Abstract

pâncreas adenocarcinomas ductal são desmoplastic e hipóxica, ambos os quais estão associados com mau prognóstico. pró-fármacos activados por hipoxia (HAPs) são activados especificamente em ambientes hipóxicos para libertar efectores citotóxicos ou citostáticos. TH-302 é um HAP que está actualmente a ser avaliado num ensaio clínico de fase III em câncer pancreático. Usando modelos animais, que mostram que a hipoxia de tumor pode ser agravado usando um vasodilatador, hidralazina, melhorando a eficácia TH-302. Hydralazine reduz o fluxo sanguíneo do tumor através do fenómeno “roubar”, em que atonal vasculatura do tumor imaturo não consegue dilatar em coordenação com vasculatura normal. Mostramos que MIA PaCa-2 tumores exibem um efeito “roubar” em resposta a hidralazina, resultando em diminuição do fluxo de sangue do tumor e subsequente redução do pH do tumor. O efeito não é observado em tumores SU.86.86 com a vasculatura do tumor maduro, tal como medida por coloração imuno-histoquímica e CD31 actina de músculo liso (SMA). A terapia de combinação de hidralazina e TH-302 resultou numa redução da MIA PaCa-2 de crescimento do volume tumoral após 18 dias de tratamento. Estes estudos suportam um mecanismo de combinação de acção para a TH-302 com um vasodilatador que aumenta transitoriamente o hipoxia tumor

Citation:. Bailey KM, Cornnell HH, Ibrahim Hashim-A, Wojtkowiak JW, Hart CP, Zhang X, et ai. (2014) Avaliação do Fenômeno “roubar” sobre a eficácia da hipóxia ativado Pr�f�maco TH-302 em cancro do pâncreas. PLoS ONE 9 (12): e113586. doi: 10.1371 /journal.pone.0113586

editor: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de Junho, 2014; Aceito: 26 de outubro de 2014; Publicação: 22 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Bailey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios R01CA125627-02; R01CA077575-10; P30CA076292-16 (Robert J. Gillies) e P30CA023074-35 (Amanda F. Baker). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e os autores deste manuscrito ter a seguinte competindo interesses: Charles P. Hart é um empregado de Produtos farmacêuticos Threshold. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

adenocarcinomas do ducto pancreático (PDAC) pacientes têm prognóstico extremamente pobres, com uma taxa de sobrevida em 5 anos de, aproximadamente, 6%. Sobrevivência continua a ser baixa devido tanto à falta de detecção precoce do PDAC localizada e ineficácia das quimioterapias tradicionais para controlar a progressão PDAC. Estas baixas taxas de sobrevivência demonstram a necessidade de desenvolver novas estratégias de tratamento. Patologicamente, tumores PDAC são extremamente heterogénea e contém um compartimento estromal desmoplásica dinâmica, ambos os quais contribuem para a progressão do tumor e quimioterapia resistência [1], [2]. Além de ser uma barreira mecânica para a penetração da droga, estroma desmoplástico contribui para hipoxia tumoral; uma característica fisiológica comum de tumores PDAC que também está associada com a resistência à quimioterapia e à radioterapia [3] – [5]. resistência à quimioterapia associada a hipoxia pode ser mediada por: uma falta de administração de fármaco no tumor, devido à fraca perfusão [4]; resistência induzida por hipoxia de apoptose [6]; e diminuição da proliferação celular das fracções de células hipóxicas [7]. Além disso, os tecidos tumorais hipóxicas foram mostrados para ter aumentado o potencial metastático [8] e uma maioria dos tumores PDAC presente como doença de fase final metastático [9].

Recentemente, os esforços para alvejar terapeuticamente os compartimentos hipóxicas de tumores foram realizados através da utilização de pró-drogas activadas por hipoxia (HAPs). HAPs são relativamente inertes em tecidos com oxigenação normal (pO

2), mas são reduzidos pela escolha Oxirredutases um elétron em condições de hipóxia para liberar ogivas citotóxicos. A HAP primeira geração, tirapazamina, mostrou potencial benefício terapêutico em combinação com terapias convencionais [10] – [12], e demonstraram um sucesso moderado na Fase I – II de ensaios clínicos [13], [14]. penetração incompleta do tumor e uma meia-vida curta têm estimulado esforços para conceber análogos melhorados tirapazamina com uma melhor solubilidade, a citotoxicidade, a selectividade e a penetração nos tecidos [15] – [17]. Um segundo HAP geração, TH-302, é montado sobre um gatilho sensível à hipoxia do 2-nitroimidazole e é selectivamente activado sob extrema hipoxia ( 0,5% O

