Abstract
A infiltração de macrófagos é um fator prognóstico negativo para a maioria dos cânceres, mas tumores gastrointestinais parecem ser uma exceção. O efeito de macrófagos na progressão do cancro depende de o seu fenótipo, que pode variar entre M1 (pró-inflamatória, defensivo) para M2 (tolerogénico, pró-tumoral). cancros gastrointestinais muitas vezes se tornam uma fonte ectópica de gastrina e macrófagos possuem receptores para esses peptídeos. O objetivo do presente estudo é analisar se gastrinas pode afetar o padrão de infiltração de macrófagos em tumores colorretais. Nós avaliamos a relação entre a expressão da gastrina e o padrão de infiltração de macrófagos em amostras de cancro colo-rectal e da influência destes peptídeos no fenótipo de macrófagos diferenciados dos monócitos periféricos humanos in vitro. O número total de macrófagos (células CD68 +) foi semelhante no tecido circundante tumoral e normal, mas o número de macrófagos M2 (células CD206 +) foi significativamente mais elevada no tumor. No entanto, o número destes macrófagos associados a tumores M2 correlacionada negativamente com a imunorreactividade de gastrina péptidos em células epiteliais de tumor. Macrófagos diferenciados a partir de monócitos periféricos humanos na presença de progastrina apresentaram níveis mais baixos de M2-marcadores (CD206, IL10) com quantidades normais de M1-marcadores (CD86, IL12). Progastrina induziu efeitos semelhantes em macrófagos maduros, tratados com IL4 para se obter um fenótipo-M2 ou com LPS mais IFNy para gerar M1-macrófagos. Os macrófagos diferenciados na presença de progastrina apresentada uma redução da expressão de ligandos de Wnt e diminuiu o número e aumento da morte celular de células epiteliais do cancro colo-rectal em co-cultura. Os nossos resultados sugerem que a progastrina inibe a aquisição de um fenótipo-M2 em macrófagos humanos. Este efeito exercido sobre os macrófagos associados a tumores podem modular a progressão do câncer e deve ser levado em conta quando se analisa o valor terapêutico da imunoneutralização gastrina
Citation:. Hernández C, Barrachina MD, Cosín-Roger J, Ortiz-Masiá D, Álvarez A, Terrádez L, et al. (2014) progastrina reprime a Activation Alternativo de macrófagos humanos e modula a sua influência sobre cólon células cancerosas epiteliais. PLoS ONE 9 (6): e98458. doi: 10.1371 /journal.pone.0098458
editor: Joseph Najbauer, Universidade de Pécs Medical School, Hungria
Recebido: 04 de dezembro de 2013; Aceito: 04 de maio de 2014; Publicação: 05 de junho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Hernández et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Educación y Ciencia /FEDER [número de concessão SAF2007-064201], Ministerio de Ciencia e Innovacion [números de subvenção SAF2010-20231, SAF2010-16030 e RYC-2011-09571], Ministerio de Sanidad y Consumo [número de concessão PI11 /00327], CIBERehd [número de concessão CB06 /04/0071] e Generalitat Valenciana [número de concessão PROMETEO /2010/060]. Carlos Hernandez reconhece o apoio do programa “Ramon y Cajal” do Ministerio de Ciencia e Innovación de Espanha (RYC-2011-09571). Jesús Cosín-Roger é apoiado por bolsas de FPU de Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
os macrófagos são um componente significativo de tumores e exibem uma variedade de funções, dependendo do ambiente local. Eles podem ser pró-inflamatória e ajudar a gerar respostas imunitárias adaptativas (macrófagos activados, classicamente M1) ou anti-inflamatórias (macrófagos alternativamente activados, M2) tolerogénicos /[1], [2]. Antitumorais associados ao macrófagos (TAMs) muitas vezes se assemelham M2-macrófagos e, por conseguinte, em vez de lutar contra as células cancerosas, estes leucócitos promover o crescimento do tumor por amortecendo a resposta imunológica e através da secreção de factores de crescimento e angiogénicos, bem como as enzimas necessárias para a célula invasão. Como consequência, a presença de TAM tem sido correlacionada com uma diminuição da sobrevida em doentes com e.g. melanoma, mama, rim ou câncer de bexiga. A situação parece ser diferente em alguns processos cancerosas que afectam o tracto gastrointestinal. Em pacientes com cancros colo-rectal ou gástricas uma infiltração de macrófagos mais elevado se correlaciona com um melhor prognóstico [3]. As razões para esta função diferencial de macrófagos nestas doenças em particular está longe de ser claro, mas a partir do conhecimento actual pode-se inferir que o microambiente do tumor gástrico /colorrectal marca um equilíbrio diferente na função de infiltração de macrófagos M1 e M2, com macrófagos M2 exercendo uma oposição com defeito para os acompanhantes M1-fagócitos [4], [5]. No entanto, os mecanismos responsáveis por este efeito é desconhecido.
