Abstract

Dados os papéis importantes de miRNA na regulação pós-transcricional e suas implicações para o câncer, caracterização de miARN facilita nós para descobrir os mecanismos moleculares subjacentes a progressão do cancro da próstata independente de androgénios (CaP). O surgimento de tecnologias de sequenciamento de próxima geração mudou drasticamente a velocidade de todos os aspectos de sequenciamento de uma forma rápida e de baixo custo, o que pode permitir uma investigação imparcial, quantitativa e em profundidade da pequena transcriptoma RNA. Neste estudo, foram utilizados de alto rendimento Illumina seqüenciamento para representar de forma abrangente o complemento total de RNA pequeno individual e caracterizar os perfis de expressão miRNA tanto na linha de células andrógeno dependente e independente Pca. Pelo menos 83 miARNs são significativamente expresso diferencialmente, dos quais 41 são sobre-regulada e 42 são regulados negativamente, indicando estes miARNs podem estar envolvidos na transição de LNCaP com um fenótipo independente de androgénios. Além disso, foram identificados 43 novos miRNAs do andrógeno biblioteca CaP dependente e independente e 3 deles são específicos para o CaP independente de androgénios. Função de anotação de genes alvo indicou que a maioria destas miARNs diferencialmente expressas tendem a alvejar genes envolvidos na transdução de sinal e a comunicação de célula, epically a via de sinalização MAPK. As pequenas transcriptomes ARN obtidos neste estudo fornecem conhecimentos consideráveis ​​para uma melhor compreensão da expressão e função de pequenos RNAs no desenvolvimento de cancro da próstata independente de androgénios

citação:. Xu L, Wu J, Zhou L, Chen B, Z Sun, Zhao M, et al. (2010) Caracterização do pequeno RNA transcriptomes da linha celular dependente e câncer de próstata independente do andrógeno por Sequenciamento profundo. PLoS ONE 5 (11): e15519. doi: 10.1371 /journal.pone.0015519

editor: Patrick Ling, Universidade de Tecnologia de Queensland, Austrália |

Recebido: 01 de agosto de 2010; Aceito: 06 de outubro de 2010; Publicação: 30 de novembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Provincial de Zhejiang Natural Science Foundation da China (No. Y2100902), Wenzhou Ciência e Tecnologia Projeto (Y20100011), Zhejiang Provincial da Ciência e Tecnologia Plataforma de análise e testes Projetos de Tecnologia (2009F82G2090045) e Nacional de Pesquisa de alta Tecnologia e Desenvolvimento de Programas de China (2006AA02A304). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o tumor maligno mais comum do trato geniturinário masculino e a terceira principal causa de morte por câncer [1], [2]. Como o crescimento PCA é inicialmente dependentes de andrógenos para a sobrevivência, a terapia da privação do andrógeno (ADT) tem sido o pilar do tratamento para CaP. No entanto, estes tumores, eventualmente, progredir para um fenótipo independente de androgénios e não respondem ao tratamento ADT, tornando-se o obstáculo principal da terapia clínica. A compreensão dos mecanismos moleculares que estão na base da progressão do CaP andrógeno-independente vai lançar luzes consideráveis ​​sobre possíveis estratégias de tratamento do PCA. miARNs (microRNAs) são pequenos, ARN não codificante (~20-22 nucleótidos) que regulam negativamente a expressão do gene ao nível da [3] pós-transcricional. Acumulando evidências indicam que miARNs podem funcionar como supressores de tumor e oncogenes [4], [5]. Dado o importante papel dos miRNAs na regulação pós-transcricional, a identificação desses miRNAs diferencialmente expressos e romance vai facilitar-nos a descobrir os mecanismos moleculares subjacentes a progressão do cancro da próstata independente de androgénios.