2), libertando bromo-isofosforamida, um efector citotóxico ADN de reticulação [18]. TH-302 é altamente eficaz em modelos de tumores xenoenxerto pré-clínicos [19], e está sendo investigado clinicamente por vários cancros, incluindo PDAC. A fase I /II julgamento mostrou que TH-302, em combinação com gemcitabina, o aumento da sobrevida livre de progressão por 2 meses para os pacientes PDAC [20], e esta combinação já avançou para a fase III (NCT01746979, EMD Serono).

pré-clínica TH-302

in vitro

e

in vitro

estudos de monoterapia identificadas linhas de cancro do pâncreas sensíveis e resistentes muito parecida com a resposta clínica em pacientes PDAC [21], [22]. Como hipoxia tumor é necessária para a actividade TH-302, e porque TH-302 exibe um efeito espectador, matando as células em tecidos normóxicas adjacentes [22], a hipótese de que TH-302 eficácia pode ser melhorada através do aumento transiente da fracção hipóxica em tumores sólidos . Em modelos in silico e evidências experimentais mostram que a abordagem mais eficaz para diminuir tumor pO

2 é aumentar a respiração celular [23]. Este foi previamente demonstrada na linha de células do carcinoma do cólon, RKO, em que a inibição farmacológica de HIF-1α Equinomicina com o aumento do consumo de oxigénio, diminuição do tumor pO

2 e aumentou a actividade de HAP, a tirapazamina [24]. Este tratamento resultou num ambiente hipóxico cronicamente que poderia levar a uma maior adaptação hipóxica das células tumorais e os efeitos colaterais de HAP. Em contraste, nós propomos que exacerbação transitória e aguda de hipoxia, em combinação com TH-302, seria mais eficaz com menos efeitos colaterais. Trabalhos anteriores também observou que o piruvato exógena aumenta a fração hipóxica em carcinoma de células escamosas tumores (SCC) [25] através de um aumento transitório no consumo de oxigênio [26]. Observamos, também, que o piruvato exógena aumento da eficácia do TH-302 em SCC pré-clínica e modelos PDAC [26], [27]. Para explorar métodos farmacológicos alternativos para exacerbar transitoriamente hipóxia e, consequentemente, melhorar as propriedades anti-tumorais de TH-302, que aqui investigar o fenômeno “roubar”. O fenômeno “roubar” ocorre quando vasodilatadores, como hidralazina, causar vasos sanguíneos saudáveis ​​para dilatar levando à diminuição da pressão arterial sistêmica. Tumor vasculatura é muitas vezes imaturo e atonal, sem capacidade para contrair ou dilatar. Assim, durante a vasodilatação sistémica, há uma redução na pressão arterial fisiológica que não pode ser compensada por o microambiente do tumor e vasculatura. A diferença de pressão resultante cria uma diminuição transitória na perfusão tumoral, afectando a fisiologia do tumor e resultando em aumento da hipoxia e acidose [28] – [33]

Neste estudo, a hipótese de que a hidralazina poderia ser utilizado de forma aguda para reduzir a perfusão. e aumentar a hipoxia dentro do microambiente do tumor, aumentando assim a eficácia de TH-302. Nós escolhemos três modelos humanos pancreáticas linha de células de câncer de xenotransplante, que havia sido mostrado previamente para ser variavelmente sensível a TH-302 monoterapia [18], [21], [22]. Tumor pH foi medido antes e após a administração de hidralazina como um biomarcador para a perfusão reduzida. As alterações no fluxo sanguíneo após o tratamento hidralazina foram quantitativamente medida utilizando ultra-som Doppler para confirmar uma redução na perfusão do tumor e conceber regimes de dosagem para maximizar o efeito do fenómeno “roubar”. A terapia de combinação de hidralazina e TH-302 foi avaliado com a hipótese de que o tratamento hidralazina aumentaria TH-302 eficácia em “roubar” linhas sensível a. Os resultados indicaram que a hidralazina melhorada TH-302 eficácia, embora o tamanho do efeito foi pequeno e foi apenas moderadamente significativa em tumores (MIA PaCa-2), que apresentam sensibilidade intermediária à TH-302 como uma monoterapia.

