após 48 h de exposição a células apoptóticas (apo HPF, apo HeLa, apo Ca Ski, apo C-33 A) (linha do meio) foram cultivadas em agar mole para 21 dias. As células apoptóticas por si só também foram cultivadas como controlo (linha de baixo). As fotografias foram tiradas com uma lente de ampliação de 20 ×. HPF (B e C), células HeLa, células Ca Ski e fibroblastos transformadas por HeLa apoptótica (FH) e células apoptóticas Ca Ski (FC) (após selecção em soft-agar), foram cultivadas em um limite de diluição durante 21 dias. (B) As colónias coradas com cristal roxo foram contados, ea eficiência de plaqueamento (PE, porcentagem de células capazes de formar colónias; SD, desvio padrão) foi calculado. (C) ampliações Colony foi fotografada com uma lente de ampliação de 40 ×.
Figura 3A mostra que os fibroblastos transformados, FC e FH, não são positivas para a coloração da citoqueratina, ao contrário das células epiteliais HeLa e Ca esqui, revogando a possibilidade de que as células transformadas são observadas células cancerosas sobrevivente raras e uma evolução clonal de células Ca esqui. Tal como ilustrado no painel superior esquerdo da figura 3B (marcador de D18S61, um exemplo de 20 marcadores de tipagem de ADN utilizado), fibroblastos transformados têm um padrão de ADN que é diferente das células tumor original. Outros resultados de experiências de tipagem de ADN mostrou que as células FC eram diferentes das células Ca Ski mas contêm alguns alelos de Ca Ski ADN (TP53 e marcadores D8S264), reflectindo a transferência de pequenos fragmentos de ADN. FC ADN também contém partes de cromossomas (marcadores D17S250), reflectindo a transferência de grandes fragmentos de ADN como descrito por Holmgren [17], [19]. Embora estes resultados demonstram o rearranjo cromossômico (perda e ganho de alelos) de células FC, não podemos excluir a possibilidade de contaminação cruzada, apesar de esta ser altamente improvável.
HPF (A), Ca Ski, HeLa, células FC e FH foram analisados por immunocytofluorescence para a expressão cytokeratine (barra de escala: 1 mm). (B) de ADN a partir de células de esqui e FC Ca foi amplificado por PCR fluorescente utilizando 20 microssatélites. Quatro amplificações microssatélites representativos são mostrados. Diferentes tipos de alelo são observados por meio de quatro marcadores:. D18S61 TP53, D8S264 e D17S250
Em seguida, determinou-se os efeitos da transformação HPF na taxa de proliferação utilizando uma curva de crescimento e os resultados do MTT ( 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazólio Bromid) ensaio de proliferação mostrado na Fig. 4A e 4B, respectivamente. O FH tinha um tempo médio de duplicação da população de 15 h, e o FC tinha um tempo médio de 16 horas, enquanto o tempo de duplicação foi HPF maior por um factor de 19 (298 h) (Figura 4A). A actividade mitocondrial medida pelo ensaio de proliferação MTT foi concordante com os resultados da curva de crescimento (Figura 4B). Estas modificações taxa de crescimento apoiar o potencial tumorigénico dos fibroblastos recém-transformadas. Portanto, testou-se se o aumento da taxa de crescimento e à transformação das células receptoras foram associados com modificações genéticas que conduzem a hyperploidy. Os ensaios de citometria mostrou que o teor de ADN aumentou com as passagens de fibroblastos transformadas (Figura 4C). Nas nossas experiências, uma HPF intensidade média de fluorescência (MFI) de 154 correspondeu a células diplóides (Figura 4D). O MFI aumentou para 205 e 250 depois de passagens das células SF 5 (P5) e 15 (P15), respectivamente. Observou-se resultados semelhantes para as células FC (219 em P5 e 264 em P15). A IMF nas passagens 15 de FH e FC representada hypertriploidy. Aneuploidia, como pode ser visto no nosso modelo, é frequentemente causada por um tipo particular de instabilidade genética e é uma das propriedades mais comuns de cancros [28].