Para caracterizar a pequena transcriptoma RNA , as novas tecnologias de ‘deep-sequenciação “, como Roche 454 e Illumina Solexa, têm sido empregados que têm vantagens significativas sobre metodologias baseadas na hibridação anteriores, como microarray e ensaios baseados em PCR [6], [7]. Em primeiro lugar, ele fornece uma visão mais integrada do transcriptoma miRNAs. High-throughput seqüenciamento tem a capacidade de identificar modestos ou mesmo baixa miRNAs abundantes que apresentam diferenças de expressão entre amostras distintas, de tal forma que anteriormente não poderiam ser efetivamente detectados. Em segundo lugar, sequenciação directa também oferece o potencial para detectar a variação do comprimento de madura miRNA e possíveis modificações enzimáticas. Em terceiro lugar, de alto rendimento de sequenciação permite a descoberta de novos sucesso miARNs, que não necessitam de contar com consultando regiões candidatas do genoma, mas sim pode ser conseguida pela observação directa e validação do potencial de dobragem de flanqueamento sequência genómica. Tomados em conjunto, tecnologias de sequenciamento de próxima geração oferecem um sistema altamente robusto, preciso e escalável, que estabelece um novo padrão para uma rápida, produtiva e rentável investigação de miRNA transcriptoma.

Até agora, há seis ampla genoma miRNA estudos de expressão no câncer de próstata como revisto por Gandellini et al. [8]. O primeiro perfil de expressão de miARN de cancro da próstata foi realizada por Lu e colegas [5], em que se utilizou uma técnica de citometria de fluxo baseado em grânulo para avaliar o perfil de miARN em diferentes tipos de tumores. As restantes cinco estudos aplicado microarray ou o método de hibridação baseado em grânulo para investigar assinaturas de expressão de miARN no cancro da próstata em comparação com o tecido normal, e identificou uma série de miARNs expressos aberrantes em células tumorais. No entanto, esses estudos se centrou apenas na comparação de perfis de expressão de miRNA entre amostras APC e tecidos circundantes não tumorais, apesar de não revelar que tipos de miRNA pode ser correlacionado com a transição ao andrógeno-independentes no cancro da próstata sensível andrógeno-. Mais recentemente, Sun et al. descobriu que vários miARNs, em particular o miR-221 e miR-222, foram significativamente sobre-expressos em células de cancro de próstata independente de androgénios em comparação com aqueles na linha celular dependente de androgénio, e implicou o envolvimento de ambas as miARNs no desenvolvimento e progressão do andrógeno-independência de câncer de próstata [9]. deVere White et al. (2009) identificaram um pequeno conjunto de miRNAs foram expressas de forma aberrante em linhas celulares de CaP andrógeno-independente usando a tecnologia de microarray [10]. Uma comparação detalhada dos perfis de expressão de miARN entre os cancros dependentes de androgénios e independentes de androgénios pode descobrir como a via de miARN está envolvida na progressão de cancro da próstata para a independência de androgénio. Usando o sequenciamento de última geração, obtivemos assinaturas de expressão miARN no cancro da próstata independente de androgénios e identificou 83 miARNs diferencialmente expressos em linhas celulares de LNCaP-AI, bem como possíveis alvos para estas miARNs. Para nosso conhecimento, este estudo representa o primeiro exemplo de pequena transcriptoma RNA por sequenciamento de alto rendimento no câncer de próstata e demonstrou que a sequenciação profunda pode servir como uma plataforma ideal, rápida e de baixo custo para a caracterização de perfis de expressão RNA pequenos.

Materiais e Métodos

Cultura celular

A linha celular LNCaP dependente de androgénios foi obtida da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e foi rotineiramente mantidas num meio regular de: vermelho de fenol-positivo meio F-12 (Gibco) com 10% de FBS (Biowest) a 37 ° C em 5% de CO

2. As células foram alimentadas duas vezes por semana e uma vez por semana, dividida com tripsinização (definida como uma passagem). Para estabelecer uma linha celular independente de androgénio, LNCaP foi mantida pela primeira vez em DMEM isento de fenol-vermelho /meio F-12 (Gibco) com FBS tratado com dextrano a 10% de carvão /(Biowest). Após cultura durante 5 semanas, as células foram transferidas para o meio anterior com 1,0 × 10

-7 mol /L-flutamida (Schering Plough) e cultivadas por mais de 105 passagens.