Materiais e Métodos

Cultura de células

SU.86.86 e células Hs766T foram obtidos a partir Pharmaceuticals limiar (South San Francisco, CA) e células MIA PaCa-2 foram obtidos a partir de coleção Tipo celular americana (ATCC, Manassas, VA). As células foram mantidas em conformidade com as diretrizes ATCC. As células foram incubadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS (Hs766T e SU.86.86) ou DMEM suplementado com FBS a 10% (MIA PaCa-2), e foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2. Mycoplasma e linha de células de autenticidade foram realizados (cariótipo) testes.

Os estudos em animais

Todos os procedimentos estavam em conformidade com o Guia de Cuidados e Uso de laboratório de Recursos Animais (1996), do Conselho Nacional de Pesquisa, e aprovado pelo Institutional animal Care e do Comitê Use, University of South Florida sob o protocolo aprovado R4033. ratinhos imunocomprometidos foram alojados em uma instalação limpa com condições especiais que incluem HEPA filtrada sistemas de gaiolas ventiladas, roupas de cama autoclavado, habitação autoclavado, água esterilizada, irradiado comida e procedimentos especiais mudando gaiola. Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por CO

2 inalação, se tumores contribuiu para um ganho de 20% em peso corporal, em comparação com os controlos, ao mesmo ponto de tempo, ou ratos experimentaram a 10% de perda do peso do corpo, um tumor medido maior a 2000 mm

3 ou camundongos mostram sinais de doença disseminada, como metástases pulmonares indicado pela respiração difícil. Todos os animais foram alojados em qualquer Centro de Bioterismo USF dentro Moffitt Cancer Center ou dentro das instalações Cancer Center Arizona

camundongos fêmeas SCID-bege (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) foram inoculados com 5 -. 10 × 10

6 células em 1: 1 de Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ): PBS solução por via subcutânea no flanco direito. O crescimento do tumor foi monitorizado com calibradores electrónicos quinzenalmente ao longo da duração das experiências. Os volumes tumorais foram calculados usando: volume = (

l

×

w

2) /2, onde

l

= comprimento mais longo e

w

= comprimento mais curto. Ortotópico modelo de tumor do pâncreas: ratinhos macho nu (n = 3) foram injectados com 1 x 10

6/20 ul de células MIA PaCa-2 em PBS. Os ratinhos foram anestesiados com 3% de isoflurano e mantidos com 1,5% de isoflurano durante todo o procedimento. Após incisão lateral, o baço e pâncreas distais foram mobilizados e células directamente injectado no pâncreas. A parede interna abdominal foi suturada e a incisão na pele exterior foi fechada com grampos. A analgesia foi administrada ao local cirúrgico para o alívio da dor. Os ratinhos foram monitorizados diariamente até que os grampos foram retirados, aproximadamente, uma semana. O volume do tumor foi monitorado semanalmente por ultra-som.

pH Eletrodo

medições de pH foram obtidos utilizando um medidor de FE20 Five Easy pH (Mettler-Toledo, Columbus, OH). Todos os animais foram sedados com isoflurano (3,5%), e manteve-se sob anestesia (1,5-3,5% de isoflurano) para a duração da experiência. Um eléctrodo de referência e o pH (MI-401F e MI-408B, respectivamente, Microeletrodos Inc., Bedford, NH) foram usados ​​para medir o pH, inserindo primeiro o eléctrodo de referência (OD 1 mm), sob a pele do rato perto do tumor (flanco). foi, em seguida, inserido o eléctrodo de pH (OD 0,8 mm) até 1,3 cm para o centro de cada tumor subcutâneo. Eletrodos foram calibrados antes e após cada conjunto de medições. Foram feitas duas medidas em cada ponto de tempo e em média. Após as medições de pH inicial, os animais foram administrados 100 mL de injecção intraperitoneal (IP) de 10 mg /kg de hidralazina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). O pH foi medido a cada 30 minutos até três horas após a injecção ip, e foi tomado cuidado para medir o pH em, aproximadamente, no mesmo local no tumor em cada ponto de tempo. Depois da medição do pH final, os animais foram sacrificados e os tumores foram colhidos para análise histológica.

