Abstract

Fundo

A inflamação crônica é frequentemente observada na análise histológica de espécimes da próstata malignas e não malignas. É um fator de apoio suspeita de doenças da próstata e sua progressão e uma causa principal de testes de PSA de falsos positivos na despistagem do cancro. Colocámos a hipótese de que a inflamação induz auto-anticorpos, que podem ser marcadores úteis. Nós teve como objetivo identificar e validar a inflamação associada auto-anticorpos séricos da próstata em pacientes com câncer de próstata e avaliar a expressão de auto-antígenos correspondentes.

Métodos

espécimes prostatectomia radical de pacientes com câncer de próstata (N = 70) foram classificados em grupos de altas e baixas de inflamação de acordo com a quantidade de linfócitos infiltrantes de tecidos. As amostras de soro sanguíneo pré-cirurgia correspondentes foram escrutinados para auto-anticorpos, utilizando uma matriz de proteína de baixa densidade. auto-antígenos selecionados foram identificados no tecido da próstata e seu padrão de expressão analisados ​​por imuno-histoquímica e qPCR. O perfil de auto-anticorpos identificados foram cruzadas em um conjunto de amostras independentes (N = 63) usando a tecnologia de matriz de proteína Luminex-talão.

Resultados

triagem array de proteínas identificadas 165 autoanticorpos diferencialmente abundante no soro de alta em comparação com os pacientes de baixa inflamação. O padrão de três antígenos correspondentes expressão foram estabelecidos em tecido benigno e câncer por imuno-histoquímica e qPCR: SPAST (Spastin), STX18 (sintaxina 18) e POCA (tipo de manchas de proteínas POZ). Destes, SPAST foi significativamente aumentada no tecido da próstata com inflamação elevado. Todos os três auto-antígenos foram diferencialmente expressos no ensino primário e /ou tumores da próstata resistente a castração quando analisado em um tissue microarray independente de inflamação. Validação cruzada do perfil de inflamação auto-anticorpos em um conjunto de amostras independentes usando uma matriz de proteínas Luminex-grânulo, recuperados 51 dos auto-anticorpos significativamente exigentes. Três auto-anticorpos foram significativamente regulada em ambas as telas, MUT, RAB11B e CSRP2 (p 0,05)., Dois, POCA e ZNF671, perto de significância estatística (p = 0,051 e 0,076)

Conclusões

Nós fornecemos evidências de um perfil de auto-anticorpos específicos da inflamação e confirmar a expressão de auto-antígenos correspondente no tecido da próstata. Isto suporta a avaliação de auto-anticorpos como marcadores não-invasivos para a inflamação da próstata

Citation:. Schlick B, Massoner P, Lueking A, Charoentong P, Blattner M, Schaefer G, et al. (2016) Os auto-anticorpos no soro na próstata inflamação crônica em pacientes com câncer de próstata. PLoS ONE 11 (2): e0147739. doi: 10.1371 /journal.pone.0147739

editor: Aamir Ahmed, do Kings College London, Reino Unido

Recebido: 28 Julho, 2015; Aceito: 07 de janeiro de 2016; Publicação: 10 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Schlick et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante dados estão disponíveis no papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o estudo foi apoiado por COMET K1 Centro Oncotyrol-Centro para a medicina personalizada, financiado pela Agência de Promoção da Investigação austríaca (FFG) ea Fundação Futuro da País de Tirol, e Protagen AG. ONCOTYROL GmbH, Protagen AG e Targos Patologia Molecular GmbH forneceu apoio sob a forma de salários para os autores [BS, PM, GM], [AL, KM, CT, PA, SM, PSK], [DZ, MK], mas não tinha qualquer papel adicional no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Todos os outros autores declaram que não há interesse competindo. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. O estudo foi apoiado por COMET K1 Centro Oncotyrol-Centro para a medicina personalizada, financiado pela Agência de Promoção da Investigação Austríaca (FFG) ea Fundação Futuro do País de Tirol, e Protagen AG. Petra Massoner, Georg Schaefer e Bettina Schlilck foram empregadas pela ONCOTYROL. Angelika Lueking, Klaus Marquart, Carmen Theek, Peter Amersdorfer, Stefan Müllner e Peter Schulz-Knappe foram empregadas pela Protagen AG. Stefan Müllner é o co-fundador e CEO da Protagen AG. Dirk Zielinski e Matthias Kirchner foram empregadas pela Targos Patologia Molecular GmbH. Petra Massoner está atualmente afiliada como um companheiro DAAD com a Roche Diagnostics GmbH, no entanto, os dados incluídos no estudo foram geradas antes que a filiação, o estudo aqui apresentado é independente da bolsa ou qualquer outro trabalho relacionado com a Roche Diagnostics GmbH. Protagen AG detém uma patente sobre “marcador Sequências de diagnóstico de cancro da próstata, e a sua utilização”. Não há produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de partilha, conforme detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