Ensaio de Proliferação Celular

As células foram semeadas a uma densidade de 3 x 10

3 células /cavidade em uma placa de cultura de 96 poços em 90 ul de mídia regular. Após 24 horas de incubação a 37 ° C em 5% de CO

2, o meio de cultura foi mudado com metade dos poços recebem meio de regular e metade recebeu forma livre (meio isento de vermelho de fenol androgénio com 5,0 × 10

-6 mol /L flutamida). As células foram incubadas em 5% de CO

2 a 37 ° C durante 72 horas, 10 ul de CCK-8 solução (Dojindo) foi adicionada a cada poço, seguido de incubação durante 3 horas a 37 ° C, e a absorvância foi finalmente determinada a 450 nm usando o leitor de microplacas (Bio-Rad).

transferência de Western foi levada a cabo pelos métodos descritos anteriormente [11]. Foram utilizados os seguintes anticorpos: Coelho anti-Bcl-2 (1:200, Cell Signaling), de coelho anti-Bax (1:100, Cell Signaling) e rato anti-β-actina (1:1000, Cell Signaling)

celular Ciclo de ensaio

As células foram suspensas em hormone-free e médio regular, respectivamente, e foram, então, plantadas em três placas de 24 poços com um número de 3,3 × 10

5 células por bem. Após incubação em 5% de CO

2 a 37 ° C durante 24 horas, foi adicionado flutamida nos orifícios. As células foram recolhidas após incubação em 5% de CO

2 a 37 ° C durante 72 horas. O procedimento de pré-tratamento de análise do ciclo celular foi seguindo o manual de teste Ciclo

plusDNA Reagente Kit (Becton Dickinson). análise do ciclo celular foi realizada utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD Company)

em tempo real RT-PCR

RNAs pequeno ( 200 nt). foram isolados com

Mirvana

™ Kit ™ PARIS (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. Para as reacções de RT, 1 ug de RNA pequeno foi utilizado para a transcrição reversa com miScript Transcrição Reversa Kit (Qiagen), realizada a 37 ° C durante 60 min e uma incubação final a 95 ° C durante 5 min. MiARN em tempo real de RT-PCR foi realizado usando o kit de miScript SYBR Green PCR (Qiagen) num Applied Biosystems 7000 em tempo real máquina de PCR (ABI). A reacção de PCR foi realizada a 95 ° C durante 15 min, seguido de 40 ciclos de incubação a 94 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s, e 70 ° C durante 30 s. Cada PCR foi repetida pelo menos três vezes. O nível de expressão relativa de cada miRNA foi normalizado pela relação aos níveis de U6 snRNA. Dobre-a mudança foi calculada de acordo com a 2

-ΔΔCt método.

pequeno RNA Biblioteca Construção e de alta capacidade Sequencing

O RNA total isolado foi tamanho fracionada em um tris 15% (TBE) de gel de poliacrilamida de ureia-EDTA -borate para enriquecer para moléculas de 15-30 nt. O RNA pequeno foi ligado com 3 ‘(5′-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT-3’) e 5 ‘(5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3′) utilizando adaptadores de RNA-ligase de T4 e foi novamente sobre um gel de poliacrilamida TBE ureia 15% fraccionados por tamanho. O RNA resultante foi reversamente transcrito em ADNc com Solexa do pequeno ARN de RT-Primer (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ‘). O cDNA foi usado como molde para amplificação por PCR utilizando ARN pequeno conjunto de iniciadores de Solexa (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ‘; 5′-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’). Finalmente, cerca de 20 mg de RNA pequeno foram utilizados para sequenciação utilizando Illumina 1 G Genome Analyzer acordo com os protocolos do fabricante.

Filtro Leia e pequeno RNA de anotação

Para deep-sequenciação lê produzido pela Illumina Genome Analyzer, baixa qualidade leituras foram filtrados para excluir os que mais provavelmente representam erros de sequenciação e 3/5 sequências de adaptador ‘foram posteriormente cortado em comprimento total limpo lê formatado em um formato Fasta não redundante. As ocorrências de cada sequência única leituras foram contados como etiquetas de seqüência (o número de leituras para cada marca reflete nível de expressão relativa) e apenas sequências de RNA pequenos de 18 a 30 nt foram retidas para análise posterior.