Os dados foram processados ​​por tomando a média dos dois valores de pH medidos em cada ponto de tempo. A mudança no pH, ou delta (Δ (

t

), onde

t

é o tempo após a injeção de hidralazina ou soro fisiológico, em minutos) foi medido como a diferença entre o primeiro ponto de tempo pH e cada ponto subsequente pH tempo. Para cada tipo de tumor, o delta média (

Média

Δ) é o delta média para todos os animais desse tipo de tumor:

Onde

t

é o tempo, que varia de 30 a 180 minutos após a injeção,

a

é o animal,

n

t

é os pontos temporais número medido, e

n

a

é o número de animais com que tipo de tumor. A alteração máxima no pH em qualquer momento após a injecção foi identificada para cada animal individual. A média máxima através de cada tipo de tumor foi calculado, e também foi identificado a maior mudança para qualquer um dos animais em cada grupo. O número de animais medido variou por tipo de tumor: Hs766T, n = 3; MIA PaCa-2 n = 4; e SU.86.86, n = 7.

OxyLite

níveis de oxigenação do tumor foram monitorizados usando Oxylab (Oxford Optronics, Oxford, Reino Unido) sondas de fibra óptica triplo parâmetro de E-série que foram inseridos todos os tumores. Estes microprobes hipoxia pré-calibrado são baseados em têmpera luminescência e medição de pO2 é baseado no tempo de vida extinguiu-oxigénio de corante luminescente. Sinais da sonda Oxylab foram adquiridos utilizando os sistemas de monitoramento Oxylab pO2 E e Oxylab FDL conectados a um PC. sinais de dados de saída a partir destes monitores foram convertidos em valores pO2 (mmHg) e gravado em tempo real usando um sistema de aquisição de dados multi-canal (PowerLab 8SP, ADInstruments, Austrália) que funciona sob gráfico para Windows (Ver.5.02, ADInstruments, Austrália) . ratos anestesiados (isoflurano, 100% O

2) foram contidos em uma plataforma de imobilização personalizada para impedir o movimento e adaptado com uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal. precauções adicionais foram tomadas para impedir qualquer movimento das sondas de hipoxia, bem como limitar a interferência de fontes de luz externas eliminando assim artefato. Microprobes (OD ~450 uM) foram inseridas no interior do tumor e fixa em posição através de métodos estereotáxicos. Entrada em cada um dos tumores foi feita com uma agulha de seringa de 19 g e microprobes foram alimentados para dentro do tumor a ~ 3 mm da superfície do tumor e a agulha foi retraída. Microprobes foram cuidadosamente marcado com gradações, a fim de alcançar a mesma profundidade em todos os tumores. os níveis de pO2 de tumor foram monitorizados até que foi observada uma linha de base estável. medições em tempo real foram tomadas durante 10 minutos na linha de base e continuamente durante 60 minutos após uma injecção de 100 uL por via intraperitoneal (IP) de 10 mg /kg de hidralazina. níveis de oxigenação do tumor pré e pós-injecções hidralazina foram comparados. O número de animais medidos: MIA PaCa-2 n = 4.

Ecografia

A ultra-sonografia foi realizada no Vevo2100 com o transdutor MS550D 22-55 MHz (VisualSonics, Toronto, Ontário, Canadá). Ratinhos Portadores de MIA PaCa-2 tumores (n = 4) foram sedados (como descrito acima) através da duração das imagens. imagens Doppler a cores foram tiradas para determinar a localização de um grande vaso sanguíneo dentro do tumor. Uma vez que um suficientemente grande vaso sanguíneo foi localizado, uma onda pulsátil (DP) Doppler foi levado para a quantificação do fluxo. O animal recebeu uma injecção de 100 uL de 10 mg /kg de hidralazina, e o fluxo no mesmo vaso sanguíneo foi medida a cada 5 minutos durante 30 minutos. Para Mia PaCa-2 tumores ortotópicos, o fluxo sanguíneo foi medido durante 180 minutos.