A próstata é um site de benigna freqüente e doença maligna com a idade como o principal fator de risco [1, 2]. Como uma desvantagem de a expectativa de vida constantemente aumentando a incidência de doenças da próstata, tais como câncer de próstata, hiperplasia prostática (BPH) e prostatite está crescendo bem e estas doenças representam um problema médico e social crescente, mas também um fardo económico crescente [3- 6]. Frequentemente, a análise histopatológica de biópsias de próstata e espécimes cirúrgicos revela inflamação associada a doenças da próstata, na maioria dos casos, um assintomático, inflamação “crónica” caracterizada por alterações histológicas e infiltrados de células imunes [7-10]. A inflamação crônica pode ser um dos pilotos de progressão da doença da próstata e um dos principais fatores que contribuem para testes falso-positivo antígeno específico da próstata (PSA) cancro da próstata [11-15].

A fonte da inflamação intraprostática ainda não está totalmente descoberto, infecção, autoimunidade, lesão celular, variações hormonais ou fatores dietéticos podem contribuir. Por mais que a causa para a prostatite resta um desafio para novas investigações, a sua relevância para processos patológicos não é clara [16]. Estudos sugerem uma contribuição de inflamação crônica à carcinogênese e desenvolvimento de doenças da próstata [17, 18]. Particularmente, atrofia inflamatória proliferativa (PIA) que é considerado uma lesão precursora, cancro da próstata, está associada com infiltrados de células imunitárias inflamatórias, que estimulam a proliferação, carcinogénese apoiar através de estresse oxidativo aumentado e danos celulares e degeneração maligna pioneiro [19]. Embora a maioria dos estudos abordou o impacto da inflamação na carcinogênese e progressão do tumor, este fenômeno não se restringe ao câncer, infiltrados de células imunes também são encontrados frequentemente em hiperplásica ou mesmo no tecido da próstata histologicamente normais [17].

À luz da necessidade de continuar os esforços que clarificam o impacto da inflamação em doenças da próstata, biomarcadores de fácil acesso para a inflamação da próstata seria uma grande ajuda. Além disso, tais marcadores que permitem a um modo menos invasivo para o diagnóstico, prognóstico e monitorização do tratamento da prostatite crónica é necessário para melhorar o tratamento do paciente, aumentar a especificidade do teste de PSA para a detecção do cancro da próstata e conduzir a uma melhoria da gestão do cancro da próstata. Neste contexto, os auto-anticorpos são importantes tipos de moléculas marcadoras, como a que estão ligados a actividade do sistema imunitário. Os anticorpos têm propriedades ideais como potenciais marcadores, eles são muito estáveis ​​e não sofrem variações de curto prazo na concentração, eles são facilmente acessíveis através de amostras de soro ou plasma e em cada laboratório clínico, existem métodos de detecção altamente sensíveis disponíveis para sua quantificação. Para pacientes com cancro foi demonstrada de forma convincente de que uma resposta imune anti-tumor pode ser desencadeada [20, 21]. Os auto-anticorpos contra os antigénios do cancro foram identificadas em pacientes com diferentes entidades de tumores sólidos, tais como, por exemplo tumores da mama [22, 23], da cabeça e pescoço [24, 25], do pulmão [26, 27], esófago [28], do cólon [29] e de próstata [26, 30, 31].

recentemente, foram empregados microarrays da proteína para o perfil de auto-anticorpos no sangue de pacientes com câncer de próstata e controles não-cancerosas. Foram identificados um painel de auto-anticorpos da próstata câncer associado [31]. Estendendo esses estudos que aqui apresentam a identificação e validação da auto-anticorpos associados com a próstata infiltrados de células imunológicas em pacientes com câncer de próstata. Além disso, avaliou-se o padrão de auto-antígenos no tecido da próstata malignas e não malignas correspondente expressão e perguntou se as mutações podem desencadear auto-anticorpos.

