Abstract

intervenções baseadas em Imunologia têm sido propostos como uma chance de cura promissora para atacar eficazmente doença residual mínima pós-operatória e localizações metastáticas distantes de tumores de próstata. Foi desenvolvido um receptor de antigénio quimérico (CAR) construção de direccionamento do antigénio específico da próstata humana membrana (hPSMA), com base em um novo e mAb específico de alta afinidade. Como um método de transferência, que empregue vectores lentivirais de última geração (LV) transportando um promotor bidireccional sintético capaz de expressão robusta e coordenada da molécula CAR, e um gene repórter bioluminescente para permitir a identificação de células T transgénicas após

In vivo

transferência adotiva. Em geral, demonstrou-se que expressam CARRO LV eficazmente transduzidas curto prazo activado PBMC, que por sua vez foram prontamente estimulado a produzir citocinas e de exercer uma actividade citotóxica relevante por engate com o PSMA

+ células de tumor da próstata. Após a

in vivo

transferência em ratinhos portadores de tumor, as células T transduzidas-CAR foram capazes de erradicar completamente a neoplasia disseminados na maioria dos animais tratados, apoiando assim a tradução de tal abordagem no contexto clínico.

Citation: Zuccolotto G, Fracasso G, Merlo A, Montagner IM, Rondina M, Bobisse S, et al. Células Car-Engineered (2014) PSMA-Specific T Erradicar Disseminada câncer de próstata em modelos pré-clínicos. PLoS ONE 9 (10): e109427. doi: 10.1371 /journal.pone.0109427

editor: Natalia Lapteva, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de maio de 2014; Aceito: 01 de setembro de 2014; Publicação: 03 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zuccolotto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por doações da Associação Italiana de Investigação do Cancro (AIRC, IG-13121; e Programa Especial Molecular Clinical Oncology 5 por mille ID 10016 para AR) e da Universidade de Pádua, “Progetti Strategici di Ateneo 2011” a AR. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

terapia celular adotiva com modificado e

ex vivo

células T expandidas revelou-se eficaz contra diferentes entidades tumorais, em particular melanoma e tumores associados ao EBV [1]. Hoje em dia, a modificação genética das células T pode conferir novas propriedades de direccionamento para tumores que ocorrem naturalmente linfócitos, superando assim a dependência de componentes do sistema imune endógeno.

Enquanto transdução com TCR específico do Ag só pode redireccionar células T actividade com base nas mesmas características de reconhecimento, tecnologia Antigen Receptor quimérico (RCA) tem a potencialidade para dotar as células T com as características vantajosas de um anticorpo, ou seja, a especificidade, a afinidade e a possibilidade de segmentar antigénios não proteicos [2]. Além disso, em um carro única molécula fornece algumas medidas para contrariar estratégias de tumor de evasão imune: alivia o reconhecimento das células T ea atividade do MHC de restrição e expressão, e pode retransmitir sinais co-estimuladores através de seus domínios intracelulares

A eficácia terapêutica do CAR. As células T já foram relatados em pacientes, em particular contra a leucemia linfocítica crónica (CLL) e leucemia linfoblástica aguda (ALL) [3] – [6], com resultados muito promissores em termos de sobrevida livre de doença e hematológica completa e respostas moleculares mesmo em indivíduos que falharam todos os tratamentos padrão anteriores. No entanto, doenças malignas hematológicas, em particular as de origem da célula B, pode ser considerada como um alvo ideal para abordagens de imunoterapia [7]. De facto, estas células malignas, naturalmente, proporcionar ligandos do receptor de co-estimuladoras e partilham os mesmos compartimentos fisiológicos com células T transferidas adoptivamente. Finalmente, a eliminação de células B normais está associada com efeitos adversos potencialmente fatais, o que não pode ser clinicamente administrados com a administração intravenosa de imunoglobulina.

Por outro lado, o tratamento do tumor sólido continua a ser um desafio importante e deve ser melhorada, tanto em termos de eficácia clínica e segurança. sucessos parciais foram experimentados contra neuroblastoma, utilizando células T específicas CAR-GD2 sem pré-condicionamento regime, na ausência virtual de efeitos colaterais [8], [9]. Em contrapartida, não há respostas clínicas foram registadas com a infusão de células T redireccionada contra o receptor de folato em pacientes com carcinoma do ovário [10], nem contra carboxi-anidrase IX (CAIX) em pacientes com carcinoma de células renais [11], apesar da relevante “sobre -destino, off-tumor “toxicidade evidenciado, neste último caso. As lições aprendidas com essas experiências indicam que a definição do antígeno alvo para as questões de segurança, e a capacidade de persistência e homing tumor de células infundidas são particularmente críticos para o sucesso do tratamento.