Droga Regimes e Crescimento Tumor Kinetics Monitoring

Os animais foram par correspondente em volume tumoral (conforme calculado pelo calipers eletrônicos), quando tumores atingiram aproximadamente 200 mm

3. Os animais foram separados em quatro grupos de tratamento de droga (N = 9 animais por grupo de tratamento para Hs766T e SU.86.86, números listados para MIA PaCa-2): I) TH-302 (n = 9), ii), hidralazina (n = 7 ), iii) TH-302 + hidralazina (n = 7) e iv) solução salina (controlo, n = 10). Os tratamentos foram administrados como injecções ip para animais anestesiados-un. As doses foram de 50 mg /kg de TH-302 em 200 uL de solução salina por cada animal nos grupos I e III, 10 mg /kg de hidralazina em 100 ul de solução salina por animal [29] nos grupos II e III, e 200 uL de solução salina para IV grupo . Grupo III recebeu hidralazina 30 minutos antes da administração de TH-302. Durante a administração simultânea de hidralazina e TH-302, hidralazina foi injectado ip imediatamente antes TH-302. Todos os planos de tratamento foram administrados qd x 5 durante duas semanas simultâneas. Os volumes dos tumores foram medidos duas vezes por semana utilizando calibradores electrónicos para a duração do experimento.

Processamento de tecido e imuno-histoquímica

Na conclusão do

In vivo

estudos, animais foram eutanizados e os tumores foram excisados. Os tumores foram fixados em formalina e embebidos em parafina para processamento adicional. A coloração para hematoxilina e eosina (H E) foi realizada em 4 fatias uM. Imuno-histoquímica (IHQ) coloração foi concluída no tecido Núcleo Moffitt usando Res IHC Omni0UltraMap HRP XT Descoberta XT Coloração Module (Ventana Medical Systems Inc.). análise IHC foi concluída para CD31 (Abcam ab28364) e do músculo liso actina [SMA (Abcam ab32575)]. As lâminas foram digitalizadas com o Aperio ScanScope XT (Vista, CA), e análise de pixel positivo foi realizada utilizando software Aperio Genie v1. Em resumo, o algoritmo de medida a intensidade da coloração em toda a área do tumor e classificaram o número de pixels que contêm o tecido manchado. Os resultados são apresentados como percentagem de positividade, que foi calculado como o número de pixels positivos dividido pelo número total de pixels multiplicado por 100.

Análise de Dados

Os dados foram analisados ​​utilizando GraphPad Prism V6. 02 (GraphPad Software Inc.). As estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Student não pareado 2 caudas com correção de Welch. Os dados são apresentados como média ± SEM.

Ética Declaração

Todos os procedimentos estavam em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso of Laboratory Animal Resources (1996), National Research Council, e aprovado pela Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal, University of South Florida sob o protocolo aprovado R4033. ratinhos imunocomprometidos foram alojados em uma instalação limpa com condições especiais que incluem HEPA filtrada sistemas de gaiolas ventiladas, roupas de cama autoclavado, habitação autoclavado, água esterilizada, irradiado comida e procedimentos especiais mudando gaiola. Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por CO

2 inalação, se tumores contribuiu para um ganho de 20% em peso corporal, em comparação com os controlos, ao mesmo ponto de tempo, ou ratos experimentaram a 10% de perda do peso do corpo, um tumor medido maior a 2000 mm

3 ou camundongos mostram sinais de doença disseminada, como metástases pulmonares indicado pela difícil respiração ofegante.

resultados

estudos anteriores demonstraram uma resposta variável de três linhas celulares PDAC , Hs766T, MIA PaCa-2 e SU.86.86, a TH-302 monoterapia tanto

in vitro

e

in vivo

. O tratamento de células em cultura sob condições anóxicas com TH-302 mostram que células MIA PaCa-2 são as mais sensíveis (IC

50 = 2,1 ± 0,7 mmol /L); SU.86.86 respondendo moderadamente (IC

50 = 12 ± 1,2 mmol /L); e Hs766T os menos sensíveis (IC

50 = 60 ± 7,5 mmol /L) [21]. Curiosamente

in vivo

, modelos de xenotransplante tumoral utilizando as mesmas linhas celulares apresentam respostas diferentes para TH-302 monoterapia. Hs766T respondeu a mais favorável para TH-302 tratamento [22], com uma inibição completa do crescimento do tumor, enquanto MIA PaCa-2 tumores eram moderadamente responsivo [34] e SU.86.86 tumores resistentes a TH-302 monoterapia [33]. A resposta diferencial de células PDAC

in vitro

e

in vivo

enfatiza a importância da fracção hipóxica dentro de um tumor para máxima TH-302 eficácia

in vivo

, como SU .86.86 tumores são altamente vascularizada e bem oxigenada, enquanto que os tumores Hs766T têm grandes fracções hipóxicas [19] e uma mutação no gene FANCG de reparação de ADN dependente de homologia (HDR) o que os torna mais sensível para o efector Br-IPM [35].