(A e B) e HPF HPF transformadas HeLa por apoptótica (HF) ou células apoptóticas Ca Ski (FC) foram cultivadas para os comprimentos de tempo indicados. A proliferação das células foi monitorizada por dia por contagem do número total de células (A) e por ensaios de MTT (B). Os gráficos mostram a média (+/- DP) de três experiências independentes. (C) HPF, FH e FC em 5 passagens (P5) e 15 (P15) foram coradas (10
6 células), com solução de iodeto de propidio, e analisados por citometria de fluxo. (D) O MFI do pico G0 /G1 (média de três experimentos independentes +/- SD) exibe a ploidia de HPF, FH e FC em P5 e FH e FC em P15.
apoptose células cancerosas associadas ao HPV eficiente transferir oncogenes virais para fibroblastos
Uma vez que apenas as células doadoras HeLa e Ca esqui apoptóticos foram capazes de transformar os fibroblastos, a hipótese de que oncogenes de HPV poderia ser transferido para as células receptoras. A análise de microscopia confocal sugeriu que o material genético foi transferido das células apoptóticas para os núcleos de fibroblastos após 6 h de co-cultura (Figura 5A, setas brancas). A reorganização citoesqueleto de actina apareceu para entregar o celular por apoptose em direção ao núcleo de transferência de DNA, como visto com grande ampliação por sobreposição de luz transmitida com phalloidin ou coloração DAPI imagens. Na sequência destas observações, foi investigada a transferência de DNA do HPV em receptores de fibroblastos utilizando
in situ
hibridação (ISH) com uma sonda hibridizada especificamente para DNA do HPV de alto risco. células HeLa e Ca Ski foram utilizados como controlos positivos. Confirmando a nossa hipótese, os sinais de hibridização foram observados como pontos de cor púrpura nas células apoptóticas e dos núcleos dos fibroblastos transformados (FH e FC), enquanto nenhum sinal foi detectado na HPF (Figura 5B). Estes dados validam a hipótese de transferência horizontal dos oncogenes virais. Uma segunda abordagem consiste em amplificar o DNA de E6 de HPV 16 e 18, confirmou a presença do DNA viral nas fibroblastos transformadas (Figura 5C). Analisou-se ainda mais a expressão de E6 de HPV16 e HPV18 E6 por transcriptase reversa seguida de PCR em tempo real quantitativa. A Figura 6A ilustra que os transcritos E6 foram detectados nas células de FH e FC transformadas com níveis mais baixos do que no entanto nas células HeLa e CaSki parentais. Estes dados sugerem que a transferência de oncogenes virais é eficaz e funcional. Para examinar mais cuidadosamente o papel dos oncogenes E6 transferidos como inibidores da expressão de p53, que imunotransferidas para p53 e um dos seus objectivos, a p21. Por conseguinte, os p53 e p21 níveis dos HPF transformadas diminuiu substancialmente, semelhante ao decréscimo em células de cancro do doador (Figura 6B). No geral, estes resultados enfatizam um papel crítico de transferência de oncogene viral na transformação de células primárias, um processo que ultrapassa a via de p53.
(a) As imagens ilustram a transferência de DNA a partir das células apoptóticas para os receptores de fibroblastos (setas). observações microscópicas foram realizadas com um microscópio confocal (barra de escala: 1 uM). DNA HPV (B) de alto risco foi detectado por
in situ
hibridização in células parentais e apoptóticos HeLa e Ca esqui, FH e FC, mas não em HPF. As células foram contrastadas com eosina (barra de escala: 1 mm). (C) de agarose de electroforese em gel de albumina humana amplificado e E6 de HPV18 e HPV16 E6 ADN (MW: peso molecular). As imagens são representativos de três experiências independentes.
(A) E6 de HPV18 e HPV16 E6 quantificação de ARN a partir de HPF, células parentais e de fibroblastos transformadas por células HeLa ou células apoptóticas Ca Ski apoptóticos (chamado FH e FC respectivamente) foi realizada por PCR em tempo real quantitativa de transcrição reversa seguinte. Os gráficos representam a média de três experiências independentes (+/- SD). (B) Immunoblotting análises de expressão de p53 e p21 em linhas celulares de cancro, HPF e FH e FC fibroblastos transformados, utilizando anticorpos monoclonais de ratinho contra p53 e p21. Borrões também foram sondados com um anticorpo β-actina.