Foram abordadas algumas dessas questões, visando próstata células cancerosas do tumor com células T modificadas para expressar um CARRO específico para o antigénio de membrana específico da próstata humana (hPSMA).

tumor da próstata representa uma entidade clínica grave, com 233.000 novos casos estimados e 29,480 mortes nos EUA em 2014 [12], com pelo Actualmente, apenas tratamentos paliativos para hormônio refratário e formas metastáticas [13]. Para estes doentes, a imunoterapia provou ser uma opção válida baseada na vacinação com células prostáticas tumorais modificadas inteiros (GVAX [14]) ou PBMC que apresentam um antigénio prostático relevante (Sipuleucel-T [15]). No que diz respeito às abordagens de terapia celular adotivos, estudos pré-clínicos têm relatado resultados encorajadores [13], [16], [17] e avaliação clínica está passando por (número de ensaios clínicos NCT01140373, NCT01929239, NCT00664196; www.clinicaltrials.gov). Neste cenário, PSMA pode representar um alvo adequado e, de fato, são actualmente explorados tanto para fins terapêuticos imagem e. Em particular, os níveis de expressão de PSMA diferenciar tecidos prostáticos normais e cancerosas, e paralelo a pontuação de Gleason de câncer de próstata [18]. Curiosamente, a expressão PSMA envolve neovasculatura de diversas entidades tumorais, prevendo assim um efeito antiangiogênico adicional.

Aqui, nós relatamos o design do carro contra hPSMA baseado em um romance e de alta afinidade específica mAb [19], ea fenotípica e caracterização funcional de t-corpo-hPSMA ambos

in vitro

e

in vivo

. Para a transdução, foi utilizado um vector lentiviral transportando um promotor bidirecional que impulsiona a expressão simultânea da molécula CAR e um gene repórter bioluminescente. Isto permitiu o rastreamento de células T infundidas e, portanto, a correlação direta do resultado terapêutico com a capacidade de persistência e homing das células T. Em geral, as células T transduzidas-CAR não só exerceu uma actividade terapêutica loco-regional relevante, mas também completamente erradicada uma neoplasia disseminada na maioria dos animais tratados. Estes resultados suportam fortemente a tradução de tal abordagem no contexto clínico

Materiais e Métodos

As linhas celulares

As seguintes linhas celulares foram usados ​​neste estudo:. LNCaP e PC3 , próstata humano linhas celulares de carcinoma; Jurkat T de leucemia linfoblástica humana e 293 t [20], a linha celular de rim embrionário humano. A linha de células PC3-PIP, expressando estavelmente PSMA humana (hPSMA) [21] foi generosamente fornecidos pelo Dr. Warren Heston; A linha celular de LNCaP foi obtido a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA). LNCaP, as células PC3, PC3-PIP e Jurkat foram mantidas em meio RPMI 1640 (Euroclone, Milão, Itália), enquanto que o meio DMEM (Biochrom AG, Berlim, Alemanha) foi utilizada para 293 células T; ambos os meios foram suplementados com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS, Gibco BRL Paisley, UK), 2 mM de L-glutamina, 10 mM de HEPES, 100 U /ml de penicilina, e 100 U /ml de estreptomicina (todos de Lonza, BioWhittaker, Basileia , Suíça), a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 atmosfera.

Anti-hPSMA geração carro

o carro contra o antigénio hPSMA contém a sequência completa do anti- hPSMA scFv derivado a partir do hibridoma anti-hPSMA D2B [19]. Esta sequência foi clonada no local de clonagem múltipla (MCS) do vector pSecTag2A (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Milão, Itália). O MCS do plasmídeo pSecTag2A está compreendida entre duas sequências: em 5 ‘, a Ig de murino kapa sequência líder de cadeia leve V-J2-C, e em 3’ da sequência de marcador myc. Assim, a sequência líder-scFv-myc foi utilizado para a produção de RCA. O fragmento líder-scFv-myc foi amplificado por PCR e inserido na construção de pBS SKII (Invitrogen). Uma porção da CD28 (bases 438-759) e o domínio intracelular CD3ζ (227-563 Região), ambos obtidos a partir de ADNc de EBV-specific CD4