Material e Métodos

coorte retrospectivo amostra

as amostras de soro foram obtidas a partir do cancro da próstata Bioresource do Departamento de Urologia da Universidade de Innsbruck médica. As amostras de sangue foram recolhidas no âmbito do programa de detecção precoce do cancro da próstata do Tirol e foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização [32]. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Medicina de Innsbruck (Estudo AM 3174, a alteração 2) Ética. Todas as amostras foram obtidas antes da cirurgia de prostatectomia radical de pacientes com cancro da próstata clinicamente localizado comprovada por biópsia, que eram pelo menos 40 anos de idade e que não receberam a terapia de câncer de próstata anterior. A seleção dos pacientes para os casos de baixa e alta inflamação foi baseado na análise de amostras de próstata inteiros para infiltrando linfócitos. Um grupo de 70 pacientes (38 alta, 32 baixa de infiltração) para o estudo de triagem e 63 pacientes (33 alta, 30 baixa de infiltração) para o estudo de validação cruzada foram recrutados.

auto-anticorpos profiling

Os ensaios utilizados para criação de perfis auto-antígeno, uma matriz de proteína de baixa densidade e uma matriz de proteínas Luminex-grânulo, respectivamente, foram estabelecidos como técnicas amplamente aplicáveis ​​e não especificamente para o câncer de próstata somente. Considerando que a técnica matriz de proteína foi aplicada para o estudo de triagem inicial, a técnica Luminex-talão estabelecida mais tarde foi usado para um estudo de validação cruzada independente.

Seleção de proteínas de auto-antigénios incluídos foi baseada em nossas telas de auto-anticorpos anteriores na próstata câncer [31] e doenças auto-imunes [33-35], e na auto-antígenos publicados encontrada associada com câncer [36-42]. Além disso, a eficácia da produção de proteínas, a qualidade da proteína, e os critérios de desempenho do ensaio foram considerados para a seleção final de proteínas de auto-antigénios. 4012 proteínas foram selecionados para o array de proteínas, proteínas de 3061 para o array de proteínas Luminex-grânulo. painéis de auto-antigénios são listados na Informação de Apoio (S1 Tabela). O ensaio de proteína talão foi agrupado em 8 subarrays como o número máximo disponível de LuminexMagPlex

esferas TM individualmente codificados por cores (Luminex, MV’s-Hertogenbosch, Holanda) é 500. O ensaio de auto-anticorpos Luminex-talão foi estabelecido por um ampla aplicação, independente da próstata inicial baixa /alta inflamação resultados do rastreio e, portanto, não exatamente igual, o painel autoantig�io inicial. Com base nos correspondentes ID do gene de, 84% das proteínas de auto-antigénios do ensaio de Luminex-talão também foram representados no microarray da proteína.

proteínas auto-antigénio foram expressos em

E

.

coli e as proteínas recombinantes foram purificadas usando um procedimento de purificação por afinidade de His-tag. Geração de microarrays proteicos planares foi realizada tal como descrito previamente [31]. Resumidamente, as proteínas foram vistos em quadruplicado em slides RÁPIDOS revestido de nitrocelulose (GE Healthcare). Do rato e IgG humanas em diferentes concentrações foram adicionados a ser utilizadas como controlos de detecção imunológicos e para a normalização dos dados. Uma estação automatizada (HS 4800 Pro, Tecan) foi usado para realizar a análise de micro-arranjo de auto-anticorpos. lâminas de matriz foram bloqueadas com 2% (w /v) de soro bovino (BSA) em TBS contendo 0,1% (v /v) de Tween 20 (TBST) e amostras de soro de sangue foram adicionados em uma diluição 1: 100 em 2% (w /v) de BSA /TBST. Após incubação à temperatura ambiente durante 16 horas secundário (rato-anti-humano-IgG, 1: 5000, Sigma) e terciário (IgG de burro Cy3 marcado anti-ratinho, 1: 500, Jackson ImmunoResearch) os passos de incubação de anticorpo foram efectuadas em 2% (w /v) de BSA /TBST à temperatura ambiente durante 1 h. Depois de cada passo de incubação, as lâminas foram lavadas 3 vezes com TBST. matrizes de proteína processados ​​foram digitalizados em um leitor de microarray confocal (ScanArray 4000, Perkin Elmer Life Science) e analisados ​​utilizando o 6.0 microarray software de análise de imagem Pro GenePix (Molecular Devices).