pólipos adenomatosos maioria, colorectal e tumores gástricos expressar ectopicamente o gene da gastrina. No entanto, estas células cancerosas não são de natureza endócrina e, principalmente, sintetizar o precursor hormona progastrina [6] – [8], que tem ação proliferativa sobre as células cancerosas [9]. Embora progastrina podem ligar-se com baixa afinidade à gastrina ao CCK-2 receptores e esta interacção pode contribuir em certa medida para a sua actividade biológica [10], o efeito de promoção do crescimento da progastrina parece ser mediada principalmente por um receptor não-convencional recentemente identificado como anexina II [9]. Temos observado que a gastrina exerce uma actividade pró-inf lamatória através de receptores de CCK-2 [11] – [13], que são expressos em macrófagos e células endoteliais, enquanto anexina II é altamente expresso na superfície de macrófagos, onde serve como um patógeno elemento de reconhecimento e medeia a activação dos macrófagos [14].
a nossa hipótese era a de que os péptidos produzidos localmente gastrina em tumores do cólon pode influenciar a função dos macrófagos infiltrados e, deste modo, modular a resposta imune a doença. Observou-se que a expressão de péptidos gástricas em células de tumor colorectal correlaciona-se com uma infiltração reduzida de M2-macrófagos e progastrina mostrou que modula o processo de maturação de macrófagos humanos in vitro, e reprime a aquisição de um fenótipo-M2. Progastrina também reduziu a secreção de ligandos de Wnt por M2-macrófagos e aumento da sua capacidade de induzir apoptose de células epiteliais do cancro do cólon.
Métodos
Pacientes
Vinte e um curativo ressecado doentes com carcinoma colorectal (Tabela 1) foram selecionados aleatoriamente de pacientes operados no Hospital de Manises. Nenhum deles tinha qualquer pré-operatório radio /quimioterapia. Imediatamente após a ressecção, um pedaço de tecido normal e tumoral contendo circundante foi fixado em formalina tamponada e embebidos em parafina. patologistas experientes documentou as características histopatológicas dos tumores, incluindo o estágio do tumor, grau de diferenciação, o tamanho, a linfa /angioinvasion, invasão perineural e comprometimento de linfonodos. estágio do tumor foi definida de acordo com o sistema TNM. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Hospital de Manises (Valência). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.
Inmunohistochemistry
As secções em série (4 mm) de amostras contendo tumor e mucosa normal de cada paciente foram coradas para gastrina, Wnt1, CD68 como um marcador de macrófagos, CD86 como um marcador M1-macrófago ou CD206 como um marcador M2-macrófago. As amostras foram submetidas a diferentes métodos de recuperação de antigénios dependendo do epitopo (Tabela 2). A actividade da peroxidase endógena foi suprimida por imersão em peróxido de hidrogénio a 0,3%. Depois bloqueou-se com soro de cavalo a 5%, as secções foram incubadas durante a noite (4 ° C) com o anticorpo primário correspondente (Tabela 2). Um anticorpo biotinilado de cavalo anti-ratinho /coelho (Vector Laboratories, CA, EUA, 1:200) foi usado como um anticorpo secundário. O Vectastain Elite ABC kit de sistema (Vector Laboratories, CA, EUA), seguido do sistema de substrato líquido DAB reforçada para imuno-histoquímica (Sigma-Aldrich, Missouri, EUA) foram utilizados para o desenvolvimento. Todos os tecidos foram contrastadas com hematoxilina e a especificidade da imunocoloração foi confirmado se secções de tecido análogos mostraram uma ausência de coloração após o uso de imunoglobulina não-imune do mesmo isotipo e na mesma concentração que o anticorpo primário ou depois omitindo o anticorpo secundário.
