Abstract
Fundo
proteína Chromodomain-helicase vinculativo de DNA 5 (CHD5 ) é um supressor de tumor recentemente identificada que é frequentemente regulados negativamente em uma variedade de cancros humanos. Nosso trabalho anterior revelou que a baixa expressão da CHD5 no câncer colorretal está correlacionada com o promotor CHD5 CpG ilha hipermetilação. Neste estudo, nós investigamos o efeito de microRNA-211 (miR-211) -regulated expressão CHD5 na tumorigênese colorretal.
Metodologia /Principais Achados
miR-211 foi prevista para atingir CHD5 por análise de software TargetScan. A miR-211 linha de células de cancro colo-rectal que expressam estavelmente exógena (HCT-116
miR-211) foi gerado utilizando transdução lentiviral e usado como um modelo para
in vitro
e
in vivo
estudos. O nível de expressão de miR-211 em HCT-116
células miR-211 foi regulada por 16 vezes em comparação com células de controlo do vector (HCT-116
vetor). Exógeno miR-211 liga-se directamente à região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) de ARNm CHD5, resultando num decréscimo de 50% no nível de proteínas em CHD5 HCT-116
células de miR-211. Os níveis de proliferação celular, o crescimento do tumor, e migração de células de HCT-116
células miR-211 foram significativamente maiores do HCT-116
células vetor sob ambos
in vitro
e
In vivo
condições, conforme determinado utilizando os métodos de MTT, a formação de colónias, citometria de fluxo, o ensaio de zero, e xenoenxertos de tumor, respectivamente. Além disso, descobrimos que a expressão forçada de miR-211 em células HCT-116 foi capaz de alterar proteínas reguladoras p53 via-associados, tais como a MDM2, Bcl-2, Bcl-xL, Bax e.
Conclusão /Significado
Nossos resultados demonstram que CHD5 é um alvo direto da regulação miR-211. expressão forçada de miR-211 promove o crescimento de células de tumor, pelo menos em parte, pela regulação negativa do nível do supressor de tumor CHD5 expressão. Nossos resultados fornecem uma melhor compreensão da associação entre a expressão CHD5 miR-211-regulada e função CHD5 na tumorigénese colorectal
Citation:. Cai C, Ashktorab H, Pang X, Zhao Y, Sha W, Y Liu , et ai. (2012) MicroRNA-211 Expressão promove o crescimento celular Câncer Colorretal
In Vitro
e
In Vivo
por Segmentação supressor de tumor CHD5. PLoS ONE 7 (1): e29750. doi: 10.1371 /journal.pone.0029750
editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, Espanha |
Recebido: 05 de outubro de 2011; Aceito: 03 de dezembro de 2011; Publicação: 03 de janeiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Cai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo financiamento da Saúde Nacional do Câncer (CA118770 e CA102681) e do Centro Nacional de investigação Recursos (RCMI 2 G12 RR003048), EUA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Identificar genes relacionados ao câncer e compreender a sua contribuição para tumorigênese são passos críticos no controle do câncer. Estudos recentes demonstraram que a expressão génica pode ser afectado por alterações na estrutura da cromatina e a associação do ADN com nucleossomas [1]. Por exemplo, as proteínas Sw /Snf pode causar perturbações ATP-dependente da estrutura do nucleossoma a um promotor, o que aumenta a ligação de factores de transcrição para os seus locais de ligação [1]. As acções destas proteínas também pode levar ao movimento dos nucleossomas e alterações na conformação da cromatina, o que resulta na activação da transcrição profunda (ou repressão) de um gene ou região [1].
Chromodomain-helicase-de ligação de ADN de genes ( DCC) codificam uma nova classe de proteínas Sw /Snf que contêm não só um domínio da helicase da ATPase Sw /SNF-análogos, mas também domínios funcionais adicionais [2], [3]. Estas proteínas têm um domínio de ligação de ADN, bem como um motivo chromodomain que pode afectar directamente a estrutura da cromatina e a transcrição de genes. Existem evidências crescentes de que os complexos proteína de CHD pode ter um efeito profundo sobre a estrutura da cromatina e a expressão do gene. Portanto, é provável que eles desempenham um papel importante na regulação do desenvolvimento, o controlo do ciclo celular, e oncogénese [4]. DCC é uma super família que pode ser dividida em cinco sub-famílias baseadas na presença de motivos proteicos específicos, que conferem a cada família de proteínas com uma função única. CHD5 é mais semelhante à CHD3 e CC4 na medida em que é contém motivos planta homeodomain. CHD5 foi recentemente identificado como um novo supressor de tumor que mapeia para 1p36, que é frequentemente suprimida em muitos tipos de cancros humanos [5], [6], e a actividade da cromatina-remodelação do CHD5 é necessário para a activação da transcrição apropriada da p19
Arf /via p53 [7].