A técnica Luminex-talão para perfilamento autoantígeno foi estabelecida porque tem várias vantagens em comparação com a técnica de array de proteínas inicialmente utilizadas, tais como gama dinâmica mais elevada, menores coeficientes de variação, uma maior estabilidade devido à ligação covalente de proteínas e um melhor desempenho na análise de alto rendimento. Para a matriz auto-antigénio grânulo foram selecionados 3061 auto-antigénios. Seus-tag de afinidade proteínas recombinantes purificadas foram covalentemente acoplado a cor carboxilado magnético codificados MagPlex

esferas TM microesferas seguindo o protocolo do fabricante (Luminex). Para cada reacção de acoplamento único até 12,5 ug antigénio e 8,8 x 10

foram usadas 5 contas codificadas individualmente. A eficiência de acoplamento e a estabilidade do grânulo foram monitorizados. Um sub-disposição grânulo consistiu em até 384 diferentes esferas revestidas com antigénio e oito esferas de controlo. Devido ao número total de antigénios, oito subarrays diferentes foram estabelecidas e utilizadas para as análises. esferas revestidas com proteína foram distribuídas em placas de microtitulação de 96 poços e incubou-se com diluída (1: 100) amostras de soro durante 22 horas a 4 ° C. Em cada placa de ensaio, três soros de referência foram medidos servindo como controle de qualidade. Os anticorpos não ligados foram removidos por lavagem. Os anticorpos humanos ligados foram quantificados por sondagem com fitoeritrina (PE) marcado com anticorpo de detecção anti-humana (cabra-anti-humano-PE, Jackson /Dianova) seguido de vários ciclos de lavagem e de medição do sinal de fluorescência em um dispositivo FlexMap3D (Luminex) (DD portão 7,500-15,000; tamanho da amostra: 80 ul; 1000 eventos por região talão; tempo limite de 60 segundos)..

Os dados pré-processamento e análise biostatistical

matrizes de proteína Planar

Após subtracção do fundo mediana, a intensidade de fluorescência média de 4 réplicas de manchas foi calculada para cada um auto-antigénio e normalizados para os controlos IgG manchado. Cut-offs foram determinados individualmente para cada auto-antígeno e calculado como a intensidade de sinal média da coorte baixo controle da inflamação mais 3 desvios-padrão. amostras de coorte alta inflamação com valores acima do cut-off foram classificados como positivos e todos os antígenos foram classificadas de acordo com a decrescente número de amostras positivas. aumento N-vezes ou diminuição de um auto-anticorpo específico foi determinado a partir da intensidade do sinal médio normalizado na elevado em comparação com a coorte de baixa inflamação. Ranking de marcadores candidatos superiores foi baseada em fold-change e corrigidos p-Value.

matrizes de proteína do grânulo.

O talão média intensidade de fluorescência medido para cada auto-antígeno foi utilizado para cálculos posteriores. Em casos raros, quando menos de 10 contas foram recuperados para a medição, este valor foi definido como falta. Estes valores foram substituídos pelo valor da mediana desta auto-antigénio medido em todas as amostras. Autoantígenos com valores em falta, mais de 20% foram excluídos da análise posterior. Após a transformação log2 normalização quantil [43, 44] foi utilizado para normalizar as amostras em cada prato individual.