a área representativa (objetiva de 40X, 6 campos, 0,22 mm
2) a partir de tecido tumoral ou tecido glandular normal adjacente foi selecionado para análise quantitativa de infiltração de macrófagos. A gastrina coloração em cada uma das amostras foi avaliada e uma pontuação quanto à intensidade de 1 a 4 foi atribuída. Apenas o cancro células epiteliais reagiu com o anticorpo de gastrina e a intensidade da coloração foi muito homogénea através de todo o compartimento do tumor epitelial. Todas as amostras foram processadas em paralelo e um observador, não o número paciente e diferente da pessoa que processadas e analisadas as colorações imunológicas de macrófagos, atribuída uma pontuação para cada paciente com base na intensidade de coloração observada em três imagens representativas de diferentes partes do tumoral.
cultura celular
células mononucleares de sangue periférico humano foram isolados a partir de dadores saudáveis, por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll. Os monócitos foram semeadas em placas de cultura de tecidos e amadurecido para macrófagos através da cultura em X-Vivo 15 médio (BioWhittaker) suplementado com 1% de soro humano e 20 ng /nl de M-CSF humano recombinante (Peprotech) a 37 ° C em 5% de CO
2 para até 6 dias. A fim de obter uma polarização M1, as células foram incubadas com /ml de LPS (1 ug a partir de Escherichia coli 0111: B4, Sigma-Aldrich), mais de 20 ng /ml de IFN-y humano recombinante (Peprotech) durante as últimas 24 horas. M2 polarização foi obtido por tratamento de células com 20 ng /ml de IL4 humano recombinante (Peprotech) para as últimas 48 horas do período de cultura. O processo de maturação, bem como os tratamentos de activação foram levadas a cabo na presença ou ausência de diferentes concentrações de progastrina (10
-7M, Abgent).
Caco-2 células (American Type Culture Collection, VA, EUA) foram cultivadas em meio MEM (Sigma-Aldrich) suplementado com 20% inactivado soro fetal bovino, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, sódio 100 mM piruvato e 1% de aminoácidos não essenciais.
Caco-2 As células foram co-cultivadas com os macrófagos derivados de monócitos utilizando inserções Transwell (Corning Incorporated, MA, EUA) com uma membrana porosa de 0,4 ^ M [12] . Os monócitos foram semeadas sobre estas inserções e diferenciadas para macrófagos, na presença ou ausência de diferentes concentrações de progastrina. No dia 6 após a sementeira, as pastilhas foram colocadas em cima das células Caco-2 (t = 0) e foram mantidas em co-cultura durante 24 horas.
A presença das moléculas de superfície CD86 (M1) e CD206 (M2) em macrófagos em cultura foi analisada por microscopia de fluorescência (microscópio IX81, Olympus, Hamburgo, Alemanha). Os macrófagos foram incubadas com Hoescht para identificar os núcleos e com anticorpos fluorescentes marcado contra esses alvos (Tabela 2). A fluorescência foi analisada com o software ScanR citometria estática ( 5000 células /poço). .A Concentração das citocinas IL-12 (Th1) e IL10 (Th2, anti-inf lamatório) em sobrenadantes de células foi determinada por ELISA (Diaclone)
O número de células Caco-2 após a co-cultura foi contado numa câmara de Newbauer. A apoptose nestas células foi estudada por citometria de fluxo como anexina V bivariável /análise PI (Apoptosis Detection Kit, Abcam).
ARN total de macrófagos ou de células Caco-2 foi isolado usando o kit de extracção (Illustra RNAspin Mini , GE Healthcare Life Science) e cDNA foi obtido com o primeiro-Script RT Kit reagente (Takara Biotecnologia). PCR em tempo real foi realizado com o Primeiro Reagente Script kit perfeito Tempo Real (Takara Biotechnology) num ciclizador térmico LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). oligonucleótidos específicos foram concebidos de acordo com as sequências mostradas na Tabela 3. Expressão do gene relativa foi expressa como previamente descrito [15].
A análise estatística
Os dados são expressos como média ± S.E.M. e foram comparadas por análise de variância (ANOVA-uma forma) com a correcção pós-hoc de Newman-Keuls para comparações múltiplas ou um teste-t, quando apropriado. Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As correlações clínicas em amostras humanas foram analisados pelo coeficiente de correlação de Pearson.