+ células T [22], foram fundidos por PCR e, em seguida, inserido o vector pBS SKII, a jusante do fragmento líder-scFv-myc. Este vector foi então sequenciado no Centro Ricerca Interdipartimentale Biotecnologie Innovative (CRIBI), da Universidade de Pádua, Itália. A sequência anti-CAR hPSMA finalmente foi subclonado no vector pcDNA3.1 (Invitrogen). Para verificar a capacidade de dirigir a expressão da molécula de carro na membrana, este vector foi usado para transfectar células 293 T, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante.

LV plasmídeos e preparação de lentivírus

foram utilizados os seguintes vetores de embalagens de lentivírus: pMDLg /pRRE, pRSV-Rev, pMD2.VSVG e PAdvantage, todos gentilmente cedido pelo Dr. L. Naldini (San Raffaele, de Milão, Itália). O vector de transferência é um 945.pCCL.sin.cPPT.SV40ployA.eGFP.minCMV.hPGK.deltaLNGFR.Wpre # (SIN) vector auto-inactivação de VIH derivado de [23], que transporta um promotor bidireccional minCMVPGK divergente dirigir a expressão simultânea de dois genes na orientação anti-sentido. Os vectores de transferência usados ​​neste estudo levado a sequência de carro anti-hPSMA (obtido a partir do vector PMA-t-corpo) sob o controlo do promotor hPGK e a eGFP (reforçada proteína verde fluorescente), ou luciferase de pirilampo (Fluc) genes repórter sob o controlo de minCMV. vector PMA-T-corpo e sequência FLUC foram sintetizados por GeneArt, Life Technologies (Regensburg, Alemanha). Produção viral em 293 células T tem sido descrito anteriormente [23]. Um vector lentiviral que codifica apenas para FLUC [24] foi usado para transduzir células PC3-PIP.

Western blot análise

293 células T, untransfected ou transfectadas com pcDNA3.1-CAR, foram lisadas em tampão contendo 50 uM de Tris HCl pH 6,8, 2% de dodecilsulfato de sódio (SDS), 2% β-mercaptoetanol, 10% de glicerol, e 0,1-0,05% de bromofenol azul (ai a partir de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA ) As proteínas foram separadas em géis de 10% SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF (Immobilion-P, Millipore, Billerica, MA, EUA). A membrana foi bloqueada em 5% de leite desnatado (Sigma-Aldrich) em TBS e Tween 20 a 0,05%, seguido por incubação com o anticorpo primário (murganho anti-c-Myc mAb, 1:1000, Sigma-Aldrich) durante uma hora a temperatura do quarto. Depois de três lavagens de 10 minutos em PBS-Tween, de cabra conjugado com HRP anticorpo secundário IgG anti-ratinho (diluído 1:10000, Amersham, Milão, Itália) foi adicionado durante uma hora à temperatura ambiente em leite. A membrana foi desenvolvida utilizando o SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL, EUA) e visualizadas utilizando quimioluminescência. A intensidade de sinal foi medido utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência Bio-Rad XRS (grupo Life Science, Milão, Itália).

transdução de células de Jurkat

Para avaliar a funcionalidade de vectores de LV, as células Jurkat foram incubadas com sobrenadante viral (CAR hPSMA /eGFP LV ou hPSMA /luciferase LV RCA) durante 15 horas na presença de 8 ug /ml de sulfato de protamina (Sigma-Aldrich). Citometria de fluxo e bioluminescência (BLI) análises foram realizadas em diferentes momentos pós transdução para avaliar CAR e eGFP expressão ou atividade de luciferase.