Todos sequência única marcas que passam filtros acima foram mapeados para o genoma humano de referência, utilizando o programa SABÃO 2,0 com, no máximo, dois desemparelhamentos [12]. Posteriormente, as etiquetas de seqüências únicas foram alinhados contra miRBase14.0, computacionalmente previu ncRNAs e Rfam 9,1 (https://rfam.sanger.ac.uk/), a anotação RepeatMasker humana desde RepBase 14,09 (http: //www.girinst. org /), a genes humanos UCSC hg18 anotação (https://genome.ucsc.edu/) para classificar conhecido miRNA, fragmentos de degradação do RNA, repete genômicas e mRNA não-codificante, respectivamente. Sequências que não se sobrepõem a qualquer uma destas anotações, mas poderia ser alinhados ao genoma de referência foram denominados “não classificado”.

expressão diferencial de detecção e Novel miRNA Previsão

Para comparar miRNAs diferencialmente expressos entre LNCaP e LNCaP-AI, leia contagens de cada miRNAs identificados foi normalizado para o número total de miRNA lê. O significado estatístico (valor de P) foi inferida com base no método de Bayesian, que foi desenvolvido para a análise de perfis de expressão de gene digitais e pode explicar a variabilidade de amostragem de etiquetas com baixas contagens de [13]. A miRNA específico foi considerada significativamente diferencialmente expressos, se o

valor P

dada por este método foi ≤0.001 e houve pelo menos uma mudança de 2 vezes na sequência normalizada conta. Os genes alvo para cada miRNA diferencialmente expressos foram preditos usando TargetScan (https://www.targetscan.org/), Miranda (https://www.microrna.org/), PicTar (http: //pictar.mdc-berlin .de /) e RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/). Dado que a previsão de miARN alvos sofrem frequentemente de nível elevado de falsos positivos, apenas o gene alvo suportada por, pelo menos, três ferramentas independentes foram tidos em conta. O Gene Ontology (GO) termos e vias KEGG de genes alvo foram anotados utilizando a ferramenta de anotação gene DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov/UTH).

As seqüências não anotadas que poderiam ser mapeadas para o genoma humano foram consideradas para a detecção de novos genes de miARN candidato. Em resumo, 100 nucleótidos da sequência genómica flanqueando cada lado destas sequências foram extraídas e as estruturas secundárias de ARN foram previstas usando RNAfold (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). novel candidato miRNA foi identificado usando MIREAP sob configurações padrão, que tem sido amplamente adotados em estudos relacionados [14], [15]

Todos os dados de sequenciamento, juntamente com resultados de anotação pode estar disponível em http:. //59.79. 168,90 /pca.

resultados

Criação de um independente de andrógeno Linha LNCaP celular

com base nos relatórios que o andrógeno células LNCaP sensíveis (Fig. 1A) podem ser convertidos em células andrógeno-independente [16], [17], nós tentativa de gerar uma linha celular independente de andrógeno por continuamente a cultura de células LNCaP

in vitro

. Depois de três semanas de iniciação da cultura em meio com privação de hormona, a proliferação das células gradualmente desacelerar e um número considerável de células (cerca de 40-50%) foram submetidos a apoptose (Fig. 1B). Os restantes alterados na morfologia para exibir um fenótipo neuroendócrino semelhante (Fig. 1B). Com o aumento do número de passagens, as células apareceram com variações morfológicas óbvios e tornar-se pequena e plana, desenvolver a capacidade de crescer de uma maneira independente de androgénios (um fenótipo que designado como LNCaP-AI) (Fig. 1C). Para estimar os efeitos do ambiente livre de andrógeno em LNCaP-AI crescimento de células, que examinam-se continuamente a taxa de proliferação de células da linha de células em diferentes passagens. Mostra-se que a taxa de crescimento celular de células LNCaP-AI foi mostrado uma tendência de queda gradual da passagem 1, 2, 5, 10 e 20, no entanto, como o número de passagem aumentada, a taxa de proliferação celular foi aumentada gradualmente e quase alcançado a 100% ( A Fig. 1D). Depois de 110 passagens durante 2 anos de cultura, o crescimento celular foi estabilizado e pode crescer bem em ambiente com depleção de androgénio.