Discussão
Os resultados deste estudo fornecem evidência direta do potencial oncogénico de células apoptóticas positivas de HPV. A transferência de ADN virai derivado de células de cancro cervical de HPV-positiva através HGT promoveu o crescimento e transformação de HPF e pode representar um mecanismo alternativo para a transformação celular associado ao HPV. Bergsmedh
et al.
Anteriormente demonstrado horizontal transferência oncogene entre as células eucarióticas [19]. Em seu modelo, as células do doador foram fibroblastos de roedores primários modificados para superexpressão c-
myc Comprar e H-
ras
V12 e um gene de resistência à higromicina que permitiu uma seleção muito rigorosa de células receptoras transformadas após HGT.
Em nosso estudo, as taxas de internalização de células cancerosas apoptóticos foram semelhantes, independentemente do status HPV. No entanto, a descoberta de que as células cancerosas única HeLa e Ca Ski transportando naturalmente integrados oncogenes de HPV, mas não C-33 células A HPV-negativos são capazes de transformar fagocitando fibroblastos fornece suporte para a hipótese de que o DNA viral transferido por células em apoptose podem ser reutilizados e expressa por células receptoras.
O
in vitro
transformação célula receptora por DNA horizontalmente transferidos, facilitado pela fragmentação do DNA, mostrou ser dependente de p53 [29]. De fato, as células p53 ou p21 deficiente, mas não do tipo selvagem fibroblastos p53, tornou-se tumor-like após a sua captação de C-
myc
e H-
ras
oncogenes V12 , indicando que a via de sinalização Chk2 /p53 /p21 protege as células contra a propagação de ADN potencialmente prejudiciais [19], [20], [30]. Além disso, SV40LT, o que facilita a degradação de p53, pode superar esta vigilância genética ambos
in vitro
e
in vivo
[21]. Como SV40LT, as oncoproteínas E6 de HPV tipo 16 e 18 estão fisicamente associada com o tipo selvagem p53 e favorecer a sua degradação proteossomal [revisto em [31]]. Uma análise dos fibroblastos transformadas revelou que eles continham E6 de HPV16 ou DNA de HPV18 E6. Além disso, a ISH mostraram que o ADN de HPV a partir das células cancerosas apoptóticos foi transferida para os núcleos dos fibroblastos destinatário. Uma vez que o ADN foi transferido, a expressão dos genes E6 de HPV foi detectada ao nível do ARN até 15 semanas após o início das experiências de co-cultura. As células receptoras E6-expressam exibiram uma diminuição dos níveis de p53, bem como o seu alvo, o p21, o que pode explicar em parte a alterações no circuito de controlo de crescimento.
destina-se a confirmar por genotipagem que os fibroblastos transformados foram as únicas e foram derivados a partir de fibroblastos primários e linhas celulares de cancro parentais. Ao estudar várias microssatélites, descobrimos que eles realmente abrigava alguns alelos idênticos aos identificados em células cancerosas cervicais apoptóticos. No entanto, devido à perda de fibroblastos primários à senescência, não fomos capazes de confirmar que foram derivadas a partir de fibroblastos primários. Portanto, não podemos excluir completamente a possibilidade de contaminação cruzada com uma linha celular não relacionados, mesmo que essa possibilidade parece improvável. No entanto, os fibroblastos viralmente modificadas que foram capazes de formar colônias demonstrou características morfológicas peculiares, uma elevada taxa de proliferação e aneuploidia. A transição a partir de diploidia a aneuploidia, uma característica observada em praticamente todos os tipos de cancro [28], foi observado nas lesões associadas ao HPV de alto risco precoces do colo do útero [32] e foi atribuído ao efeito sinérgico de E6 e E7 oncoproteínas [ ,,,0],revisto em [31]]. No entanto, as células HPV imortalizado de alto risco são não-tumorigénico, ea ativação de oncogenes celulares c-
myc
, H-
ras Comprar e c-
fos
é necessário para superar completamente a função anti-oncogênico de p53 e resultar no desenvolvimento do cancro do colo do útero [33], [34], [35]. Um estudo mais aprofundado da expressão destes oncogenes celulares activados, eventualmente, vai ajudar a compreender o mecanismo de transformação de fibroblastos. No entanto, a transmissão do oncogene de HPV pode ter um papel mais importante do que considerado, uma vez que a expressão de E6 de HPV16 em 33 oncogene C-células A HPV negativas confere um fenótipo agressivo como demonstrado pela resistência de radiação nos tumores transplantados [36].