T-corpos geração

Para gerar T-corpos, PBMC a partir de dadores saudáveis ​​foram activadas 48 horas com OKT-3 (50 ng /ml; Ortho Biotech Inc., Raritan, NJ, EUA) e IL-2 humana (hIL-2, 300 U /ml; PROLEUKIN; Novartis Pharmaceuticals, Horsham, RU ). As células T foram, então, infectadas com o sobrenadante virai durante 18 horas a 37 ° C e 5% de CO

2, na presença de sulfato de protamina (40 mg /ml; Sigma-Aldrich) e hIL-2 (500 U /ml ). O sobrenadante foi em seguida mudado com meio completo fresco contendo hIL-2 (100 U /ml). Setenta e duas horas mais tarde, as PBMC foram analisadas para o carro e expressão eGFP, e para a actividade de luciferase. PBMC foram referidos como T-corpo-hPSMA /eGFP e T-corpo-hPSMA /FLUC quando transduzidas com CAR hPSMA /eGFP LV ou CAR hPSMA /luciferase LV, respectivamente. T-corpos foram re-estimuladas uma vez por semana com irradiado (60 Gy) PC3-PIP numa proporção 10:01. meio completo com IL-2 fresca foi reabastecido duas vezes por semana

Os anticorpos

células que expressam CAR foram marcados com o anti-c-myc mAb (9E10 clone; Sigma-Aldrich). ou no de controlo de isotipo (IgG1 de ratinho, Southern Biotech, Milão, Itália), seguido por um anticorpo secundário (IgG de cabra conjugado com PE anti-ratinho; Southern Biotech). marcadores de superfície celular foram marcados utilizando APC-, FITC ou anticorpos conjugado com PE para CD4, CD8, CD57, CD27, CD28, CD62L (BioLegend, San Diego, CA, EUA), CCR7 (eBioscience, San Diego, CA, EUA) e os controles isotípicos relativos comprado de as mesmas empresas.

citotoxicidade ensaio

A atividade citotóxica de T-corpo-hPSMA /eGFP e T-corpo-hPSMA /FLUC foi avaliada em um padrão 4 h

ensaio de 51Cr-release conforme relatado anteriormente [25], em diferentes momentos pós-transdução. PC3, PC3-PIP e LNCaP foram usados ​​como células alvo.

ensaios de liberação de citocinas

Para avaliar a produção de IFN-γ, um IFN-γ Set Screening ELISA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) foi utilizado, de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 1 x 10

6 t as células foram semeadas com 1 × 10

6 células alvo (PC3 ou PC3-PIP) em poços em triplicado em placas de 96 poços de fundo redondo. secreção de citocinas foi medida após 12 horas de incubação utilizando T-corpos em diferentes fases de diferenciação. Os controlos negativos e positivos foram representados por não transduzidas PBMC e T-corpos não estimulado ou tratados com 40 ng /ml de PMA e 4 ug /ml de ionomicina (Sigma-Aldrich), respectivamente. Os sobrenadantes foram então analisados ​​em um X4 VICTOR (PerkinElmer, Zaventem, Bélgica).

Mice and

in vivo

experimentos

In vivo

experiências envolveram 6 aos machos 8 semanas de idade SCID, RAG2

– /- /yc

– /- e NOD /SCID (Charles River Laboratories, Calco, Como, Itália), que foram alojados no animal específico livre de patógenos facilidade do Departamento de Cirurgia, Oncologia e Gastroenterologia, Universidade de Pádua (Itália). Os animais foram alojados com um ciclo de 12 horas luz /escuro, em temperatura (22 +/- 1 ° C) e humidade (55 +/- 5%) ambiente controlada. Todos os ratos tinham livre acesso à água e uma dieta de manutenção. Todas as gaiolas alojados até 6 animais e aparas de madeira contidos e um tubo de papelão para o enriquecimento ambiental. Procedimentos que envolvem animais e seus cuidados estavam em conformidade com as diretrizes institucionais que estão em conformidade com as leis nacionais e internacionais e políticas (DL 116/92 e circulares de execução subsequentes), e do protocolo experimental (n ° 7/2012) foi aprovado pelo Comitê de Ética local, da Universidade de Pádua (CEASA). Durante

in vivo

experimentos, os animais em todos os grupos experimentais foram examinados diariamente para uma diminuição da atividade física e outros sinais de doença; animais gravemente doentes (perda de peso superior a 15%, letargia, cabelo despenteado, a baixa temperatura) foram sacrificados por overdose de dióxido de carbono.