A classificação dos cinco auto-anticorpos com melhor desempenho identificados com a técnica matriz talão para a diferenciação da baixa e as coortes alta inflamação foi baseado em um modelo de regressão logística com a variável grupo (alta /baixa inflamação) como a variável dependente e os valores de fluorescência média de auto-anticorpos como os fatores que influenciam. P-valores para os factores que influenciam individuais foram determinados com base no teste de Wald, e, adicionalmente, as estimativas dos parâmetros e os respectivos intervalos de confiança de 95% (IC) de dois lados foram calculados. odds ratio (OR) foram dadas em conjunto com os respectivos intervalos de confiança de 95% de dois lados. O desempenho da classificação foi avaliado com base na sensibilidade, especificidade e valores de AUC que foram alcançados com este modelo [43, 45]

anotação funcional e análise de caminho

Depois de mapear as Top 165 auto-anticorpos testados positiva com o microarray da proteína a genes, um conjunto de 136 genes foi obtido e usado para a análise ontologia gene. Funcional agrupamento anotação foi realizada utilizando o banco de dados DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [46, 47].

Tissue Microarray (TMA) e imuno-histoquímica

Para a construção de uma micromatriz de tecido (inflamação-TMA) fixados com formalina e embebidos em parafina amostras de tecidos humanos (n = 70), exibindo valores altos ou baixos de linfócitos infiltrantes de tecido foram selecionados a partir do grupo autoanticorpos. As características clínicas e patológicas estão resumidos na Tabela 1 na coluna “Coorte Screening”. O uso de amostras arquivadas decorrentes de espécimes de prostatectomia radical obtidos no Hospital Universitário de Innsbruck foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Medicina de Innsbruck Ética. Para cada caso de três núcleos de tecido de cancro e três núcleos benignos com um diâmetro de 0,6 mm foram perfurados para fora do tecido do doador e transferido para o TMA bloco receptor [48]. A TMA foi montado utilizando uma arrayer tecido manual (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI). Basal p63 marcador de células tumorais e marcador de células α-methylacyl CoA racemase (AMACR) colorações usado para controlar o diagnóstico histológico e SPAST, STX18 ou SPOP colorações, respectivamente, foram realizadas num dispositivo de coloração Descoberta-XT (Ventana, Tucson, AZ) utilizando protocolos convencionais do instrumento. anticorpos alvo, fornecedores, números de artigo, e as concentrações utilizadas foram as seguintes: anti-SPAST, Atlas Antibodies (Estocolmo, Suécia), # HPA017311, 01:50; anti-STX18, Atlas-anticorpos, # HPA003019, 1: 150; anti-SPOP, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), # SAB1406659, 01:50; anti-p63, Sigma-Aldrich, # P3362, 1: 200; anti-AMACR, Dako (Viena, Áustria), # M3616, 1: 200, anti-CD45, Dako, # M0701, 1:. 300

Avaliação da intensidade de coloração imuno-histoquímica foi supervisionado por um experiente uropathologist (GS). As imagens foram adquiridas utilizando um microscópio Axio Imager Z2 (Zeiss) e software TissueFAXS (TissueGnostics). análise imuno-histoquímica quantitativa foi realizada usando o HistoQuest software de análise imuno-histoquímica (TissueGnostics). Para cada TMA detectar a intensidade média e a percentagem de células coradas positivamente foram avaliados e foi calculada uma pontuação multiplicando esses dois valores para cada núcleo TMA. valores escore médio foram calculados a partir de três câncer e três núcleos de tecido benigno de cada paciente. Teste U Mann Whitney foi utilizado para a análise das diferenças entre os dois grupos.

Um segundo TMA (Targos-TMA), que compreende 111 amostras de tecido de próstata histológico normal (BE), hiperplasia benigna da próstata (HBP), próstata o carcinoma (CA), bem como tumores refractários castração clinicamente diagnosticados (CRPC), foi construído e corados tal como descrito acima. O uso dessas amostras de tecido resultantes de cirurgias de prostatectomia radical no Hospital de Kassel foi aprovado pelos conselhos de revisão institucionais. Colorações foram avaliadas por um patologista independente (M.K.), utilizando um sistema de pontuação semiquantitativo (H-score), que combina quatro categorias de intensidade com a percentagem estimada de células coradas [49]. Teste U Mann Whitney foi utilizado para a análise das diferenças entre os grupos.