Resultados
M2 número de macrófagos é aumentada na área tumoral
O primeiro analisou a quantidade e fenótipo de macrófagos nos não-tumorais e tumores áreas de pacientes com câncer colorretal. Imuno-histoquímica para CD68 (marcador de macrófagos), CD86 (M1 marcador de macrófagos) e CD206 (M2 marcador de macrófagos) foi realizada em amostras de biópsias de ressecções de carcinoma colorretal. Digno de nota, o número de macrófagos era semelhante em tumor e tecido normal circundante, mas o número de M1 e M2 macrófagos foi significativamente diferente entre os dois locais (Figura 1). Tumor estroma continham um número menor de CD86 (+) células do que a lâmina de tecido normal. Em contraste, um número maior de células CD206 (+) foi encontrada em tecido tumoral em comparação com o tecido circundante normal, sugerindo que o desenvolvimento do tumor favorece a diferenciação de monócitos para macrófagos M2.
A imunorreactividade de CD68 (marcador de MF, a-B), CD86 (marcador M1-MF, C-D) e CD206 (M2-MF marcador, e-F) foi analisada no cancro colo-rectal (B, D, F) e da mucosa circundante saudável (a, C, e ). (G) A análise quantitativa de células positivas para estas moléculas em uma área representativa de 0,22 mm
2 (Barra de escala = 0,2 mm). Barras representam a média ± EPM (n = 21). ** P 0,01 e *** P . 0,001 vs valor correspondente na mucosa normal
expressão gastrina é aumentada no tumor, mas se correlaciona negativamente com o número de macrófagos M2
Procura mediadores que podem modular o fenótipo de macrófagos no tumor foi estudado o papel da gastrina péptidos sobre a expressão de marcadores de macrófagos em diferentes amostras de biópsia. Uma vez que o anticorpo gastrina utilizado neste estudo reconhece ambos os precursores da gastrina e de gastrina, como progastrina, podemos não discrimina entre diferentes péptidos de gastrina, mas observou-se imunorreactividade extensa do tumor em células epiteliais de biópsias analisadas. A coloração em cada uma das amostras foi avaliada e uma pontuação quanto à intensidade de 1 a 4 foi atribuída (Figura 2A). Não se observou qualquer correlação entre os níveis de gastrina em tumores e o número do total (células CD68 +) ou M1 (células CD86 +) em ambos os macrófagos no tumor ou no tecido normal (Figuras 2B e 2C). Surpreendentemente, o número de macrófagos M2 no tecido tumoral e normal negativamente correlacionada com a expressão de gastrina. Esta correlação foi mais significativa no tumor, em que o péptido é sintetizado. Tomados em conjunto estes dados sugerem que a gastrina péptidos sintetizados por células tumorais reduz o número de macrófagos M2, sem afectar o número total de macrófagos.
O número de macrófagos totais (células CD68 +, B), M1-macrófagos (CD86 + células, c), e M2-macrófagos (células CD206, d), no tumor e tecido normal circundante foram analisados em relação à gastrina expressão no tecido tumoral (a, marcar 1 a 4, barra de escala = 0,2 mm). A correlação negativa e significativa é observada entre a intensidade da coloração gastrina e o número de M2-macrófagos na mucosa normal e tecido tumoral (D).
progastrina diminui a diferenciação dos macrófagos em direção a um fenótipo M2
a hipótese que progastrina poderiam ser responsáveis pelos efeitos observados sobre o fenótipo de macrófagos, porque as células cancerígenas do cólon possuem as enzimas necessárias para a maturação gastrina completa [7]. Para investigar se progastrina pode modular a diferenciação de macrófagos para um M1- ou M2-fenótipo nos tratados monócitos periféricos humanas obtidas de voluntários saudáveis com várias concentrações de progastrina e deixou-se diferenciar. experiências de citometria estáticas realizados com anticorpos fluorescentes específicos mostrou que progastrina reduziu a expressão do CD206 M2-marcador em macrófagos derivados de monócitos do mesmo na concentração mais baixa analisada. Em contraste, nenhuma alteração na expressão da CD86 M1-marcador foram detectados. Além disso, foi medida a concentração de IL-12 e IL-10 no sobrenadante de macrófagos derivados de monócitos, após 6 dias de diferenciação na presença de doses crescentes de progastrina. O precursor gastrina provocou uma redução significativa da secreção de IL-10, mas não alterou os níveis de IL-12 (Figura 3). Os nossos dados indicam que a progastrina inibe a expressão de M2-marcadores durante a diferenciação de macrófagos, sem afectar a expressão de M1-marcadores.
