Abstract

A transcrição reversa – quantitativa Reação em Cadeia da Polimerase (RT-qPCR) é uma técnica padrão na maioria dos laboratórios. A seleção de genes de referência é essencial para a normalização de dados ea seleção de genes de referência adequados permanece crítica. Nosso objetivo foi 1) uma revisão da literatura desde a implementação das orientações MIQE, a fim de identificar o grau de aceitação; 2) comparar vários algoritmos em sua estabilidade expressão; 3) identificar um conjunto de genes de referência adequados e mais confiáveis ​​para uma variedade de linhas celulares de cancro humano. Uma revisão de banco de dados PubMed foi realizada e foram selecionadas publicações desde 2009. Doze putativos genes de referência foram perfilado em linhas normais e de células de cancro diferentes (n = 25), utilizando 2-passo de RT-qPCR. genes de referência investigados foram classificados de acordo com a sua estabilidade expressão por cinco algoritmos (geNorm, Normfinder, BestKeeper, ΔCt comparativa e RefFinder). Nossa análise revelou 37 publicações, com dois terços amostras de pacientes e um linhas celulares terceiros. eficiência qPCR foi determinado em 68,4% de todas as publicações, mas apenas 28,9% de todos os estudos fornecida quantidade de ARN /ADNc e curvas padrão. GeNorm e Normfinder algoritmos foram usadas em 60,5% em combinação. Em nossa seleção de linhagens de células de câncer de 25, foram identificados

HSPCB

,

RRN18S

, e

RPS13

como os genes de referência, expressa mais estáveis. No subgrupo de linhas celulares de cancro do ovário, os genes de referência foram

PPIA

,

RPS13

e

SdhA

, demonstrando claramente a necessidade para selecionar genes, dependendo do foco da pesquisa. Além disso, um grupo de pelo menos três genes de referência adequados precisa ser previamente estabelecidos para os experimentos, de acordo com as orientações. Para o estabelecimento de um conjunto de genes de referência para a normalização gene recomendamos o uso de idealmente três genes de referência selecionados por pelo menos três algoritmos de estabilidade. O infeliz falta de conformidade com as diretrizes MIQE reflete que estes precisam ser ainda estabelecido na comunidade de pesquisa

Citation:. Jacob F, Guertler R, Naim S, Nixdorf S, Fedier A, Hacker NF, et al . (2013) cuidadosa seleção de genes de referência é necessária para a execução de confiança de RT-qPCR em Normal Humana e linhas celulares de cancro. PLoS ONE 8 (3): e59180. doi: 10.1371 /journal.pone.0059180

editor: Sui Huang, Instituto de Biologia de Sistemas, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de novembro de 2012; Aceito: 12 de fevereiro de 2013; Publicação: 15 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jacob et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Fundação Nacional da Suíça (PBZHP3-133289 e -138.752 para FJ; 320.030-120.543 para VHS.); Instituto do Câncer de Nova Gales do Sul (09 /CRF /2-02 para VHS); Royal Australian e Nova Zelândia College de Obstetras e Ginecologistas (para VHS); William Maxwell Trust (para VHS) e do Hospital Real para mulheres da fundação (de VHS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

transcrição reversa (RT) – quantitativa de Reacção em Cadeia da polimerase (qPCR) tornou-se uma técnica versátil para examinar as alterações de um ou mais genes de interesse em vários estados patológicos de expressão. Devido à sua especificidade, sensibilidade, simplicidade, custos e de alto rendimento, RT-qPCR oferece uma ampla variedade de vantagens sobre os métodos convencionais, tais como a transferência de Northern e PCR semi-quantitativo. Por isso, tornou-se o instrumento mais emergente para a quantificação absoluta e relativa dos níveis de transcrição de ARNm [1]. RT-qPCR é um ensaio robusto que recorre à análise química e dados bem estabelecida e é, portanto, superior a técnicas tais como a sequenciação Southern blotting de ADN ou [2]. Apesar de sua ampla aceitação, há inconsistências na utilização do total de métodos de extração de RNA, a quantidade de ARN por reacção [3], as avaliações de integridade de RNA [4], qPCR misturas mestras e nos diversos fabricantes dos kits de transcrição reversa. Além disso, a utilização de diferentes métodos de detecção, tais como qPCR dye- ou sistemas à base de sondas alarga o espectro de aplicações potenciais. A fim de superar as dificuldades potenciais e chegar a um consenso no desempenho e análise de experimentos quantitativos de PCR, o MIQE (Informações mínima para Publicação de experiências quantitativas Real-Time PCR) orientações entraram em vigor em 2009, melhorando o design experimental [5]. Além disso, a aplicação destas orientações vão entregar melhores resultados e reprodutíveis, informando parâmetros como a integridade do RNA, o volume de reação, concentração de cDNA /RNA, ou curvas de calibração [6].