é claro que a deficiência CHD5 é um evento inicial comum na tumorigênese humana. CHD5 é frequentemente regulados negativamente através de hipermetilação do promotor em gástrico, da mama, do ovário, tumores de glioma e [8], [9], [10], [11], sugerindo silenciamento epigenética por metilação de CHD5 pode contribuir para a tumorogénese nestes tecidos. O câncer colorretal (CRC) é um dos três tipos de câncer mais prevalentes nos Estados Unidos [12] e CHD5 é frequentemente hipermetilado em linhas de células cancerígenas do cólon humano e tumores primários [2], [13], [14].
Embora existam muitos estudos sobre o estado de metilação de CHD5 em diferentes tipos de tumores, há poucos estudos sobre como outro mecanismo epigenético importante, microRNAs (miRNAs), também podem desempenhar um papel crítico na deficiência CHD5 durante tumorigênese colorretal. miARNs são pequenos, não-codificante moléculas de RNA presente em animais, plantas e vírus que estão envolvidos principalmente em silenciamento do gene por emparelhamento de bases imperfeita com as regiões 3 ‘não traduzida (3′-UTR) de mRNAs específicos, o que induz a degradação de ARNm [ ,,,0],15]. As restrições de ligação soltas permitir um miARN para se ligar a vários locais dentro de uma 3’-UTR e a múltiplos alvos de ARNm dentro do transcriptoma, dotando miARNs com a capacidade para inibir vários genes de uma só vez [16]. Muitos miRNAs são conservados através filos amplamente diversificada, indicando a sua importância fisiológica [15]. miARNs desempenhar um papel fundamental na regulação diversos processos celulares, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, crescimento celular, apoptose, infecção virai, e metabolismo [17].
Alguns dos miARNs que são desregulados em função do cancro como supressores tumorais ou oncogenes [18]. Vários desses miARNs foram identificadas no cancro colo-rectal, incluindo o miR-31 regulada positivamente, o miR-96, o miR-135b, e miR-183 e miR-regulada negativamente o 133b e miR-145 [19]. Desde miARNs ligar a 3′-UTR dos seus mRNAs alvo por emparelhamento de bases, da região de complementaridade entre um miARN e o seu ARNm alvo é pequeno. Esta região inclui os nucleótidos 2-7 da extremidade 5 ‘da miARN e é referido como a região “semente” [20]. Diferentes abordagens computacionais foram desenvolvidos para prever locais de miARN alvo ao longo do genoma [21]. Ao usar as ferramentas informáticas Miranda, PicTar e TargetScan, miR-211 foi previsto para par de bases com o 3’-UTR de CHD5, mas
in vitro
e
In vivo
experimentos são necessários para confirmar se miR-211, na verdade, tem como alvo CHD5.
no presente estudo, investigamos o papel de miR-211 em células de câncer colorretal através da sua regulação negativa da CHD5
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. Em primeiro lugar, analisámos os níveis de miR-211 e CHD5 expressão nas linhas celulares de cancro colorrectal RKO e HCT-116. Nós, então, selecionados HCT-116 e estabeleceu a linha de células de miR-211-transfectado estavelmente HCT-116
miR-211. Finalmente, usamos esta linha de células para realizar uma série de
in vitro
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experimentos a fim de determinar
e se miR-211 alvos CHD5.
Resultados
os níveis de expressão de proteína CHD5 e miR-211 são inversamente correlacionados em linhas celulares de cancro de cólon humano
miR-211 foi escolhido como um candidato para o direccionamento miARN CHD5 devido à sua base de emparelhamento imperfeito ao extremo 3 ‘ -UTR de CHD5 (Fig. 1A). Investigou-se o nível de expressão de miR-211 nestas duas linhas de células por quantitativo em tempo real de RT-PCR (Fig. 1B). A fim de selecionar as linhas celulares adequadas para o nosso estudo, avaliamos o nível de proteína CHD5 em linhas celulares de cancro de quatro cólon por análise de Western blot (Fig. 1C), que incluiu duas linhas de células previamente estabelecidos (RKO e HCT-116) e duas linhas de células transfectadas CHD5 (RKO-S e RKO-AS). Nossos resultados revelaram que HCT-116 teve a maior expressão de CHD5 e RKO teve a menor expressão de CHD5. Portanto, as células HCT-116 e RKO linhas foram utilizados para experiências posteriores. Encontramos uma correlação inversa de CHD5 e expressão de miR-211 (Fig. 1D). O nível de expressão de CHD5 no HCT-116 foi 4 vezes mais elevada do que na RKO, enquanto que o nível de expressão de miR-211 em HCT-116 foi de apenas 20% do que no RKO. Desde HCT-116 células tinham o mais elevado nível de expressão de CHD5 e menor nível de miR-211 expressão, esta linha de células foi escolhida como uma linha celular candidata para transfectar de forma estável com o miR-211 para uma investigação mais aprofundada sobre a função de miR-211 em a regulação da expressão CHD5 sob condições de cultura celular e de xenoenxertos de tumor.