(A) A morfologia das células LNCaP parentais, que foram cultivadas em meio normal durante 3 dias. (B) fenótipo neuroendócrino de células LNCaP. As células LNCaP foram mantidas em meio depletado de androgénio e cultivadas durante 3 passagens. (C) Morfologia das células LNCaP-AI. As células LNCaP foram cultivadas com flutamida em meio depletado de androgénio durante 110 passagens. (D) As taxas de crescimento celular de células LNCaP de cultura esgotado de androgénios em diferentes passagens quando cultivadas em ambiente de privação de androgénio. (E-F) Os efeitos do ambiente de depleção de androgênio e flutamida sobre LNCaP-AI (E) e do ciclo (F) de células FGC-LNCaP. (AI: andrógeno-empobrecido médio; Flu: 1,0 × 10

-7 mol /L de flutamida; norma: médio regular). (G) células Bcl-2 e expressão Bax em LNCaP e LNCaP-Ai.

Para provar ainda que as células LNCaP-AI ter adquirido a capacidade de se adaptar ao ambiente livre de hormônio, mais estudos são necessários para insights sobre os efeitos da flutamida ou ambiente livre de androgénios sobre o ciclo celular de células LNCaP por citometria de fluxo, e as células LNCaP dependentes de androgénio foram incluídos como um controlo. Como esperado, a flutamida ou ambiente livre de androgénio não teve nenhum efeito significativo sobre a distribuição do ciclo celular nas células LNCaP-AI (FIG. 1E). Em contraste, este tratamento nas células LNCaP foi induzida por uma acumulação de células na fase G0 /G1 e acompanhada de uma diminuição na fase S, e o efeito de inibição foi muito mais forte quando ambos foram combinadas (Fig. 1F). estudo anterior revelou que a proteína Bcl-2 é sobre-expresso na progressão de cancro da próstata refractário-andrógeno [1]. Para caracterizar a expressão de ambos Bcl-2 e as proteínas nas duas linhas celulares Bax (Bcl-2 associada proteína X) (LNCaP e LNCaP-AI), a análise de transferência de Western foi realizada (Fig. 1G). Encontrámos um aumento da expressão da proteína Bcl-2 em células LNCaP-AI, em comparação com células LNCaP. Enquanto isso, as células LNCaP expressa um nível semelhante de proteína Bax. Estes resultados sugerem que as células LNCaP-AI ganhou uma actividade anti-apoptótica melhorada. Com base nas observações acima, temos estabelecido com sucesso uma linha de células LNCaP andrógeno-independente por meio da cultura de longo prazo de células LNCaP.

pequeno RNA transcriptomes e anotação

Para investigar pequenas transcriptomes RNA, Illumina tecnologia de sequenciamento de alto rendimento foi empregado para tanto LNCaP e LNCaP-AI bibliotecas de RNA pequeno. Inicialmente, um total de 9.107.833 e 10.083.251 sequência cru leituras foram produzidos para LNCaP e LNCaP-AI, respectivamente. Depois de filtro e corte das leituras com baixa qualidade e adaptador, 3.978.524 e 4.734.866 sequência lê foram obtidos correspondente a 302.325 (LNCaP) e 416.924 (LNCaP-AI) tags únicas. Observação da distribuição do comprimento de pequenos RNAs, verificou-se que a maior parte delas a partir das bibliotecas foram ambas 22 nt de tamanho (Fig. 2A), o que é consistente com o tamanho típico de miARN a partir de produtos de digestão Dicer. Enquanto isso, havia uma alta porcentagem de etiquetas de sequências idênticas (88,90%) entre LNCaP e LNCaP-AI. Estes resultados indicaram que miARNs foram sucessivamente enriquecida a partir de ambas as bibliotecas.

(A), distribuição do comprimento de sequenciados lê. Ambas as bibliotecas acumulada de 22 nucleotídeos pequenos RNAs, o que é consistente com o tamanho típico de miRNAs. B) As proporções de várias classes de pequenos RNAs detectados em LNCaP e LNCaP-AI. É indicado que a maioria das leituras em ambas as bibliotecas pertencentes às famílias de miARN.