Alvo normalização gene geralmente é feito usando genes de referência para compensar intra e inter-cinética RT-qPCR [7]. Várias abordagens matemáticas foram publicados que proporcionam genes de referência adequadas com o menor variação e com alta estabilidade através das amostras biológicas. Os quatro abordagens mais frequentemente utilizados são: (1) o algoritmo NormFinder [8] que é um modelo estatístico que estima a variação global da expressão do gene para cada gene candidato de referência e fornece um valor de estabilidade. Este valor está relacionado com o erro sistemático de cada gene candidato. (2) GeNorm [9] calcula uma medida da estabilidade do gene para cada gene candidato. O gene de referência com o menor estabilidade (H) é removido a partir de uma análise mais aprofundada, e M valores calculados são repetidamente até que o gene de referência é mais estável à esquerda. (3) BestKeeper, a Microsoft

® ferramenta baseada em Excel, utiliza correlações de pares [10]; e (4) o delta comparativo Ct (com base nas regras de nomenclatura e MIQE: o ciclo de quantificação (CQ) é preferido para o ciclo limiar (Ct), tanto a descrição do ciclo fraccionai de PCR utilizado para quantificação) método classifica a estabilidade de genes candidatos de acordo com a repetibilidade de diferenças de expressão de genes [11]. Nenhum dos algoritmos introduzidas parece ser o ideal e o pesquisador sempre tem que escolher qual o gene de referência para usar e como identificar. Isto também pode afectar a interpretação dos resultados de RT-qPCR.

putativos genes de referência Numerosos têm sido relatados para uma ampla variedade de tecidos humanos, para linhas de células humanas, e para culturas de células em diferentes condições experimentais, tais como tratamentos de droga ou fatores ambientais. No entanto, nenhum gene de referência adequados para a análise de linhagens celulares de cancro humano, originado a partir de cancros ginecológicos e cancros do cólon foram ainda descritos.

O objectivo primário deste estudo foi identificar os genes de referência mais estáveis ​​adequados para o estudo de linhas celulares de cancro e normais de origem do ovário ou do cólon de perfil de um conjunto de genes de referência 12 putativos e para o primeiro tempo aplicando cinco algoritmos de estabilidade para estimar a influência da análise dos dados bioinformatical. Também estávamos interessados ​​para ver como diferentes fabricantes de kits de transcriptase reversa influenciar a variação da expressão do gene de referência. Além disso, uma revisão da literatura atual foi realizada a fim de avaliar a conformidade com as diretrizes MIQE no desempenho de RT-qPCR relatados desde a sua introdução.

Materiais e Métodos

Revisão da Literatura

a PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) avaliação do banco de dados sobre a utilização de genes de referência putativos na RT-qPCR foi realizada. Publicações disponíveis entre janeiro de 2009 e abril de 2012, foram considerados e identificados usando as palavras-chave: “genes de referência” ou “genes housekeeping” e “RT-qPCR ‘OU’ PCR quantitativo». listas de referências de publicações selecionadas também foram considerados para inclusão de artigos potencialmente relevantes. Publicações não está escrito em Inglês e os que relataram RT-qPCR executada em menos de cinco genes de referência foram excluídos. Somente publicações com amostras humanas foram incluídos. Publicações foram avaliadas de acordo com o ano de publicação, o tipo ea quantidade de amostras, o número de genes de referência, os métodos usados ​​para determinar a integridade do RNA, a quantidade de RNA total inicialmente utilizado para RT e /ou qPCR, o número de repetições em qPCR, os detalhes sobre diluições em série para a curva de calibração e eficiência, a química qPCR utilizada (SYBRgreen ou TaqMan) e as abordagens matemáticas (algoritmos computacionais) para medição gene de referência estabilidade expressão.