(a) mapa sequência de ARN da 3′-UTR do CHD5 (ID Gene 26038) com o sítio de ARNm complementar (3′-UTR 130- 136) para a região de semente de miRNA-211. (B) o miR-211 em níveis RKO, HCT-116, RKO-S, e RKO-como linhas celulares por RT-PCR quantitativo com base em valores de expressão de dobragem miR-211 /U6. (C) os níveis de proteína CHD5 em linhas celulares de cancro dois cólon (RKO e HCT-116) e duas linhas celulares estabelecidas (RKO-S e RKO-AS) com expressão CHD5-S aplicadas foram analisados por Western blot e semi-quantificados em função do CHD5 /intensidades relativas de p-actina. Bio-Rad Quantidade Um software foi utilizado para a análise densitométrica das transferências de Western. (D) Comparação de CHD5 e miR-211 Os níveis de expressão em linhas celulares HCT-116, RKO e. * Indicada como P . 0,05
expressão estavelmente forçado de miR-211 regula negativamente diretamente os níveis de proteína CHD5 no HCT-116 células
A fim de investigar o papel do miR-211 em a regulação negativa da CHD5 sob condições de cultura de células, construiu-se uma linha de células HCT-116, que expressa de forma estável o miR-211 utilizando um sistema de lentivírus de entrega para introduzir uma cassete de expressão com um
promotor de CMV, EGFP, e miR-211 precursora P (Fig. 2A). Nós também construiu uma linha celular HCT-116, HCT-116
VEC, que expressa estavelmente o vector de controlo GFP. Catorze dias após a infecção de lentivírus, quase todas as células HCT-116 tinham níveis detectáveis de fluorescência verde, que é um indicador de infecção eficaz. A expressão EGFP-miR-211 fornecido por lentivírus foi quantificada pelo tempo real de RT-PCR. expressão de miR-211 em HCT-116
miR-211 aumentou 16 vezes (
p Art 0,05). Além disso, o nível de CHD5 expressão diminuiu significativamente (Fig. 2B), com o nível de proteína de CHD5 in-116 HCT
célula de miR-211 em apenas 50% do que no HCT-116
células VEC (Fig . 2C). Além disso, CHD5 foi confirmado como um alvo directo de miR-211 por um ensaio de repórter de luciferase. Fluorescência actividade diminuiu mais de 90% depois de células 293T foram co-transfectadas com o vector de expressão de miR-211 e 3’UTR do ARNm CHD5 repórter de luciferase vector em comparação com o vector repórter de luciferase 3’UTR do CHD5 sozinho (Fig. 2D).