Hydralazine e os “roubar” efeito

Uma vez que o tratamento hidralazina anteriormente foi mostrado para reduzir o fluxo sanguíneo do tumor

in vivo

[28], a hipótese de que a hidralazina pode ser usado para aumentar transitoriamente a fracção hipóxica em tumores e aumentar a eficácia TH-302. Hidralazina também tem sido demonstrado que o aumento da acidose tumor [29], que pode ser um método eficaz para identificar tumores que exibem um efeito “roubar” que seria mais responsivos à terapia de combinação. Para testar a hipótese de, ratinhos portadores SU.86.86 subcutânea, anestesiaram-se os tumores MIA PaCa-2 ou Hs766T e pH do tumor foi medido utilizando um microeléctrodo de pH. Para medir as alterações de pH resultantes da mudança do fluxo de sangue, os ratos foram administrados 10 mg /kg de hidralazina via intraperitoneal (ip). as medições de pH dos tumores foram obtidos a cada 30 minutos após o tratamento hidralazina durante três horas. Nossa hipótese é que os tumores que exibem o efeito de “roubar” vai experimentar a acidificação do tumor após o tratamento hidralazina. Os tumores sensíveis Hs766T TH-302 (n = 3) não exibiu alteração no pH médio após o tratamento com hidralazina (Fig. 1). TH-302 SU.86.86 tumores resistentes (n = 7), no entanto, experimentar um pequeno aumento paradoxal no pH (+0.05 unidades de pH) a seguir ao tratamento com hidralazina (Fig. 1). MIA PACA-2 tumores (n = 4), que são moderadamente responsivo a TH-302, exibiram consistentemente um efeito real “roubar” a seguir ao tratamento hidralazina, experimentando uma diminuição significativa do pH (- 0,12 unidades de pH) em relação ao (SU.86.86

p Art 0,007) e Hs766T (

p

. 0,05) (figura 1). Embora heterogeneidade existente entre as amostras de tumor, cada uma das amostras testadas responderam de forma semelhante aos outros tumores nos seus grupos, tal como evidenciado pela observação da alteração máxima único animal, a média da resposta máxima de cada animal durante a experiência e a alteração média do pH para cada animais para cada ponto de tempo medido (Fig. 1). Estes resultados indicam que a administração de hidralazina levou à diminuição da perfusão em MIA PaCa-2 tumores, mas não afectar a perfusão tanto em tumores ou Hs766T SU.86.86.

Os ratinhos portadores SU.86.86 subcutânea (n = 7), Hs766T (n = 3) ou MIA PaCa-2 (n = 4) foram anestesiados tumores do flanco e medições de pH de tumor foram obtidas. Um eléctrodo de referência foi inserido sob a pele do ratinho num sítio não-tumor, enquanto o eléctrodo de pH foi introduzido até 1,3 cm para o centro de cada tumor. Foram feitas duas medidas em cada ponto de tempo e em média. Após as medições de pH inicial, os ratos foram administrados 10 mg /kg ip hidralazina através de injecção. pH do tumor foi medido durante 3 horas após o tratamento. Os dados relatados representa a mudança média máxima em cada coorte, a variação média pH para cada coorte e da mudança de pH máximo único animal para cada coorte. Os dados são apresentados como média alteração no pH ± SEM. *