Cultura de células

neste estudo foram utilizadas 2 linhas normais e 23 celulares de cancro de várias origens. As linhas de células foram derivadas de ATCC (www.atcc.org) ou foram um presente do Instituto Garvan de Pesquisa Médica, Sydney, Austrália. consentimento informado por escrito ética foi concedida (HREC 08/09/17 /3,02, para VHS.). Uma lista detalhada das linhas de células e as condições de cultura são dados como dados adicionais (Tabela S1). Todas as culturas de células foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2. Culturas estavam livres de micoplasma, como determinado por PCR qualitativo, utilizando VenorGeM

® Mycoplasma Detection Kit (Biocene Pty Ltd, Rozelle, Austrália).

Extração de RNA e Integridade

Para examinar a expressão dos 12 genes putativos de referência em cada uma destas linhas celulares, 1 × 10

5 células foram cultivadas em placas de 6 poços (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) até uma confluência de 70-90%. As células foram então lavadas duas vezes com solução salina estéril e o ARN total foi extraído utilizando o estojo NucleoSpin RNAII (MACHEREY Nagel, Scientifix Pty Ltd., Clayton, Austrália). Para este células foram lisadas por adição de tampão de lise directamente para as células. extração de RNA, incluindo o tratamento de DNase foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN foi eluído em 60 ul de ARNase concentração de água e ARN livre medido usando espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca). A integridade das amostras de ARN foi confirmada por electroforese em gel de agarose num gel de agarose 1,0% contendo GelRed ™ (Biotium, Inc., Hayward, CA, EUA). As amostras de RNA sem indicação de degradação foram ainda avaliadas em um chip RNA 6000 Nano usando o Agilent 2100 Bioanalyzer eletroforese (O Centro Ramaciotti para Gene Análise Funcional da Universidade de New South Wales, Sydney, NSW, Austrália).

reversa a transcrição de ARNm

RTase, baseado no MMLV ARN total (1 ug) foi sujeitos a transcrição reversa usando a iScript transcrição reversa Supermix para RT-qPCR (# 170-8840, ARNaseH

+, Bio-Rad Laboratories (Pacífico) Pty Ltd, Gladesville, Austrália) num volume total de 20 uL, de acordo com as instruções do fabricante. A Supermix continha tanto oligo dT e iniciadores aleatórios para obter um número máximo de transcritos de cDNA. A mistura de reacção foi incubada a 25 ° C durante 5 min para o escorvamento, em seguida, a 42 ° C durante 30 min para a transcrição reversa, e finalmente a 85 ° C durante 5 min para inactivação da transcriptase reversa. O DNA complementar (cDNA) foi armazenado a -20 ° C até à sua utilização.

Além BioRad, foram incluídos dois outros fabricantes (Takara e Bioline) para investigar sua influência sobre o desempenho da transcrição reversa. Nós transcrição reversa de ARN total (1 mg) por seis transcrições reversas (Takara e Bioline) da seguinte forma: A mistura de reação foi preparado usando BluePrint ™ 1

st kit de síntese de cDNA fio (# 6115A, baseado em MMLV RTase, RNaseH

+, Takara Bio Inc., Scientifix Pty Ltd., Clayton, Austrália) num volume total de 20 ul contendo 6 meros aleatórios, oligo dT, ou ambos, em igual molaridade. Um volume final de 10 ul contendo iniciador, uma mistura de dNTP e o ARN total foi incubada a 65 ° C durante 5 min e imediatamente arrefecidos para baixo. Em seguida, 5 × BluePrint