Winn ensaio.

ensaio Winn foi realizada através da injeção subcutânea SCID com 5 × 10

6 PC3 ou células tumorais PC3-PIP por animal, misturado com qualquer células T-corpo-hPSMA /eGFP RPMI ou (5 × 10

6 /rato; 6 ratos /grupo). O volume do tumor foi calculado de acordo com a seguinte equação: V (mm

3) = (d

2 * D) /2, onde d (mm) e D (mm) são os maiores diâmetros menor tumor e perpendiculares, respectivamente, tal como avaliado por medição paquímetro.

tratamento Loco-regional.

sc

Para avaliar o potencial terapêutico do tratamento loco-regional, SCID foram injectados com 5 × 10

6 células PC3-PIP. Quando os tumores se tornam palpável cerca de quatro dias depois, os ratos foram aleatoriamente designados para o grupo controle (eles foram deixados sem tratamento) ou o grupo experimental (que foram injetados intralesional com células T transduzidas-CAR, 72 horas após a transdução, 6 ratos /grupo). Dois resultados primários foram analisados: o crescimento do tumor foi monitorado ao longo do tempo por medição paquímetro e a sobrevida global foi gravado

O tratamento sistêmico de tumores na próstata subcutâneos

Para avaliar a atividade terapêutica do T sistêmica.. SC -Body administração, os ratinhos IDCG foram injectados com 5 × 10

6 células PC3-PIP e 4 dias mais tarde eles receberam i.v. T-corpo-hPSMA /FLUC (10 × 10

6 /murganho) às 72 horas ou 5-6 semanas pós-transdução (n = 6); animais não tratados serviram como grupo de controlo (n = 6). biodistribuição das células T foi avaliada através da imagem de bioluminescência (BLI) nas mesmas condições, excepto que os ratinhos foram injectados com PC3-Pip ambos ou tumorais PC3 células no flanco direito e esquerdo, respectivamente.

modelo de tumor da próstata disseminada.

Para configurar um modelo de tumor da próstata disseminada, SCID, RAG2

– /- /yc

– /- e NOD /iv SCID foram injectados com números diferentes (variando de 1 × 10

5-5 × 10

6) das células PC3-Pip-Fluc transduzidas (6 ratinhos /grupo). enxerto e crescimento do tumor foram avaliadas pela BLI. Além disso, SCID livre de tumor, RAG2

– /- /yc

– /- e NOD /SCID foram injectados com 20 × 10

6 T-corpo-hPSMA /FLUC, para avaliar o seu destino por iv BLI (6 ratos /grupo).

experimentos imunoterapia adoptiva.

Em experiências de imunoterapia adoptiva, bioluminescente PC3-PIP foram injetados em NOD /SCID e RAG2

– /- /yc

– /- ratos (1 × 10

5 /mouse). Quatro dias mais tarde, os animais foram distribuídos aleatoriamente para o grupo de controlo (que foram deixados sem tratamento) ou o grupo experimental, onde receberam i.v. 20 × 10

6 T-corpo-hPSMA /eGFP por 3 vezes dentro de uma semana (6 ratos /grupo). O crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente por BLI, e a sobrevivência foi registada.

quantitativa bioluminescência

quantitativa BLI é uma tecnologia poderosa que permite a obtenção de imagens múltiplas longitudinalmente e, ao mesmo tempo, para reduzir a animais números. imagens bioluminescência foram coletados com a Lumina II Imaging System IVIS (PerkinElmer). Dez a 15 minutos antes de imagem, os animais foram anestesiados com isoflurano /oxigénio e administrado i.p. com 150 mg /kg de D-luciferina (PerkinElmer) em PBS. Três ratos foram iluminados simultaneamente com os tempos de exposição que variam de 0,5 a 3 minutos. A 12 × 12 cm campo de visão e de baixo, médio ou alto nível binning foram aplicadas para maximizar a sensibilidade e resolução espacial. ventrais imagens foram obtidas para cada animal e quantificado através da região de interesse (ROI). Vivendo Imagem Software (PerkinElmer) foi usado para adquirir e quantificar os conjuntos de dados de imagem de bioluminescência.

avaliação de citometria de fluxo de expressão hPSMA no crescimento de tumores

células tumorais suspensões foram obtidas por digestão enzimática com 270 unidades /ml de DNase, 35 U /ml de hialuronidase, e tampão de 200 U /ml de colagenase (todos de Sigma-Aldrich). Depois de 30 min de incubação a 37 ° C, as células foram passadas através de um filtro de células de 70 mícrons (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). As amostras foram então coradas a 4 ° C com um anti-rato mAb hPSMA [19] seguido de um anticorpo secundário anti-ratinho IgG1 conjugado com PE (BioLegend) e analisadas num FACSCalibur (BD) de fluxo FACSCalibur. Os dados foram avaliados com FlowJo software (TreeStar Inc., Olten, Suíça).