Isolamento de ARN e qPCR

O ARN total foi extraído a partir de áreas benignas e malignas de secções de tecido congeladas, de dois grupos de pacientes (altas /baixa inflamação, n = 66), utilizando o Kit de AllPrep DNA /RNA Micro (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemanha). As concentrações e a pureza do RNA foram determinadas espectrofotometricamente. Transcrição Reversa (RT) foi realizada em 500 ng de ARN total utilizando iScript escolher um kit de síntese de cDNA (Bio-Rad, Hercules CA, EUA) e os iniciadores de hexâmeros aleatórios (Promega, Madison WI, EUA). QPCR (40 ciclos) foi realizado em triplicado utilizando 8NG equivalentes de ARN total de cDNA para cada reacção de 10 uL. Foram utilizados os seguintes ensaios de Taqman (Applied Biosystems, Foster CityCA, EUA): PTPRC, Hs04189704_m1; STX18, Hs01099207_m1; POCA, Hs00737433_m1; SPAST, Hs00208952_m1; TBP, Hs00427620_m1. expressão do gene alvo foi normalizado ao TBP gene housekeeping. O rácio de expressão relativa (R) foi calculada com base na eficiência ensaio TaqMan do gene alvo e do gene de referência e o desvio limiar de ciclo (Ct) de cada amostra a uma amostra de controlo (calibrador, ADNc mistura de 3 benigna e 3 secções de tecidos malignos, 20ng qPCR entrada) com a seguinte fórmula:. R = [E

alvo ^ ΔCt (calibrador-sample)] /[E

referência ^ ΔCt (calibrador-sample)] [50]

Procurar para mutações POCA

Cinquenta e três amostras de cDNA relacionadas com o isolamento de RNA de amostras altas /baixas inflamação dos tecidos descritos no parágrafo anterior foram utilizados para a tela de mutação do POCA. Um par de primers (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemanha) flanqueando a região de mutações POCA recorrentes foi projetado utilizando o Primer software open-source 3: Fwd, 5′-AAGGGTTCCAAGTCCTCCAC-3 ‘; Rev, 5’-CGGCACTCAGGAACCTTTAC-3 ‘[51]. A amplificação por PCR foi realizada em 100 ng de ARN total equivalente com Taq DNA polimerase (Peqlab, Erlangen, D) num total de 100 ul, aplicando as seguintes condições: desnaturação a 95 ° C durante 2 min; 40 ciclos de 95 ° C durante 1 min, 62 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 1 min; alongamento a 72 ° C durante 7 min. quantidade de produto PCR e tamanho foi verificada em 1,2% de agarose em Flash Gel (Lonza, Rockland, EUA). O ADN foi purificado utilizando o kit de extracção de Qiagen PCR e sequenciado utilizando os mesmos iniciadores de acordo com um padrão de sequenciação de Sanger protocolo (Mycrosynth, Balgach, CH).

Uma vez que a frequência de mutações detectadas SPOP foi significativamente menor do que o relatado na literatura [51], os resultados foram confirmados pelo método originalmente descrito por Blattner et ai. [52], o ADN foi isolado a partir de áreas benignas e malignas de secções de tecido congeladas, utilizando o Kit de AllPrep DNA /RNA Micro. Depois de um passo inicial de pré-amplificação de PCR para enriquecer as regiões alvo, uma análise de fusão de alta resolução (GRH) foi levada a cabo. Este ensaio tem como alvo exons 6 e 7 do gene POCA contendo todas as mutações detectados anteriormente no câncer de próstata (aminoácidos 80 a 106 e aminoácidos 120 a 140). A amostra que mostrou uma notável mudança na curva de fusão foi expulso por seqüenciamento Sanger para confirmar e especificar a sua alteração.