TM 1

tampão vertente st, inibidor da RNase recombinante e modelo

TM RTase foi adicionado a um volume final de 20 ul. transcrição reversa final foi incubada a 30 ° C durante 10 min, depois a 42 ° C durante 60 minutos, seguido de inactivação a 95 ° C durante 5 min. A transcrição reversa utilizando o estojo de síntese de ADNc Tetro de Bioline (# BIO-65042, baseado no MMLV RTase, ARNaseH

+, Bioline (Aust) Pty Ltd, Alexandria, Austrália) foi realizada como se segue: um volume final de 10 ul contendo iniciador ( aleatórios 6 meros ou oligo dT ou ambos em igual molaridade), uma mistura de dNTP e de RNA foi incubado a 70 ° C durante 5 min, seguido pela adição de 5 × tampão de RT e Ribosafe inibidor de RNase até 20 mL. mistura de reacção final foi incubada a 45 ° C durante 30 min e terminadas a 85 ° C durante 5 min.

Polimerase Chain Reaction quantitativa (qPCR)

quantitativa por PCR foi realizada em 12 genes de referência putativos . As suas características incluindo nome, número de acesso, localização cromossoma, comprimento do produto, e o respectivo para a frente e reverso iniciadores encontram-se resumidos na Tabela 1. Os genes de referência e sequências iniciadoras (adquirido a partir de Sigma-Aldrich Pty. Ltd, Castle Hill, Austrália) foram seleccionados baseado em bases de dados anteriores e em publicações relatam perfis estáveis ​​de expressão do gene [8], [9], [12] – [15]. As sequências dos iniciadores também foram cruzados utilizando ferramenta baseada na Web

in silico

PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) no navegador do genoma humano na Universidade da Califórnia [16] contra e genes alvos genómicos.

a expressão dos genes mais estáveis ​​foi determinado em linhas celulares humanas de epitélio normal da superfície do ovário (n = 2) e de origem cancerosa, incluindo do ovário (n = 9 ), cólon (n = 9), mama (n = 1), do colo do útero (n = 1), cancro do útero (n = 1), e leucemia (n = 2).

qPCR foi realizado na Stratagene Mx3005

® (Ciências integradas Pty. Ltd, Chatswood, Austrália) em placas de microtítulo de 96 poços (Bio-Rad Laboratories (Pacífico) Pty Ltd, Gladesville, Austrália). condições óptimas de reacção foram obtidos com 1 × SsoFast ™ EvaGreen

® Supermix com baixa ROX como o corante de referência (Bio-Rad Laboratories (Pacífico) Pty Ltd, Gladesville, Austrália), 400 nM iniciador com sentido específico, 400 nM antisense específico primer, RNase água /livre de DNase-, e molde de ADNc (previamente isolados e sujeitos a transcrição reversa de ARN de 1 ng /poço) até um volume final de 10 ul. As amplificações foram realizadas começando com uma enzima de activação de 30 segundos a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 5 seg, e, em seguida, de hibridação /extensão a 60 ° C durante 30 seg. No final de cada executar uma análise de curva de fusão foi realizada 65-95 ° C. Todas as amostras e os controlos negativos foram amplificados em triplicado, e o valor médio obtido foi então usado para posterior análise. Ciclo de quantificação (CQ) valores de 35 foram excluídos outros cálculos matemáticos. Uma “amostra sem modelo” (ARN de transcrição inversa sem transcriptase reversa) e uma amostra sem ARN ou ADNc eram os controlos negativos.

eficiência da PCR (E)

A comparabilidade foi assegurada por meio da investigação da eficiência de qPCR em todos os genes de referência sobre um extracto de ARN linha celular seleccionada aleatoriamente. Para comparar os níveis de RNA transcrito para os 12 genes de referência putativos, os valores do QC foram gerados diretamente a um limite específico. O Cq é definido como o número de ciclos necessário para o sinal de fluorescência para atingir um limiar de detecção específica e é, por conseguinte, inversamente correlacionada com a quantidade de entrada de ARN total [17]. Para comparar diferentes corridas qPCR realizados em dias diferentes, pratos e corridas foram ajustadas para o limiar da Cq 0.1. ADNc transcrito de forma inversa foi diluído a partir de 100 ng a 1 ug de ARN de entrada antes de RT em diluições de 10 vezes para cada gene de referência em triplicado. sinais de fluorescência obtida para a concentração de ARN definida foram representados graficamente e de regressão linear foi realizada para identificar a melhor relação linear que representa a curva padrão. A inclinação da equação linear foi aplicada para calcular a eficiência de acordo com a equação E = (10