Subsequentemente, a 18-30 nt a partir de sequências de ambas as bibliotecas foram seleccionadas para mapear o genoma humano, e um total de 3,747,159 (94,18%) e 4,433,423 (93,63%) foram detectadas sequências para coincidir com o genoma, com no máximo dois desemparelhamentos, respectivamente (Fig. 2B). Baseado em anotações genoma humano e um certo número de bases de dados de ARN bem caracterizados (ver Materiais e Métodos), essas sequências de ARN pequenas foram anotados como conhecido miARN, fragmentos de degradação de ARN não codificante (ARNt, ARNr, snRNA /snoRNA et ai.) , repita genômica, mRNA ou não classificado. Como esperado, a categoria mais abundantes de ARN a partir de ambas as bibliotecas foi conhecido miARNs: 65,22% para 62,33% e LNCaP de LNCaP-AI. As restantes categorias menos abundantes foram não-codificante RNA e repete genômicos. Além disso, uma pequena proporção de leituras pode ser mapeada para as sequências de codificação, os quais são susceptíveis de serem produtos de degradação de ARN. evidência acumulada indicou que alguns genomas também pode transcrever transcritos curtos não codificantes funcionais, tais como pequenos RNAs interferentes endógenos ou RNAs interferentes repetir-associados, que tem sido caracterizada de regular a retrotransposição de repressão [18]. Por exemplo, é revelado que L1 retrotransposição é suprimida por endogenamente codificados pequenos RNAs interferentes em células humanas cultivadas. Assim, é de salientar que esses pequenos RNAs também podem conter função biológica importante que merece mais atenção.

diferencialmente expressos miRNA Entre LNCaP e LNCaP-AI

Com base em miRBase, 360 miRNAs (285 miRNAs e 75 miARNs *) e 380 (282 miARNs miARNs e 98 miARNs *) foram detectados em LNCaP e LNCaP-AI, respectivamente (Tabela S1). Em primeiro lugar, verificou-se que diferentes miARNs exibiram significativamente diferentes níveis de expressão tal como medido pela contagem de frequência de leitura, indicando uma divergência funcional notável destes miARNs. Em LNCaP-AI, por exemplo, cerca de 8,99% dos miRNAs e miRNA * s estão em altas contagens de leitura ( 1000), entre as quais a HSA-let-7 família (HSA-deixou-7c, HSA-let-7F, HSA-let-7a, HSA-let-7d, HSA-let-7b e HSA-let-7e) é um dos miRNAs mais abundantes no nosso conjunto de dados, contribuindo 8,94% do total miRNA lê. miRNA contar dentro das faixas de intermediário 100-1000 lê subiram para 17,4% e os restantes miRNA conta para cerca de 73,7%.

A contagem relativa de sequenciamento lê poderia ser usado para quantificar os níveis de expressão miRNA entre LNCaP e LNCaP -AI. Com base no número normalizado de leituras por amostra (miARN specifc /total de etiquetas de sequenciação da biblioteca), a maioria dos miARNs (256) foram expressos em partes aproximadamente iguais entre as duas bibliotecas. No entanto, 83 deles foram identificados para ser diferencialmente expressos com uma dobra alterações 2,0 e

P

-valor 0,001 (. Tabela 1, Fig 3A e Tabela S1). Entre eles, 41 eram up-regulada e 42 foram regulados negativamente. Para validar ainda mais estes miARNs diferencialmente expressas, foram seleccionados 29 miARNs individuais para executar ensaio quantitativo de RT-PCR a partir de réplicas biológicas independentes. Estes 29 miRNAs selecionados cobriu ambos os miRNAs altamente expressos (MIR-222, miR-30a *, miR-100, miR-10b, miR-148b, miR-1323, miR-221, miR-7, miR-223, miR-374b , miR-486-5p, miR-7a *, miR-125b-2, miR-27a e miR-423-5) e miRNAs expressos inferiores (miR-15b, miR-21, miR-17, miR-28-5p , miR-532-3p, miR-200c, miR-93, miR-96, miR-200b *, miR-331-3p, miR-200b, miR-106a, miR-301b e miR-301a). Como mostrado na Fig. 3B, uma forte correlação (correlação de Pearson = 0,91) foi revelada entre os dados de sequenciamento de profundidade Illumina e os quantitativos medidas de RT-PCR, indicando a robustez da análise de expressão sequenciação profunda baseada

.

(A) O nível de expressão de LNCaP e LNCaP-AI miRNAs. A contagem de cada miRNA foi traçada após a normalização. círculo de cor vermelha mostra diferencialmente expressos miRNAs entre LNCaP e LNCaP-AI com pelo menos uma mudança de 2 vezes e

p

-valor abaixo de 0,001. (B) Solexa vs. qRT-PCR de miRNA dobrável mudanças.