A análise estatística

Kaplan-Meier método do produto-limite foi realizado para estimar as curvas de sobrevivência, e comparação de sobrevivência entre grupos foi realizada pelo teste de log-rank. As análises estatísticas foram realizadas com o pacote estatístico SigmaPlot (versão 12.3).

Resultados

Construção e desenvolvimento de um LV bidireccional eficiente para hPSMA anti-expressão CAR

A CAR sequência foi concebida, que codificava para os seguintes componentes em-quadro de 5 ‘para 3’ extremidades (Fig. 1A): uma sequência de comando, o anticorpo de cadeia única (scFv) do novo anti-hPSMA anticorpo IgGD2B [19], a sequência de etiqueta c-myc, e a molécula co-estimuladora CD28 ligado à sequência CD3ζ. Decidimos explorar este novo anti-PSMA scFv (scFvD2B) para a construção do nosso carro, devido às suas características muito atraente, em particular, a afinidade nanomolar para o alvo que é semelhante ao evidenciado pelo anticorpo J591 inteira [19] . Além disso, o nosso scFvD2B mostra uma elevada especificidade e identifica um epitopo diferente do reconhecido pelo anticorpo J591, tal como avaliado por ensaios de competição realizados com radio-imunoligandos ou anticorpos marcados com biotina ([19] e dados não mostrados).

(A) Anti-hPSMA mapa CAR. CE: domínio extracelular; TM: domínio transmembranar; IC: domínio intracelular. (B) perfil de citometria de fluxo da expressão CAR em células 293 T transfectadas. 293 células T foram transfectadas com o vector pcDNA3.1 sequência CARRO rolamento e analisadas por citometria de fluxo após 24 horas (linha escura). células não transfectadas (parcela cinza) serviu como controle. (C) expressão carro como avaliado por Western blotting às 24 horas (linha 1) e 7 dias (linha 2) coloca-293 a transfecção de células T. Os controlos negativos foram o meio sozinho (linha 3) e de 293 células T não transfectadas (linha 4). Linha 5, marcadores de peso molecular. mapa (D) linear do vector viral recombinante contendo o promotor bidireccional minCMVPGK (22). Em particular, o gene repórter (eGFP ou luciferase) está sob o controlo do promotor minCMV, enquanto o gene CARRO está sob controlo do promotor hPGK. (E) Transdução de células Jurkat com LV CAR anti-hPSMA /eGFP. A co-expressão de c-myc e EGFP nas células de Jurkat transduzidas-LV, conforme avaliado por citometria de fluxo. Dot trama relata os eventos fechados em células viáveis ​​totais; mais de 90% de células de co-expressar tanto c-myc e EGFP. (F) Transdução das células Jurkat com anti-VE CARRO hPSMA /luciferase.

Painel esquerdo

, expressão de c-myc (preto) em células Jurkat a 72 horas após a transdução, avaliadas por citometria de fluxo. plot cinza representa o controle isotipo. As células Jurkat

Painel direito

, Avaliação da actividade da luciferase em LV-transduzidas (2 × 10

5 /poço) pela BLI.

Para avaliar a capacidade da construção para dirigir a expressão de um receptor que se correctamente montado na membrana da célula, a sequência de anti-CAR hPSMA foi clonado no vector pcDNA3.1 e o plasmídeo resultante foi utilizado para a transfecção transiente de 293 células T. Em diferentes pontos de tempo depois disso, a expressão do receptor quimérico foi avaliada por análise de citometria de fluxo e Western blot (Fig. 1B e 1C, respectivamente), utilizando o mAb anti-c-myc. Os resultados revelaram que o carro foi montado correctamente na membrana e tinha o peso molecular esperado (cerca de 60 kDa); expressão de automóveis já era detectável 24 horas após a transfecção, para desaparecer rapidamente os próximos dias, devido à falta de um passo de selecção (Fig. 1C). Posteriormente, a sequência de CAR foi inserido num LV transportando um promotor bidireccional que permitiu a transcrição de um gene repórter (eGFP ou FLUC) a partir do promotor mínimo a montante minCMV, sem afectar a expressão a jusante do carro anti-hPSMA a partir do promotor hPGK eficiente (Fig . 1D). Para avaliar a funcionalidade dos vetores de lentivírus, células Jurkat foram transduzidas com LV CAR hPSMA /eGFP e LV CAR hPSMA /FLUC. CAR acabou por ser altamente expressa já 72 horas após a transdução, como demonstrado pela elevada percentagem de c-myc