[- 1 /inclinação] -1). × 100

Análise de Dados

Raw dados, incluindo as curvas de fusão e de amplificação obtidos por MxPro- Mx3000P v4.10 (Ciências integradas Pty. Ltd, Chatswood, Austrália) foram extraídos para Microsoft

® arquivos do Excel (.xls), salvos como Microsoft

® arquivos de editor (.txt), e depois carregado para a análise de novos dados para o open source de programação estatística linguagem R (https://CRAN.R-project.org/, versão 2.13.2). Para mais modelagem e análise de dados RT-qPCR, foi utilizado R pacote “qPCR” (https://cran.r-project.org/web/packages/qpcR/index.html). A correlação de Pearson (r) foi calculado para determinar a associação entre algoritmos aplicados.

Para comparar diferentes algoritmos para a seleção dos genes de referência mais estáveis, aplicamos RefFinder (https://www.leonxie.com/referencegene.php), uma ferramenta abrangente baseado na web. Ele utiliza o geNorm actualmente disponíveis algoritmos [9], Normfinder [8], BestKeeper [10] e métodos ΔCt comparativos [11], e atribui um peso adequado para um gene individual e calcula a média geométrica para ordenação global de todos os genes de referência.

resultados

o cumprimento das orientações MIQE para o Estabelecimento de genes de referência

Desde a sua introdução em 2009 [5], a comunidade científica está aceitando continuamente as diretrizes MIQE para publicações e consideração de manuscritos científicos usando RT-qPCR. Para estudar a aceitação de MIQE em mais detalhes, foi realizada uma revisão da literatura sobre publicações propondo um conjunto de genes de referência putativos (n≥5) em amostras humanas para RT-qPCR. Foram identificadas 37 publicações a partir de janeiro de 2009 a abril de 2012, cujo número aumentou continuamente a cada ano (Figura 1A). A maioria destes estudos investigaram amostras de pacientes (63,2%), seguido por linhas celulares primárias e imortais (31,6%). Uma parte menor (5,3%) examinaram as amostras de tecidos e linhas de células em conjunto. integridade do RNA foi na maioria dos casos (68,4%) investigados com dois métodos independentes, tais como espectrofotometria (90,9%) e número integridade RIN (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EUA). A quantidade de ARN total para a transcrição reversa ou para as reacções de ADNc qPCR foi relatada em 78,9% de todas as publicações. SYBR

® Green (57,9%), um corante de ligação dsDNA fluorescente, foi mais frequentemente utilizados do que TaqMan (26,3%), uma sonda específica do destino marcado por fluorescência. A eficiência qPCR para todos os genes de referência investigados foi fornecida em 68,4% de todas as publicações, mas apenas 28,9% forneceu detalhes, tais como a quantidade de cDNA e a gama de diluição de curvas padrão. Finalmente, foram investigadas qual dos algoritmos conhecidos (geNorm, Normfinder, BestKeeper, ΔCt comparativo) foram aplicados para identificar os genes de referência mais expressos de forma estável. GeNorm e Normfinder algoritmos juntos foram utilizados na maioria dos estudos, seguido por geNorm sozinho e geNorm, Normfinder, e BestKeeper juntos (Figura 1B). Considerando que apenas publicações realizando RT-qPCR para a identificação de genes de referência expressos de forma estável foram incluídos, estes dados demonstram que a informação essencial, tal como a integridade de ARN, a quantidade de ARN total na reacção, a eficiência qPCR, e a quantidade de ADNc está ausente em uma fracção substancial de estas publicações.

(A). gráfico de linha de todas as publicações (n = 37) que investigam os genes de referência mais expressos de forma estável. (B) Percentagem de algoritmos usados ​​para identificar genes de referência fiáveis ​​entre todas as publicações.