Genes Novel miRNA

Uma das vantagens mais importantes para sequenciamento de alto rendimento de RNA pequeno transcriptoma é que ele permite a descoberta de potenciais novos miARNs. Para identificar candidatos novos miRNAs em LNCaP e LNCaP-AI, primeiro filtrados etiquetas Illumina seqüência que foram classificados em categorias anotadas, como miRNAs conhecidos, RNA não-codificante, repetições genômicos ou sequências de codificação. Descobrimos que 235.058 e 259.454 dos pequenos marcadores de sequências de RNA em LNCaP e LNCaP-AI, respectivamente, foram derivadas a partir de regiões não anotadas do genoma humano. Estas etiquetas não classificados, juntamente com sequências que flanqueiam 100 pb foram analisados ​​por MIREAP, uma sofisticada ferramenta utilizada para identificar novos miARNs de dados de alto rendimento de sequenciação [14], [15]. Desta forma, foram identificados 43 supostos novos miRNAs de ambas as bibliotecas (Tabela 2 e Tabela S2): 22 em LNCaP e 31 do LNCaP-AI (Tabela 2 e Tabela S2), e apenas 10 deles são compartilhados por ambas as bibliotecas

observou-se também que estes 43 miARNs têm uma gama de tamanho de 20-24 nt e os comprimentos das suas estruturas em gancho de cabelo preditos variar 65-98 nt, que é semelhante ao miARNs humanas conhecidas (Tabela S2) . As energias livres mínima dos seus precursores variam de -18,20 a -67,40 kcal /mol, com o valor médio de -52,70 kcal /mol. Para validar ainda mais estes novos miARNs, foi realizada a análise em tempo real de RT-PCR em todos os 10 candidatos romance miARN com uma frequência de sequenciação normalizada maior do que 10 (as outras foram excluídos, tendo em conta o seu nível de expressão baixo e a sensibilidade do tempo real análise de RT-PCR). Como resultado, temos validado com sucesso oito deles (Tabela 2), indicando que 80% poderiam ser validada por um método independente de sequenciamento.

Em comparação com outros miRNAs em nosso estudo, estes novos miRNAs têm um muito mais baixo nível de expressão, com uma frequência de sequenciação média normalizada de 45, indicando que a maioria deles não podem apresentar funções significativos no cancro da próstata. Entre eles, três miARNs específicos LNCaP-AI exibiu sequência relativamente grande conta que 10 e validado por em tempo real de RT-PCR, o que implica o seu envolvimento provável no desenvolvimento de LNCaP-AI, e, portanto merecem avaliação funcional adicional.

metas previstas de miRNAs diferencialmente expressos

para explorar a função biológica dos miRNAs diferencialmente expressos identificados em nossa análise, foi realizada a análise computacional utilizando quatro algoritmos independentes, incluindo TargetScan, Miranda, RNAhybrid e PicTar, para a identificação do previsto alvos de ARN mensageiro para cada miARN ser significativamente expresso diferencialmente. Tabela listas S3 previu metas que foram apoiados por, pelo menos, três dos acima de quatro algoritmos, em que um total de 6902 genes eram alvos potenciais destes miRNAs. Curiosamente, entre estes objectivos previstos, AKT3 estava envolvido em 11 miRNAs significativamente abaixo-expressas. AKT3 codifica um membro da serina /treonina cinase da família de proteínas, que é conhecido por estar envolvido numa grande variedade de processos biológicos incluindo a proliferação celular, diferenciação, apoptose, e a tumorigénese. A UP-expressão de AKT3 em linhas celulares de cancro de próstata independente de androgénios revela que podem contribuir para o fenótipo mais agressivo de carcinomas da próstata independente de androgénios [19].