escape from mecanismos de vigilância do sistema imunológico pode representar o principal fator de risco para a persistência do DNA do HPV e progressão da lesão, ao passo que a transferência viral a partir de corpos apoptóticos de células sem os receptores para o HPV
in vivo circundante
poderia facilitar a persistência de HPV em o colo do útero. Além disso, essa transferência pode explicar a disseminação do HPV de células mesenquimais, como observado por ISH em carcinomas cervicais [37], [38], e a possibilidade de um reservatório do estroma para o HPV. Além disso, em tumores sólidos humanos, um subconjunto de células cancerosas, chamadas de células-tronco do câncer, que são provavelmente iniciadas como resultado de HGT causar cancros muito agressivos com uma alta propensão para a disseminação metastática [39]. Isso pode explicar a associação positiva entre a taxa de apoptose intratumoral e vários parâmetros de tumor cervical, tais como tamanho do tumor, grau de lesão, fenótipo metastático e sobrevida do paciente [7], [40], [41], [42].
Além disso, o aumento da prevalência de células apoptóticas após a terapia de quimioterapia e /ou radiação pode ser em parte responsável pela recorrência de lesões HPV induzindo a transformação de novas células no mesmo ou em diferentes localizações anatómicas meses ou anos após a remissão [43 ], [44]. As investigações sobre esta possibilidade está garantido, além de esforços para encontrar novas estratégias terapêuticas dirigidas oncogenes E6 /E7 de limitar a sua transferência horizontal e controlar o desenvolvimento do tumor.
Materiais e Métodos
cultura de células e indução de apoptose
HPF foram isolados a partir de pele humana de adultos após abdominoplastia como descrito anteriormente [45] e foram cultivadas em DMEM completo (Lonza) contendo 10% de FBS (Lonza), penicilina /estreptomicina e L-glutamina. HPF extraídos de resíduos cirúrgicos não estão sujeitos a validação de uma comissão de ética e consentimento do paciente de acordo com a L.1245-2 lei do “Code de la santé publique” aplicada na França. Além disso, o laboratório de engenharia de pele do departamento de dermatologia do Prof. Philippe Humbert, proporcionando fibroblastos humanos, tem documentos manuscritos afirmando não oposição do paciente para o uso de seus resíduos cirúrgicos para a investigação médica, de acordo com o L.1211-2 lei. linhas celulares de carcinoma cervical humano (ATCC), HeLa (HPV 18, p53 de tipo selvagem) e C-33-A (HPV negativo, p53 mutado) foram cultivadas em EMEM completo (Lonza), e Ca Ski células (HPV16, p53 de tipo selvagem ) foram cultivadas em meio RPMI completo (Lonza). Eles foram monitorados mensalmente e verificou-se estar livre de micoplasmas. Doze horas antes da indução da apoptose, as células de carcinoma foram semeadas a 2 x 10
4 células /cm
2. Eles foram, em seguida, tratou-se com 20 mJ cm
irradiação /2 UVB seguido por 300 nM de estaurosporina (STS) (Sigma Aldrich) durante 48 h. As células apoptóticas foram colhidas após centrifugação do sobrenadante a 300 g durante 10 min. A detecção de apoptose foi realizada como descrito na informação suplementar (Métodos S1). As células apoptóticas foram incubadas com HPF numa proporção de 10:01. Esta proporção foi escolhida porque uma proporção mais elevada provoca a morte de fibroblastos e uma proporção mais baixa diminui a taxa de internalização.