P Art 0,05; **

P

. 0,007

Para explorar ainda mais os efeitos da hidralazina em tumores que exibiram o efeito “roubar”, foi utilizado ultra-som Doppler para medir o fluxo sanguíneo do tumor seguinte tratamento hidralazina em MIA PaCa-2 tumores. Antes do tratamento hidralazina, imagens Doppler de cor foram obtidas através de MIA PaCa-2 tumores (n = 4) para identificar os principais vasculatura do tumor (Fig. 2A, painel da esquerda). Usando um Doppler de onda pulsátil (DP), o fluxo de sangue através de vasos do tumor foi medido ao longo de 30 minutos após a administração ip hidralazina (Fig. 2A, painel da direita). Observou-se uma redução no fluxo de sangue no prazo de 15 minutos após a injecção hidralazina (Fig. 2A, painel da direita). A quantificação destes dados confirmaram uma redução no fluxo de sangue do tumor a partir de 15 minutos após a injecção hidralazina com um declínio continuou ao longo de 30 minutos (Fig. 2B). O efeito de hidralazina sobre o fluxo sanguíneo pode persistir mais do que 30 minutos. Para explorar esta possibilidade, o fluxo sanguíneo em PaCa-2 tumores pancreáticos ortotópicos Mia (N = 3), um modelo de tumor que é mais fisiologicamente relevante, foram monitorizadas por ultra-som de Doppler durante 180 minutos. O fluxo sanguíneo reduzido para níveis mínimos por 30 minutos, em apoio das observações subcutâneas de tumor, mas nos tumores ortotópicos, o fluxo sanguíneo permaneceu a este nível durante 90 minutos com recuperação ocorrendo entre 90 e 120 minutos. Devido às semelhanças de fluxo de sangue entre subcutâneos e ortotópicos Mia PaCa-2 tumores, estávamos confiantes de que monitorar a oxigenação do tumor (70 minutos), utilizando eletrodos de oxigênio nos tumores subcutâneos (N = 5) seria uma representação precisa. Semelhante aos dados do eletrodo pH, níveis de oxigênio do tumor diminuiu dentro de 5 minutos após hidralazina, mas não retornou à linha de base dentro do prazo deste estudo. A heterogeneidade foi observado como sendo o grau de diminuição de oxigénio variou (Fig. 2D).

Os ratinhos portadores MIA PaCa-2 tumores foram analisadas por ultra-som de Doppler para quantificar o fluxo de sangue do tumor. A)

Painel de Esquerda:

Os tumores foram digitalizados usando Doppler colorido para identificar as principais vasos do tumor antes do tratamento. O vermelho representa o fluxo de sangue através de vasos do tumor. Branca marcas de seta vasculatura escolhido para análise.

Painel direito:

Após a administração de hidralazina, onda pulsátil (DP) Doppler foi usada a cada 5 minutos por 30 minutos para quantificar o fluxo de sangue através de vasos do tumor. diagramas representativos que mostram uma diminuição do fluxo sanguíneo do tumor após o tratamento hidralazina. B) Quantificação de alterações de fluxo de sangue do tumor em MIA PaCa-2 tumores subcutâneos (n = 4) após o tratamento a hidralazina. Os dados são apresentados como a velocidade média (mm /s) ± SEM. C) Quantificação de alterações de fluxo de sangue do tumor em PaCa-2 tumores pancreáticos ortotópicos Mia (n = 3) após o tratamento a hidralazina. Os dados são apresentados como a velocidade média (mm /s) ± SEM. D) Tumor oxigenação foi medida pré e pós-hidralazina usando OxyLite (oxigénio) eléctrodos em agulha subcutâneo na Mia PaCa-2 tumores (n = 5). As medições são recolhidas ao longo do tempo, num único local no interior do tumor. detalhes experimentais completos podem ser encontrados na secção Métodos. Os dados são apresentados como pO2 (mmHg). A seta em t = 10 minutos designa I.P. injeção de hidralazina.

A avaliação histológica de PDAC vasculatura

amostras tumorais de cada linha celular foram analisados ​​histologicamente para caracterizar a vasculatura. CD31 e actina de músculo liso (SMA) são dois tumor comum vasculatura imuno-histoquímica (IHQ) marcadores que identificam a presença (CD31), e da maturidade e do tom (SMA) da vasculatura. Os tumores com vasculatura significativa que são tonal não seria de esperar que exibem o fenómeno “roubar”, tal como a vasculatura tumoral que dilatam em coordenação com os efeitos sistémicos do tratamento com hidralazina. Usando a análise de pixel positivo, nós quantificamos a percentagem de Hs766T, SU.86.86 e Mia PaCa-2 tumores que continha CD31 e coloração SMA. Consistente com os resultados anteriores, SU.86.86 tumores tinham significativamente mais CD31 (

P

0,05) (Fig. 3A-B) coloração do que qualquer um ou Hs766T MIA PaCa-2, e significativamente mais SMA (

P

. 0,005) do que MIA PaCa-2 amostras do tumor (Fig 3A, C). Estes dados indicam que os tumores SU.86.86 são bem vascularizados com vasos maduros que seriam esperados para dilatar em resposta ao tratamento hidralazina. tumores MIA PACA-2 e Hs766T tinham quantidades semelhantes de coloração de CD31 (Fig. 3A-B). MIA PaCa-2 tumores tinham a menor quantidade de coloração SMA entre os três tumores testados (Fig. 3A, C). Estes dados indicam que MIA PaCa-2 vasculatura é imaturo e atonal. Como MIA PaCa-2 tumores exibida diminuição do fluxo de tumor no sangue (Fig. 2) e uma subsequente diminuição do pH do tumor (Fig. 1), concluímos que MIA PACA-2 tumores exibem o efeito de “roubar” devido à vascularização do tumor imaturo.