Para avaliar as funções do gene alvo, que anotado estes predicado alvos miRNA com ontologia gênica (GO) e esquemas de KEGG utilizam Davi. alvos miRNA previstos povoada muitas das principais categorias ir, e para alguns deles, o número de genes alvos foi significativamente enriquecido (

P Art 0,001, com correção Benjamini). As três classificações GO, função molecular, processo biológico e de componentes celulares foram avaliadas por nível, mas apenas termos significativos ao nível 5 de processo biológico estão listadas na Tabela S3. Como esperado, a maioria dos termos GO significativos foram relacionados à regulação da transcrição (por exemplo GO: 0.045.449, GO: 0.006.351 e GO: 0.006.357). Há também uma série de categorias GO significativamente enriquecidos, incluindo morfogênese celular (GO: 0.000.902), transporte intracelular (GO: 0.046.907) e apoptose (GO: 0.006.915). Para analisar o papel que os miRNAs jogar nas redes reguladoras, atribuímos alvos miRNA putativos em vias KEGG, e identificou 14 deles foram significativamente enriquecido (

P Art 0,001, com correção Benjamini). A maioria destes miARNs tendem a alvejar genes envolvidos na transdução de sinal e a comunicação de célula (Tabela S4). Por exemplo, verificou-se que 130 genes alvo (2,3%) pode ser atribuído à via de sinalização MAPK, que está envolvida numa vasta gama de respostas celulares, incluindo a expressão do gene, diferenciação, proliferação e apoptose [20]. No câncer de próstata, vias de sinalização MAPK são geralmente considerados para promover o crescimento do tumor e o surgimento da doença hormônio-refratário [21], [22], [23].

Discussão

Neste estudo , identificámos um grande conjunto de miARNs que são expressos diferencialmente subjacente a progressão do cancro da próstata independente de androgénios, que também foram verificados por qRT-PCR. Alguns destes miARNs são bem suportados por estudos publicados recentemente. Um exemplo notável vem da expressão excessiva de miR-221 e miR-222 na amostra de LNCaP-AI por um aumento para o dobro 10-20, em que ambos estão entre os miARNs mais abundantes na linha celular de LNCaP-AI. A sobre-expressão de miR-221 ou miR-222 em LNCaP pode reduzir significativamente o nível do di-hidrotestosterona induzida sobre-regulação da expressão do antigénio específico da próstata e aumentar o crescimento independente de androgénios de células LNCaP [9]. Várias linhas de evidência sugeriram que o miR-221 e miR-222 poderia regular negativamente o supressor de tumor p27 em células LNCaP, e a sua sobre-expressão pode ser um dos factores que contribuem para a progressão do carcinoma da próstata [24]. Além disso, o aumento da expressão de miR-125b, miR-30c, miR-100 que observamos em linhas de células LNCaP-AI também foi identificada a ser regulado para cima em cinco linhas de células AI PAC [25], e

in vitro

experiência mostrou que o miR-125b poderia estimular o crescimento e para baixo AI-regular a expressão de BAK1 [25]. A redução do miR-141, miR-19b, miR-22, miR-29a e miR-29b aqui identificado também foi observado entre os 15 miRNAs que foram diminuídos em quatro carcinomas da próstata hormônio-refratário, como descrito no Porkka et al. estudo de base microarray s [26].

também identificamos um conjunto de miRNAs diferencialmente expressos, o que não foi documentado em tumorigênese prostática ou desenvolvimento AI. Por exemplo, o miR-124, miR-148b, 320a-miR e miR-423-5p foram supra-regulados por 2 a 14 vezes, enquanto que o miR-29a, miR-93, o miR-200 e miR-1277 foram jusante regulados por 2 a 10 vezes, o que sugere que estes miARNs poderia exercer um papel como genes de supressão tumoral ou oncogenes no desenvolvimento do cancro da próstata. É interessante notar que todos os cinco membros da família miRNA-200 (miR-200a, miR-200b, miR-200C, miR-141 e miR-429) foram significativamente regulada em células LNCaP-AI. Foram também identificados Todas estas miARNs a ser baixo-expressos em células que tinham sido submetidos a epitelial para mesênquima transição [27], a qual é vista como um passo inicial essencial para a progressão de células tumorais não-invasivas em carcinomas metastáticos [28]. Alvos destes microRNAs foram encontrados para ser E-caderina repressores de transcrição ZEB1 e SIP1, fatores previamente implicados na metástase do tumor [27]. Um estudo mais recente revelou que a expressão ZEB1 poderia aumentar a migração transendotelial de células de cancro da próstata [29].