monócitos periféricos humanos foram derivados para macrófagos, na presença ou ausência de progastrina e o fenótipo da resultante macrófagos avaliado através dos seguintes parâmetros: a expressão de CD86 (a, C, n = 3); expressão de CD206 (B, D, n = 3); a secreção de IL-12 (F, n = 4); e a secreção de IL-10 (G, n = 4). Barras representam a média ± SEM. * P 0,05 e ** P . 0,01 vs valor em células tratadas com o veículo correspondente
De modo a estudar o efeito da progastrina na diferenciação mediada por IL4 dos macrófagos em relação um fenótipo M2-incubámos totalmente diferenciadas macrófagos derivados de monócitos com IL-4 e de diferentes doses de progastrina durante dois dias. basais macrófagos tratados com IL-4 mostrou um aumento significativo na expressão de CD206, um aumento não significativo na secreção de IL-12 e semelhante a produção de IL-10 do que os controlos. Progastrina reduziu significativamente a indução de CD206 por IL-4 e IL-12 aumentou a secreção a níveis significativamente mais elevados do que os observados em células de controlo, enquanto a secreção de IL-10 permaneceram inalterados. No entanto, a diferenciação de macrófagos no sentido de uma M1-fenótipo não foi afetada pela progastrina. O tratamento com LPS mais IFNy aumentou a expressão de CD86, e a secreção de ambas IL12 e IL10 nos macrófagos, mas não progastrina modificar qualquer destes parâmetros (Figura 4).
macrófagos derivados de monócitos humanos foram estimulados com LPS mais IFNy para se obter um fenótipo-M1 ou com IL4 obter M2-macrófagos, na presença ou ausência de progastrina, e o fenótipo resultante avaliado através dos seguintes parâmetros: a expressão de CD86 (a, n = 3); expressão de CD206 (B, N = 5); a secreção de IL-10 (C, D, n = 5); e a secreção de IL-12 (E, F, n = 5). Barras representam a média ± SEM. * P 0,05 vs valor em células tratadas com o veículo correspondente;
+ P 0,05 e
++ P . 0,01 vs valor correspondente em células de controle
progastrina down-regula ligantes Wnt em macrófagos e aumenta a morte celular nas células Caco2 co-cultivadas
a seguir, analisou se a modulação do fenótipo de macrófagos por progastrina poderia afetar as células tumorais vizinhas. Temos recentemente relatou que M2-macrófagos sintetizar e secretar ligantes Wnt que podem modular o comportamento de células epiteliais co-cultivadas [16] e no presente estudo observou-se imunorreatividade para Wnt1 em células do estroma tumoral. Avaliação qualitativa da expressão de ligando de Wnt este indica que a quantidade de células positivas diminui à medida que a produção de gastrina em células de cancro aumenta (Figura 5A). A relação causal entre os dois factores é apontado pelos nossos estudos in vitro que mostram que os macrófagos maturados na presença de progastrina apresentam uma expressão de ARNm significativamente reduzido de três ligandos de Wnt diferentes (Wnt1, Wnt3a, e Wnt5, Figuras 5B-5D). relevância funcional da sub-regulação dos três ligandos Wnt em macrófagos é demonstrada pelo facto de que as células Caco2 co-cultivadas com os macrófagos tratados com progastrina expressaram menos do que ARNm Lgr5 células Caco2 co-cultivadas com os macrófagos de controlo (Figura 5E). Estes dados indicam que os efeitos dos ligandos na progastrina Wnt derivadas de macrófagos modular a via de sinalização Wnt em torno células tumorais.