+ células detectadas por citometria de fluxo (Fig. 1E e 1F). Em particular, as células que expressam o carro eram mais de 90% quando transduzida com LV CARRO hPSMA /eGFP (Fig. 1E) e mais de 60% quando se utiliza LV CARRO hPSMA /FLUC (Fig. 1F,

esquerdo do painel

). Notavelmente, os vectores de LV bidireccionais apareceu para conduzir a expressão de qualquer das o carro e os genes repórter, com uma eficiência muito equilibrada, tal como demonstrado pela elevada intensidade de sinal de eGFP (Fig. 1E) e a actividade de luciferase em causa (Fig. 1F,

painel direito

).

caracterização fenotípica de populações de células T transduzidas-carro

Para a geração de populações de células T que expressam o CAR anti-hPSMA, um protocolo de expansão rápida foi desenvolvido . O tempo de infecção óptima foi criada após 48 horas de activação OKT3, uma vez que neste momento vez que obteve o maior percentual de células T que expressam CAR (Fig. 2A,

esquerdo do painel

), e um fenótipo menos diferenciado , tal como avaliado pela expressão elevada de CD27, CD28 e CD62L marcadores (Fig. 2A,

painel central). Posteriormente, o protocolo de expansão envolvidos reestimula�o semanalmente com células PC3-PIP que permitiu uma proliferação rápida e sustentada de ambos T-corpo-hPSMA /eGFP e T-corpo-hPSMA /populações FLUC (Fig. 2A,

painel direito

).

(A) Criação de protocolo de transdução e cinética de crescimento.

Painel esquerdo

, PBMC foram activadas com OKT3 no tempo 0 e traduzidas concomitantemente (TD0), ou depois de 48 h (Td2) ou (TD3) horas de 72 h. Análise de citometria de fluxo de expressão tag c-myc foi realizada 72 horas após a infecção.

Painel Central

relata a expressão de CD27, CD28 e CD62L nas três condições diferentes de activação /infecção relatados na

painel

esquerda.

Painel direito,

Expansão da T-corpo-hPSMA /FLUC e T-corpo-hPSMA /eGFP transduzidas após 48 horas de ativação em resposta a re-estimulação semanal com células PC3-PIP. Não transduzidas PBMC foram utilizados como controle. (B) Fenótipo e expressão CAR em células T transduzidas após estimulação.

Painel esquerdo

, a expressão de marcadores de superfície em t-corpo anti-hPSMA /FLUC em diferentes pontos de tempo (3, 11 e 18 dias) após a transdução, tal como avaliado por citometria de fluxo. Os dados são representativos de 3 expericias independentes. sobreposição de resultados foram obtidos em T-corpo-anti-hPSMA /eGFP.

Painel direito,

percentagem de c-myc

+ células em populações de células T LV CAR hPSMA /FLUC e LV CAR hPSMA /eGFP transduzidas em diferentes momentos pós transdução. A Figura mostra a média +/- DP de pelo menos três experiências independentes. (C) Cinética de subconjuntos CD4 e CD8 em populações de células T transduzidas. Expressão de marcadores CD4 e CD8 em c-myc

+ – fechado T-corpo-hPSMA /eGFP

(painel esquerdo) Comprar e T-corpo-hPSMA /FLUC (

painel direito)

populações em diferentes pontos de tempo de pós transdução, tal como avaliado por citometria de fluxo. Os dados são de uma experiência representativa em cada três que produziu resultados semelhantes.