Resultados

níveis de anticorpos séricos estão elevados em pacientes com câncer de próstata com células imunitárias infiltração do

próstata

em uma tentativa para identificar a inflamação crônica da próstata auto-anticorpos associados, pacientes com câncer de próstata que apresentam um baixo ou um elevado número de infiltrar células imunes em seus espécimes de prostatectomia radical foram submetidos à análise. A fim de identificar altos e baixos de inflamação coortes de pacientes, aproveitamos o número de infiltração de células do sistema imunológico ao longo de toda a próstata. Para cada paciente, vinte a trinta lâminas de tecido, representando diferentes áreas da próstata foram coradas para o marcador pan de leucócitos CD45 para definir os linfócitos infiltrantes de tumor. Um uropathologist experiente realizada a classificação em dois grupos (alta /baixa inflamação) de acordo com um sistema de classificação histopatológica para a inflamação da próstata crônica [53]. As amostras de pacientes sem ou com leve inflamação foram especificados como “grupo de inflamação de baixo” e aqueles com inflamação moderada e alta como “grupo de alto inflamação”. Os parâmetros clínicos, incluindo idade, inflamação marcador de proteína C-reativa (PCR), Gleason pontuação, volume da próstata, o PSA e PSA livre foram igualmente distribuídos entre os altos e os grupos de baixa inflamação (Tabela 1, Fig S1).

os perfis de auto-anticorpos no soro de 38 elevado a inflamação e 32 inflamação de baixa (controle) os pacientes foram obtidas para amostras de pré-cirurgia de soro sanguíneo, empregando uma tela de matriz de proteína recombinante 4012 (Fig 1A) correspondente. Selecção do painel de ensaio com o antigénio foi baseada na própria e apresentaram dados sobre os auto-antigénios associados com o cancro da próstata, outros tipos de cancro e de doenças relacionadas com inflamação, tais como a esclerose múltipla ou lúpus eritematoso, respectivamente [31, 36-42] (S1 Tabela). Auto-anticorpos contra auto-antigénios 3919 foram detectados em pelo menos um dos pacientes e o número de pacientes positivos para auto-anticorpos correspondentes a um auto-antigénio indivíduo variou de 0 a 69 de 70 (Tabela S1). Considerando o número de amostras positivas em ambos os grupos gerada uma lista de 15 autoanticorpos mais presente de forma diferente no elevado em comparação com o grupo de baixa inflamação (Fig 1B). Os autoanticorpos topo do ranking contra Spastin (SPAST, giI40806168) e proteínas POZ tipo salpico (POCA, giI56117827) estavam presentes em 37% e 42% dos soros provenientes de pacientes de alto inflamação enquanto detectável em menos de 3% e 10% do soros de pacientes com baixos controlar a inflamação. Avaliação da prega-mudança para cada um dos 997 autoanticorpos no elevado em comparação com o grupo de baixo a controlar a inflamação, revelou significativamente abundância aumentada (p 0,05) de 165 autoanticorpos na coorte dos pacientes de alto inflamação (Fig 1C, S2 Tabela). Nenhum deles foi determinado exclusivamente no grupo de alto inflamação. Curiosamente, o nível de intensidade de apenas um auto-anticorpos (ligação ao antígeno FEZF2, giI157388917) foi diminuiu significativamente (log2-foldchange: -2,66, p-valor: 0,002). Na elevado em comparação com o grupo controle de baixa inflamação

Um fluxograma da estratégia utilizada para a detecção e validação cruzada dos auto-anticorpos (AAB) assinaturas associadas com inflamação crónica da próstata. espécimes de prostatectomia radical foram classificados em dois grupos (alto /baixo de inflamação), com base na extensão da infiltração de células imunitárias em toda a próstata. As amostras de soro de sangue de pré-cirurgia correspondentes foram analisados ​​por auto-anticorpos (AAB), utilizando um array de proteínas planar (triagem, n = 70). Um estudo de validação cruzada testar a robustez do painel AAB foi identificada com base na tecnologia de array de proteínas Luminex-talão (validação cruzada, n = 63). A comparação estatística dos perfis de auto-anticorpos no soro nos grupos de baixas e altas de inflamação foi usada para identificar e validar aABS diferencialmente abundantes. Os padrões de expressão de tecido da próstata e a expressão em diferentes fases de progressão do câncer de próstata foram estabelecidos para três auto-antígenos correspondentes selecionados (AAGs). Gráfico B Bar para observações classificadas positivamente das 15 auto-anticorpos mais diferencialmente detectado no grupo de alto inflamação em comparação com o grupo de baixa inflamação. Os dados são expressos como percentagem do número total de amostras positivas de cada grupo. C cálculo das variações de dobragem para cada autoanticorpos revelaram um aumento significativo de 165 antigénios no cancro alta inflamação da próstata (painel superior direito, p 0,05, dobrar mudança 2, de Mann-Whitney) e uma diminuição de apenas um (painel superior esquerdo ). Representação gráfica D dos dez melhores classificados agrupamentos funcionais atribuídas para a inflamação associada auto-anticorpos, utilizando a ferramenta de anotação funcional DAVID. O tamanho da barra corresponde ao percentual de genes identificados correspondentes relacionadas com a categoria funcional específico (P 0,05).