A imunorreactividade para Wnt1 no estroma do cancro colorectal em relação à expressão de gastrina no mesmo tecido (barra de escala = 0,2 mm) (A); e os efeitos da presença de progastrina durante a diferenciação de monócitos periféricos humanos para macrófagos sobre a expressão de ARNm de três ligandos de Wnt diferentes nestes macrófagos (B-D, n = 5) e a expressão de ARNm de Lgr5 em células Caco-2 co-cultivadas (E , n = 7). Barras representam a média ± SEM. * P 0,05 e ** P . 0,01 vs valor em células tratadas com o veículo correspondente
Além disso, a co-cultura de Caco-2 com os macrófagos tratados com progastrina resultou numa redução significativa do total número de células epiteliais em conjunto com um aumento da taxa de apoptose (Figura 6).
os efeitos dos macrófagos derivados de monócitos humanos obtidos na presença ou ausência de progastrina do número (a) e a taxa de apoptose ( B) de células Caco-2 foram analisados num sistema de co-cultura (24 h, n = 4). Barras representam a média ± SEM. * P 0,05 vs valor em macrófagos tratados com o veículo,
+ P 0,05 e
++ P 0,01 vs células incubadas com uma inserção vazio (w /o MF)
Discussão
Este estudo mostra que os macrófagos que se infiltram tumores colorretais têm um perfil fenotípico diferente do que aqueles que estão presentes no tecido normal ao redor da lesão cancerosa, com uma maior proporção dos anti-inflamatórios M2-macrófagos e significativamente menor número de classicamente activados M1-macrófagos. Curiosamente, os nossos resultados indicam que a expressão da gastrina no tecido tumoral exerce uma influência negativa sobre o número de M2-tumorais macrófagos.
A expressão de gastrina em células tumorais epiteliais se correlaciona negativamente com o número de M2-tumorais e macrófagos nosso in vitro resultados sugerem uma relação causal entre os dois fatores. macrófagos humanos obtidos por cultura de monócitos periféricos na presença de progastrina mostraram uma redução da expressão de CD206. Além disso, este péptido impediu significativamente a expressão de CD206 quando os macrófagos maduros foram estimuladas com citoquina IL4 Th2 para induzir um fenótipo-M2. Em contraste, progastrina não afectou a expressão da molécula co-estimuladora CD86, quer em condições de repouso ou em macrófagos estimulados com LPS mais IFNy para desenvolver um M1-fenótipo. Progastrina também afecta o padrão de secreção de citoquinas. Os macrófagos maturados na presença deste péptido libertado quantidades inferiores da IL10 anti-citocina inflamatória enquanto mantendo libertação normal do indutor de Th1 IL12. Em macrófagos estimuladas por IL4, os efeitos sobre a secreção de citocinas foram diferentes, mas no mesmo sentido. Neste caso, a liberação IL10 não foi afetada enquanto o peptídeo facilitou a secreção IL12. Assim, é expectável que estes macrófagos que estão sob a influência de progastrina no tecido canceroso apresentar um anti-inflamatória, imunossupressiva perfil embotada.
Este efeito é, de acordo com a acção pró-inflamatória anteriormente descrito da gastrina [11 ] – [13]. Observou-se que a gastrina contribui para a inflamação induzida por Helicobacter pylori em ratos, provavelmente, através da activação do receptor de CCK-2 em macrófagos enquanto que a estimulação deste receptor activa as células endoteliais humanas para promover a adesão de monócitos. Os receptores de CCK-2 podem ligar-se todos os péptidos gastrina, embora a sua afinidade para a gastrina maduro é significativamente maior do que a demonstrada para progastrina. As acções do último pode ser, alternativamente, transmitido pelo receptor recentemente caracterizada não-convencional anexina II [9]. Ambos os tipos de receptores estão presentes em macrófagos e ambas as vias de activação de macrófagos promover [14]. Assim, os presentes resultados reforçam a noção de que os péptidos de gastrina tendem a contribuir para a inflamação embora mecanismo diferente podem estar envolvidos em cada caso.