análise internalização celular apoptótica
As células apoptóticas foram coradas com 1 ug /ml de CFDA, SE (Invitrogen Ltd) diluído em DMEM com 2% de FBS durante 13 min a 37 ° C. Após lavagem, foram incubadas durante 48 h com células receptoras. Para a análise de citometria, os fibroblastos incubados com as células apoptóticas foram colhidas por tripsinização e analisadas utilizando uma célula de laboratório Quanta ™ SC citómetro de fluxo (Beckman Coulter). As células apoptóticas foram marcadas com CFDA, SE e HPF foram distinguidas das células apoptóticas pelo seu diâmetro, tal como avaliado por citometria de fluxo. Eventos com diâmetros pequenos ( 13 mm) e positivo para CFDA SE, foram consideradas células apoptóticas ;, eventos com grandes diâmetros ( 13 mm) e negativo para CFDA, SE, estavam HPF e eventos com grandes diâmetros e positivas para CFDA, sE, foram HPF com células apoptóticas tragadas.
para a microscopia confocal, fibroblastos crescidos sobre coverslides foram fixadas com 3,7% de paraformaldeído durante 20 min a 4 ° C e permeabilizadas com 0,1% de Triton X100 durante 10 min a sala temperatura (TA). As células foram coradas utilizando TRITC (tetrametilrodamina-isotiocianato) -conjugated faloidina (Sigma Aldrich) durante 30 min a 4 ° C e com 300 nM de 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole, dicloridrato (DAPI; Invitrogen) durante 5 min a RT. A imagem 3D (z projeção) foi reconstituído a partir de 32 fatias horizontais 2D obtidos por microscopia confocal. Outro conjunto de células foi incubado com dois anticorpos primários: um anticorpo citoqueratina anti-humano monoclonal de ratinho (clone AE1 /AE3, DakoCytomation) utilizado em 1:50 e um anticorpo anti-vimentina monoclonal humano de coelho (clone SP20; GeneTex) usado em 1 :100 diluição. Correspondentes anticorpos secundários (Jackson ImmunoResearch) acoplados a cianina (CY 2 ™ 2-AffiniPure conjugado de cabra anti-rato IgG) ou rodamina (rodamina (TRITC) -conjugated AffiniPure burro anti-IgG de coelho) foram usadas na diluição 1:50. Os coverslides foram finalmente analisada utilizando um Olympus FluoView 1000 microscópio de fluorescência (Olympus).
ensaio de formação de colónias, crescimento das células e análise aneuploidia
Os ensaios de agar mole foram realizados em placas de 24 poços na meias meios -sólido (DMEM, 10% FBS, 0,35% de agar; Invitrogen) com 8 × 10
3 e 3 x 10
5 células /ml em uma camada de base meios (RPMI, 10% de FBS, 0,5% de agar ). As células foram cultivadas durante 21 dias, e as colónias foram observadas utilizando um microscópio invertido Axiovert 25 (Zeiss) [27]. As colónias foram então colhidas por raspagem da superfície do ágar mole e duas linhas de células de fibroblastos transformadas por HeLa apoptótica (FH) e Ca Ski (FC) foram derivadas de células e utilizadas para outras experiências.
fibroblasto primário transformação foi também testado por culturas de diluição limite, em placas de 6 poços a 5 x 10
2 células /poço, durante 21 dias. As colónias foram então coradas usando uma solução de cristal violeta (0,1% de cristal violeta (w /v), etanol a 5%) e fotografada com uma câmara 4500 Nikon Coolpix digitais (Nikon) [46].
A proliferação de as células transformadas foi monitorizada por contagem do número total de células em cada poço individual por dia durante 10 dias com um laboratório celular Quanta ™ SC citómetro de fluxo. A proliferação foi também monitorizada utilizando o teste MTT com o Kit de Proliferação Celular I (MTT) (Roche) durante 5 dias consecutivos.