Nós saber se os 165 auto-anticorpos significativamente melhoradas pela inflamação crônica estão associados com grupos funcionais distintos e portanto, mapeado-los aos seus genes correspondentes para realizar um agrupamento anotação funcional usando o banco de dados DAVID. Foram identificadas várias funções moleculares enriquecidos e processos biológicos. Dos dez melhores termos de anotação “localização de proteínas” formaram o maior cluster contendo 14 genes associados que codificam proteínas envolvidas no tráfico vesicular (GDI1, MYH9), endo (CDC42) e exocitose (STX18), ligação à cromatina (CHMP5) e T citotóxicos activação -cell (CTLA) .O conjunto “organização macromolecular complexa subunidade” era composto de genes necessários para a reparação de DNA (SF3B3), a síntese de proteínas (eIF2a), proliferação de células T (FADD), e a desmontagem de microtúbulos (STMN1, SPAST). No geral, observou-se que os auto-anticorpos acima da média nos pacientes de alto inflamação foram dirigidos principalmente contra antígenos estruturais e proteínas associadas a proliferação celular (Fig 1D, Tabela 2).

Antígenos de auto-anticorpos derivados do soro são expressos na próstata

Para elucidar se antigénios de auto-anticorpos identificados são expressos e possivelmente desregulado no tecido da próstata, nós investigamos o padrão de expressão das proteínas alvo distintas. Para que os três antígenos candidatos, Spastin (SPAST), salpico do tipo de proteína POZ (POCA) e sintaxina 18 (STX18), foram selecionados de acordo com os seguintes critérios: (i) auto-anticorpos estão entre os top associadas à inflamação diferencialmente abundantes de acordo para valores de p e dobre mudança (S2 Tabela); (Ii) anticorpos para IHC estão comercialmente disponíveis e os níveis de antigénio correspondentes são suficientes para a detecção imuno-histológica de acordo com a proteína humana Atlas (www.proteinatlas.org); (Iii) as associações com diferentes tipos de cancro tinha sido relatada (Tabela 3). Uma micromatriz de tecido, incluindo amostras de tecido de pacientes de alto e baixo inflamação da tela do auto-anticorpo foi gerado e usado para a detecção imunohistoquímica destas proteínas de auto-antigénios.

SPAST, SPOP e STX18 foram encontrados expressos no epitélio de benigna e áreas de câncer em ambos os grupos de pacientes. A quantificação de intensidades de imunocoloração revelou uma expressão significativamente aumentada SPAST na inflamação elevado em comparação com amostras de baixa inflamação da próstata tecido. No entanto, POCA e STX18 imunoreatividades não foram alteradas entre as amostras de alta e baixa inflamação do paciente (Fig 2A).

A colorações imuno-histoquímico das manchas tissue microarray representativos de uma inflamação coortes de alta e baixa do paciente. SPAST, STX18 e POCA são expressos no epitélio das áreas benignas (BE) e câncer (CA) de ambos os grupos. A análise quantitativa foi realizada utilizando o HistoQuest software de análise imuno-histoquímica (TissueGnostics). A pontuação foi calculada multiplicando a intensidade da coloração e a percentagem de células marcadas positivamente. n = 25 por grupo. * P 0,05, teste de Mann-Whitney. Bar, 100 um.