Qualidade e Integridade de amostras de RNA

O RNA total extraído de nosso conjunto de linhas celulares foi avaliada pela qualidade e integridade. Uma lista detalhada das linhas de células e respectiva informação sobre o montante RNA, qualidade e integridade (razões compreendidas 260/230 nm e 260/280 nm, número de integridade do RNA RIN, e 28 Relação S /18 s) são apresentados como dados suplementares ( tabela S2). Descobrimos que os rácios de absorvância, em média (média ± desvio padrão) ao longo de todas as linhas de células de 25, foram 1,97 ± 0,23 (260/230 nm) e 2,11 ± 0,04 (260/280 nm). Descobrimos ainda que o NIR variaram de 8,4-10, indicando uma qualidade de ARN total suficiente. O algoritmo RIN atribui uma pontuação RIN número de 1 a 10, onde um valor de 10 representa RNA completamente intacto e um valor de um representa RNA degradado. Além disso, a qualidade do ARN total também foi confirmada pela razão de 28 s /18 s RNA ribossomal, que variou 1,7-2,7.

A eventual presença de contaminação de ADN (Figura S1) em cada experiência foi qPCR investigada por parcelas de amplificação, curvas de fusão, e electroforese em gel de agarose a 1%. As reacções de controlo negativo da transcrição reversa confirmou a ausência de ADN contaminante. No entanto, houve amplificações da PCR nos controles negativos da

PPIA

,

GUSB

,

RPII e

TBP

em uma ou duas repetições, com valores Cq 35. Estes valores foram substancialmente mais elevados do que aqueles das amostras contendo uma cadeia molde de ADNc de 1 ng, indicando uma amplificação negligenciável de ADN contaminante. Sem amplificações por PCR em controlos negativos foram detectadas para os outros genes de referência. Estes resultados indicam que nossas amostras de RNA total foram de qualidade suficiente e em grande parte livre de contaminação de DNA.

Eficiência qPCR, intra e inter-ensaio Variabilidade

A eficiência RT-qPCR de cada conjunto de primers foi determinado por diluições seriais de molde de ADNc da linha celular de epitélio de superfície do ovário humano HOSE17-1 (Tabela 2). Utilizou-se ARN a partir de uma linha celular seleccionada aleatoriamente em vez de plasmídeos porque ARN podem causar variação não negligenciável potencial na transcrição reversa [18], [19]. Com base nos valores médios obtidos Cq para todas as diluições em série de diluições de um logarítmica de ADNc, uma curva padrão foi gerado. Os inclinação, intersecção, qPCR eficiência de amplificação e coeficientes de correlação (R ​​

2) de cada par de primers foram calculados a partir da curva padrão (Figura S2). A gama de diluição inicial de 100 ng a 1 pg de RNA de entrada antes de RT foi adaptado devido à amplicons não detectáveis ​​na faixa inferior ou saturação de reações de qPCR pelos valores de cDNA mais elevadas, tanto a eficiência influenciando no

RRN18S

,

RPII e

B4GALT6

(Tabela 2).

GUSB

mostrou uma gama de diluições linear óptima de 10 pg a 10 ng. eficiência da PCR de genes de referência estudados variou de 87,1% a 106,6%, inclinação de -3,680 a -3,157, interceptar 11,10-27,30 e R

2 0,994-0,999.

Para garantir uma nível de transcrito de ARN estável, a influência da variabilidade da técnica, a variação intra e inter-ensaio foram investigados utilizando o seleccionado aleatoriamente

HSPCB

em ARN a partir de células SKOV3. variação inter-ensaio foi determinada efectuando RT-qPCR com amostras idênticas de cinco dias diferentes, revelando um coeficiente de variação (CV) de 1,74%. A variação intra-ensaio foi inferior a 0,3% CV utilizando uma quantidade de 0,5 ng e 2,0%, utilizando 5 pg de ARN. Estes dados indicam que a variabilidade técnica está em uma faixa aceitável e, portanto, é considerado como insignificante.