A influência dos macrófagos na progressão do cancro é devido ao seu efeito sobre a resposta imunológica contra o tumor, mas também a um efeito local directo nas células cancerosas epiteliais circundantes. Os macrófagos podem ser uma fonte de ligandos de Wnt [17], a via activada oncogénica na maioria dos cancros colo-rectais e um contribuinte significativo para stemness célula cancerosa [18], [19]. A secreção destes factores é especialmente relevante em uma subpopulação de TAM que parecem desempenhar um papel especial na invasividade do tumor através da promoção da angiogénese e a migração de células tumorais por meio de sinalização Wnt-[20], [21]. Wnt1 foi detectada nas células do estroma tumoral e a sua presença tendeu a diminuir, como o nível de gastrina no tumor aumentou. Observámos recentemente que a secreção de ligandos Wnt é especificamente aumentada em macrófagos M2, que promovem a via de sinalização Wnt /β-catenina e a consequente actividade proliferativa em células de cancro do cólon co-cultivados [16]. Os nossos resultados actuais mostram que os macrófagos maturados na presença de progastrina expressam quantidades inferiores de três ligandos de Wnt diferentes e provocar uma redução significativa no número de células Caco-2 co-cultivadas. Este efeito ocorre com uma concomitante diminuição na expressão nestas células do cólon de Lgr5, um gene alvo Wnt [22] que potencia Wnt /β-catenina sinalização [18]. Além disso, macrófagos maturados na presença de progastrina tendem a aumentar a taxa de apoptose em células Caco-2, um efeito que também pode estar relacionada com reduzida sinalização Wnt [23]. Assim, as alterações fenotípicas induzidas pela progastrina em macrófagos modificar a sua influência sobre as células epiteliais do cancro do cólon, resultando numa diminuição do número de células estes provavelmente por uma combinação de proliferação reduzida e aumento da morte celular por apoptose. Além disso, a redução da produção de ligandos Wnt induzida por progastrina também podem contribuir para as alterações fenotípicas descritos induzidas por este péptido uma vez que um efeito autócrino de Wnt5a em macrófagos para reduzir a expressão de IL-12 em resposta a produtos bacterianos tem sido descrita [24].
a partir de nossos resultados, podemos inferir que gastrinas, inibindo a aquisição de um M2-fenótipo em macrófagos locais, pode regular a progressão do câncer. É claro que os macrófagos M2 estimular o crescimento de células epiteliais do cólon-cancerosas in vitro e estudos experimentais demonstraram que a M2-macrófagos no tumor promover o cancro do cólon em ratos [25] – [27]. Nos cancros colo-rectais humanos, o efeito de M2-macrófagos parece mais complicada e afectada por vários factores, como a sua distribuição espacial [4], a quantidade relativa de macrófagos M1 [5] ou o estágio da doença [4]. Apesar de sua presença ter sido visto como um fator prognóstico negativo por alguns autores [28], outros sugerem que os macrófagos M2 ter um efeito menos perigoso no câncer colorretal humano do que em outras configurações e apontam para a idéia de que algum fator local especificamente presentes nesse tipo de tumores pode ser para baixo-regulação seu tumor de promoção da acção [4], [5], [29]. Tendo em mente que M1 e M2 macrófagos não são clonalmente diferentes conjuntos de células, mas os extremos de um espectro largo de fenótipos intermediários e que a classificação de uma célula, como um macrófago M2 podem ser influenciados pelo marcador molecular seleccionado, em cada caso, se iniciar o ideia de que aqueles macrófagos identificados como M2 nesses estudos pode ser menos prejudicial por causa da progastrina.
Uma função proliferativa directa de progastrina em células epiteliais foi claramente demonstrado em células e ratos isolados, e estudos experimentais com animais transgênicos sugerem que a superexpressão da gastrinas na presença de agentes que danificam o ADN aumenta a carcinogénese. Esta evidência levou várias estratégias farmacológicas para neutralizar a actividade de péptidos de gastrina, com resultados positivos em modelos murinos, mas, infelizmente, poucos e indefinidos resultados em pacientes [30]. Os nossos resultados sugerem que, pelo menos, em seres humanos, progastrina pode desempenhar um papel multifacetado na progressão de tumores colo-rectais, como a sua actividade proliferativa em células epiteliais se oporia por uma acção anti-tumoral potencialmente exercida sobre os macrófagos. A relevância deste efeito sobre as células imunes para a atividade global de progastrina aguarda avaliação por pesquisas futuras.
Conclusões
Nosso estudo indica que os peptídeos gastrina sintetizadas por células cancerígenas do cólon têm macrófagos como os seus objectivos e provavelmente afectar o infiltrado inflamatório do tumor, o que por sua vez afecta a progressão do cancro. A inibição da M2-polarização induzida por progastrina iria contrariar a sua actividade proliferativa e, embora seja difícil estimar a magnitude deste efeito, esta observação deve ser tida em conta quando se analisa o valor terapêutico da gastrina imunoneutralização [31].
Reconhecimentos
Agradecemos a Brian Normanly para a sua edição de idioma Inglês e do Serviço de Hematologia do Hospital Clínico Universitário de Valência para a extração de amostras de sangue.