Para melhor definir o estado de diferenciação de linfócitos T-transduzidas carro no período após a infecção durante a re-estimulações antigênicas, expressão de diferentes marcadores de superfície (CD62L, CD27, CD28, CCR7, CD57) foi avaliada por análise de citometria de fluxo. Setenta e duas horas após a transdução, o perfil emergente foi essencialmente de células no início T efectoras, como demonstrado pela elevada expressão de CD62L, CD27 e CD28, a presença de células positivas CCR7 e a baixa expressão de CD57 (Fig. 2B,

esquerdo do painel

). Após re-estimulações com o antigénio, as células T adquirido um fenótipo de memória intermédia com o efector para baixo-modulação progressiva de CD62L, CD28 e CCR7 e um ligeiro aumento na expressão de CD57 (Fig. 2B,

painel da esquerda

). Curiosamente, enquanto que o encontro subsequente com o antigénio levou à expansão da população que expressa CARRO (Fig. 2B,

painel direito), uma dicotomia pode ser observada entre os subconjuntos de células T em expansão. De fato, enquanto expressão carro foi quase igual dentro do CD4

+ e CD8

+ T populações de células imediatamente após a infecção, a re-estimulação antigênica determinada a acumulação progressiva do CD8

+ única subconjunto de células T, que quase completamente superou CD4

+ T células por mês um após transdução (Fig. 2C).

caracterização funcional de células T que expressam carro

expressão de carros fornecidos a população transduzidas com a capacidade de reconhecer hPSMA o antigénio na superfície de linhas de células de tumor da próstata, e para mediar uma alta citotoxicidade específica e (Fig. 3A). Na verdade, tanto o T-corpo-hPSMA /FLUC e populações T-corpo-hPSMA /eGFP lise das células PC3 hPSMA-transfectadas, poupando a contrapartida antígeno-negativo; mais importante, eles também eram capazes de reconhecer as células alvo LNCaP que naturalmente abrigam o antigénio hPSMA. A citotoxicidade foi já evidente, embora em níveis baixos, 3 dias após a transdução e aumento nos níveis máximos pouco depois de uma única ronda de re-estimulação de antigénio, de permanecer constante daí em diante até 2 meses após a infecção. Para além de exercer uma actividade citotóxica relevante, as células T transduzidas com viaturas em diferentes estágios de diferenciação também produzidos níveis elevados de IFN-γ em resposta a células hPSMA-expressam tumores (Fig. 3B e 3C), mas não contra as células de controlo negativo hPSMA. Como controlo negativo, as células T não infectadas não produzem IFN-γ quando co-cultivadas com células PC3 manipuladas para expressar o antigénio de superfície hPSMA.

(a) A actividade lítica de t-corpo-hPSMA /eGFP e T -Body-hPSMA /FLUC. A citotoxicidade foi analisada a 3, 11 e 60 dias pós-transdução; PC3, PC3 e LNCaP-Pip células foram utilizadas como células alvo. Não transduzidas PBMC serviu como controle negativo. No canto superior esquerdo de cada painel a percentagem de c-myc

+ células T são relatados. A Figura mostra a média +/- DP de 4 experiências independentes. (B) a secreção de IFN-γ após estimulação com antigénio. a produção de IFN-γ foi analisada em diferentes pontos de tempo após a transdução de PBMC por estimular t-corpo-hPSMA /FLUC com PC3-PIP hPSMA

+ ou PC3 hPSMA

– linhas celulares de cancro. T-corpos não estimuladas ou tratadas com PMA /ionomicina representados os controlos negativos e positivos, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos com a T-corpo-hPSMA /eGFP. (C) a expressão de c-myc em T-corpo-hPSMA /populações FLUC testados para a produção de IFN-γ.

Análise da eficácia terapêutica de hPSMA anti-administração T-organismo contra tumores de próstata locais

In vivo

eficácia terapêutica de células T transduzidas-carro em diferentes estágios de diferenciação (72 horas ou 5 semanas pós-transdução) foi inicialmente avaliada utilizando um ensaio Winn (Fig. 4A). Em particular, quando as células tumorais PC3-Pip foram co-injectados com t-corpo-hPSMA /eGFP foi observado nenhum crescimento do tumor (Fig. 4A,

esquerdo do painel

), independentemente do andar de diferenciação de t-corpos . Por outro lado, a transferência de células T não teve impacto significativamente o crescimento de células tumorais negativas hPSMA-PC3 (Fig. 4A,

painel direito).

(A) Ensaio de Winn. PC3-PIP (

painel esquerdo

) e PC3 (

Painel direito

) células tumorais foram inoculadas s.c. em ratinhos SCID, isoladamente ou em mistura 01:01 com o t-corpo-hPSMA /eGFP em flancos opostos do mesmo animal. O crescimento do tumor foi monitorizado ao longo do tempo por medição de compasso de calibre.