Utilização do Apropriada Setup transcriptase reversa

Para estudar se a origem (fabricante) de a transcriptase reversa influencia a qualidade da reação, quatro genes de referência (

SdhA

,

HSPCB

,

GUSB

e

TBP

) foram selecionados aleatoriamente e qPCR foi realizada após a transcrição reversa. Para definir o desempenho global de todos os quatro genes de referência seleccionados, variações foram calculados para a Cq e os valores de CV (n = 7). A variação para Cq variou de um mínimo de 1,14 (

TBP

) para um máximo de 2,83 (

GUSB

) (Figura 2A). A variação intra-ensaio dentro de triplicados foi maior em

SdhA

(CV = 2,51%) e menor em

GUSB

(CV = 0,04%) (Figura 2B). Estes dados indicam que a origem da transcriptase reversa e configurações diferentes de iniciadores tem apenas uma influência marginal no desempenho destes quatro genes de referência.

(A) Aleatório 6 mer foram usadas em 2 e 5, no iniciador oligo dT 3 e 6, e os dois juntos em 1, 4 e 7 (abcissa); Cq em ordenadas apresentam diferenças entre as condições de transcriptase reversa testados. (B) O coeficiente de variação (CV). fornecedores RT indicados por algarismos romanos: I) BioRad, II) Takara e III) Bioline. X-eixo com diferentes primers RT: oligo dT (oligo), aleatório 6 mers (aleatórios), e ambos (ambos)

Expression Estabilidade de genes candidatos referência em linhas de células humanas

a fim de identificar os genes de referência mais estável ao longo das linhas de células normais e cancerosas testadas, as estabilidades dos genes de referência de expressão foram examinados através da realização de cinco algoritmos (RefFinder, geNorm, BestKeeper, Normfinder e ΔCt comparativa) e classificação de os genes de cada algoritmo individualmente. Estas fileiras foram resumidos, com a classificação mais baixa soma que representa o gene de referência mais expressa de forma estável e a maior soma de classes que representa o gene de referência, expressa menos estável. Em todas as linhas celulares investigadas (Figura 3A) identificamos

HSPCB,

RRN18S

e

RPS13

como os 3 genes de referência, expressa mais estável.

B4GALT6

era o gene de referência menos estável. No subgrupo de linhas celulares de cancro do cólon

HSPCB

, YWHAZ, e

RPS13

foram os 3 genes de referência, expressa mais de maneira estável (Figura 3B). Além disso, no subgrupo de linhas celulares de cancro normais e ovarianos, os respectivos genes foram

PPIA

,

RPS13

e

SdhA

(Figura 3C).

(A) Todas as linhas celulares investigadas (n = 25), as linhas (B) células de cancro do cólon (n = 9), e (C) As linhas celulares de cancro do ovário e normais (n = 11). Números destacar os três primeiros genes de referência mais estáveis ​​em cada conjunto experimental para cima.

Estes resultados mostram que os genes de referência mais expressos de forma estável variam entre os diferentes conjuntos de linhas celulares, com apenas

RPS13

estando presente em todos os três conjuntos de linhas de células dentro dos primeiros 3 genes de referência superiores. Curiosamente, o gene de referência mais utilizado

GAPDH

estava entre o gene de referência, expressa pelo menos de forma estável em nosso set up.

Além disso, investigamos a correlação entre os cinco algoritmos aplicados que proporcionam os genes mais estáveis . A correlação entre todos os cinco testes de estabilidade foi moderada a alta entre os algoritmos aplicados. foi observada a maior correlação entre Normfinder eo delta comparativa método Ct (r = 0,99) (Figura 4), indicando que todos os 12 genes de referência foram praticamente idêntico classificado. A menor correlação (r = 0,71) foi entre o delta método Ct e RefFinder, indicando uma alta discrepância no ranking.

Valor absoluto da correlação de Pearson e

p

-VALOR indicadas por asteriscos (0 ***, ** 0,01). Fundo dos gráficos de dispersão visualiza correlação bivariada entre os testes de estabilidade investigadas, incluindo uma linha ajustada.