Hs766T, MIA PACA-2 e SU.86.86 tumores foram fixados e embebidos em parafina, em preparação para a coloração IHC para marcadores vasculatura tumoral, CD31 e SMA. A) Imagens representativas de tumores coradas com CD31 e SMA. As barras de escala representam 100 um. análise positiva de pixel de B) CD31 e C) Coloração SMA em toda a área de um tumor. Os dados são apresentados como% de positividade [(pixels positivos /total de pixels) × 100] ± SEM. *

P Art 0,05; **

P

. 0,005

Hydralazine melhora TH-302 atividade in vivo

Para testar TH-302 monoterapia e terapia de combinação com hidralazina para cada célula a linha de xenoenxerto, os ratinhos foram implantados com subcutânea Hs766T, SU.86.86 ou MIA PaCa-2 tumores do flanco, e em quatro grupos combinados de par: não tratada (solução salina), TH-302 sozinho (50 mg /kg ip), hidralazina sozinho (10 mg /kg ip) e a terapia de combinação TH-302 /hidralazina. Na terapia de combinação, TH-302 foi administrado 30 minutos após a administração de hidralazina como este pareceu ser o momento de efeito máximo sobre a perfusão de pós-hidralazina. Todos os grupos foram tratados durante dois ciclos de 5 tratamentos consecutivos, seguido por 2 dias fora, e os volumes dos tumores foram monitorizados com pinças electrónicos durante o curso do estudo. controle de volume do tumor em monoterapia ou terapia combinada TH-302 foi considerado perdido quando os tumores atingiram 1.000 milímetros

3, que é detalhada em curvas de Kaplan-Meier. Como antecipado, o crescimento do tumor foi completamente inibida Hs766T com TH-302 monoterapia (Fig. 4A-B), o crescimento tumoral não foi afectado por SU.86.86 TH-302 monoterapia (Fig. 4C-D) e MIA PACA-2 tumores respondeu a moderadamente tratamento (Fig. 4E-F). A terapia de combinação de hidralazina seguido por administração de TH-302 não teve qualquer efeito benéfico sobre o controlo do volume do tumor em ratinhos portadores de tumores ou Hs766T SU.86.86 relativos a coortes tratados com monoterapia TH-302. Mais importante, nenhum destes modelos de tumor exibiu o efeito “roubar” a seguir à administração de hidralazina (Fig. 1). MIA PaCa-2 tumores responder moderada a TH-302 monoterapia (Fig. 4E-F) e experimentaram um aumento em acidose tumor devido ao fluxo sanguíneo do tumor reduzida após o tratamento hidralazina (Fig. 1). Os ratinhos portadores MIA PaCa-2 tumores experimentou uma redução modesta do crescimento do volume do tumor quando tratados com a terapia de combinação /hidralazina-TH 302 em comparação com TH-302 monoterapia (Fig. 4E-F). Apesar de uma tendência de redução no crescimento tumoral entre TH-302 terapia de combinação /hidralazina e TH-302 monoterapia, análises estatísticas das curvas de crescimento indicam que as diferenças não atingiram significância estatística (

p Art 0,08). Esta experiência foi repetida duas vezes mais com resultados semelhantes (dados não mostrados). Em todos os casos, MIA PaCa-2 tumores tratados com a terapia de combinação tinha reduzido o crescimento, mas não foi significativamente menor (p = 0,08) do que a do grupo de monoterapia TH-302. Combinando os dados de todas as experiências não alterou os níveis de significância.

Os ratinhos portadores subcutânea Hs766T (n = 9 por coorte), SU.86.86 (n = 9 por coorte) ou MIA PaCa-2 (números listados entre parênteses para cada grupo de tratamento) de tumores foram par de correspondência em 4 grupos: controlo de solução salina (n = 10), TH-302 sozinho (n = 9), hidralazina sozinha (n = 7), e TH-302 + hidralazina (n = 7 ).