Discussão

1) realizaram uma revisão da literatura sobre o cumprimento das diretrizes MIQE no desempenho de experiências RT-qPCR identificar conjuntos de genes de referência, 2) avaliou o desempenho de algoritmos para o ranking de genes de referência por sua estabilidade expressão; e 3) identificou um conjunto de genes de referência adequados e mais confiáveis ​​para a nossa selecção de linhas celulares de cancro humanas de diferentes origens.

A nossa revisão da literatura revelou que o cumprimento das orientações MIQE foi apenas parcial. informações essenciais [5], tais como a integridade do RNA, a quantidade de RNA total na reacção, a quantidade de cDNA, a gama de diluição para curvas padrão, ea eficiência da qPCR é frequentemente ausente em publicações, que não está em conformidade com as diretrizes MIQE . Mais próximo possível a conformidade com as diretrizes para a realização de RT-qPCR, bem como relatar esta informação em publicações contribui para a melhoria do desenho do estudo experimental e assegura a reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados do estudo. Caso contrário, detectadas diferenças mínimas na expressão do gene alvo pode ser um resultado potencial de variações na expressão de genes de referência.

Demonstrámos que inverter transcritases fornecidas por fabricantes diferentes conduzir a variações nos ciclos de quantificação (CQ-se a 3). Por isso, pode ser útil considerar diferentes RTS e para testar diferentes conjuntos de iniciadores, oligo dT ou aleatórios 6 meros ou ambos em combinação antes das experiências empresa. Os nossos resultados também estão em concordância com os estudos anteriores, onde os rendimentos variaram de transcritos até 100 vezes entre as diferentes transcriptases inversas de um modo dependente gene- [20], [21]. Encontramos na literatura e confirmado no nosso estudo que os diferentes estratégias de iniciação de síntese RT são cruciais para a medição quantitativa da expressão do gene [21]. Além disso, observamos em nossas próprias experiências que nenhum RT é superior a outros RTs e, portanto, nenhuma conclusão pode ser feita para a escolha do RT priming; isto é, nenhuma decisão pode ser tomada no que iniciador é melhor do que o outro.

A utilização de algoritmos estatísticos para as medições de estabilidade foi examinada criticamente porque todos estes algoritmos são baseados no pressuposto de que nenhum dos genes de referência estudados mostrar variação sistemática no perfil de expressão entre as amostras de [22]. Além disso, a nossa revisão da literatura mostrou que na maioria dos estudos apenas um ou dois algoritmos foram aplicadas. O nosso estudo revelou uma variação considerável na correlação entre os algoritmos aplicados. Além disso, apesar do relativamente elevada correlação (r = 0,9) entre a geNorm e os algoritmos Normfinder, a aplicação destes dois algoritmos de classificação idêntico entregue em apenas 5 dos 12 genes de referência investigados. Isto representa uma lacuna que pode levar a uma falsa seleção de genes de referência, que podem ter um impacto negativo sobre a qualidade ea fiabilidade dos dados. Recomendamos, portanto, que mais de dois algoritmos deve ser aplicada para a seleção dos genes de referência.

Temos utilizado anteriormente demonstrado e publicado pares de primers para a detecção de níveis de transcrição de genes de referência putativos em uma piscina do normal e câncer linhas de celular. Em geral, quase todos os genes de referência realizada de uma forma adequada e pode ser utilizado para estudos posteriores, utilizando linhas celulares. Além disso, com base nos resultados sobre a variabilidade intra e inter-ensaio de todos os genes de referência investigados podem ser usados ​​para futuras investigações. No entanto, entre todas as linhas celulares testadas verificou-se que

HSPCB

,

RRN18S

, e

RPS13 Quais são os genes mais expressos estavelmente sugerindo a sua adequação como genes de referência para estudos futuros dentro desta montagem experimental. Investigações sobre cólon e normal, assim como linhas celulares de cancro do ovário revelou discrepâncias esperados entre genes de referência selecionados e, portanto, deve ser considerado em estudos futuros. Isso demonstra que os genes de referência têm de ser cuidadosamente seleccionados para cada conjunto experimental para cima.