(a) representação esquemática do vector de miR-211, que contém uma cassete de a P
promotor de CMV, EGFP, e miR-211 e um precursor de cassete selectiva do P
expressão PGK promotor e Puro
r. níveis (B) proteína CHD5 em linhas de células HCT-116
vec e HCT-116
miR-211 foram avaliadas por transferência de Western e (C) semi-quantificados com base em intensidades relativas CHD5 /p-actina. (D) Ensaio de repórter de luciferase utilizando células HEK 293T que foram transfectadas, quer com o da luciferase /3′-UTR miR-211 repórter vector, o vector de miR-211, ou ambos. Também foram inseridos representação esquemática do vector repórter e repórter luciferase vetor de controle luciferase-CHD5. * Indicada como P . 0,05
expressão Forçados miR-211 aumenta a proliferação e migração de células de cancro do cólon
in vitro
O efeito do miR-211 sobre a proliferação celular foi avaliada utilizando um ensaio colorimétrico formação e a viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio MTT. HCT-116
vec células HCT-116 e miR-211 foram semeadas em placas de 6 cavidades separadas e o crescimento celular foi monitorizado diariamente sob um microscópio para dez dias até as colónias eram claramente visíveis a olho nu. Como esperado, as células HCT-116
miR-211 mostraram aumento da proliferação significativamente, conduzindo à formação de colónias mais. A capacidade de formação de colónia de HCT-116
células miR-211 foi de 221% (
p Art 0,05) mais do que a de HCT-116
células VEC (Fig 3A.). O ensaio de MTT mostraram que a expressão forçada de miR-211 em HCT-116
miR-211 células conduziu a um aumento de 30% na proliferação celular em comparação com HCT-116
vec células (Fig. 3B). As medições do ciclo celular por citometria de fluxo mostrou que a proporção de células em fase G1 diminuiu em 53% (
P
0,05), e que, na fase S aumentou em 51% (
P 0,05) no HCT-116
células miR-211, respectivamente, em comparação com HCT-116
células VEC (Fig 3C, D).. Também testámos o efeito de miR-211 sobre a migração celular pelo ensaio de zero (Fig. 4A). Descobrimos que o miR-211 aplicada expressão aumentou significativamente o potencial de células HCT-116 a migrar quando em comparação com as células de controlo. As células HCT-116
miR-211 foram nomeadamente migraram para a área de arranhar a referência de tempo de 5 horas, e as células foram quase atravessou a área de rascunho na hr de tempo de 24 (Fig. 4A). Havia cerca de 42,2% mais células na área de risco de HCT-116
placa de células miR-211 de HCT-116
células VEC (Fig. 4B).
A proliferação celular e viabilidade celular de culta HCT-116
VEC e HCT-116
linhas celulares miR-211 foram comparadas usando (a) ensaio de formação de colónia, (B) ensaio MTT, e (C e D) os perfis do ciclo celular e a distribuição de células em G1, S, G2 e M-fases para cada grupo, foram analisadas por citometria de fluxo. Os resultados representam a média ± SD de dois experimentos independentes com triplicados e * indicada como P . 0,05
(A) As áreas abertas riscados foram observados nas horas 0, 5, 8 e 24 para HCT-116
VEC e HCT-116
linhas celulares miR-211 sob um microscópio de luz no × 400 ampliação. (B) As células foram contadas a partir de vários período de tempo no mesmo tamanho da área zero como referenciado no tempo 0 h. Os resultados do ensaio zero eram de dois experimentos independentes com triplicados e * indicada como P . 0,05
Forçados miR-211 aumenta a proliferação de células de cancro do cólon
in vivo
Além de examinar as funções biológicas de miR-211
in vitro
, nós também avaliou o
in vivo
função de miR-211 utilizando um modelo de transplante de xenoenxerto. Por via subcutânea transplantar o HCT-116
vec ou HCT-116
miR-211 células em ratos nus, nós monitoramos o crescimento do tumor ao longo de um período de 6 semanas. Como mostrado na Figura 5, depois de 6 semanas de um tumor sólido se tinha formado no flanco direito de cada um dos murganhos com a dimensão média de 284 mm
3 e um peso médio de 0,592 g. No entanto, os tumores foram muito menores formada no flanco esquerdo com uma dimensão média de 13.55 mm
3 e um peso médio de 0,028 g, sugerindo que o miR-211 aumenta a proliferação de células cancerígenas do cólon
in vivo
.
(a) O crescimento do tumor xenoenxerto de HCT-116 e HCT-116
miR-211 são mostrados sob um sistema de imagem de luz e de fluorescência. A massa de tumor (g) foi medida no dia experimental final, imediatamente após o tecido de tumor foi removido a partir do ratinho por excisão cirúrgica. crescimento de xenotransplante tumoral para HCT-116 e HCT-116
miR-211 grupos foi comparada. (B) O dia da inoculação de células foi o dia de início experimental e todos os ratos foram sacrificados no dia 43. O crescimento de xenoenxertos de tumores sólidos foi monitorada uma vez por semana e medidos utilizando paquímetros.
expressão forçado de miR-211 altera a expressão de proteínas associadas ao crescimento e proteínas da via relacionada com a p53
os níveis de expressão das proteínas de sobrevivência de suporte de células Bcl-2 e Bcl-xL em HCT-116
miR- 211 foram aumentados em 37% e 29%, respectivamente, enquanto que o nível da proteína de promover a morte Bad expressão foi reduzido em 22% (Fig. 6A, B). A expressão de Mdm-2, um regulador negativo da p53, foi aumentada em 33% de HCT-116
miR-211 em comparação com células HCT-116
vec células. No entanto, a expressão da p53 e do seu gene alvo Bax diminuiu em 18% e 51%, respectivamente (Fig. 6C e D).
(A) Os níveis de proteínas associadas a crescimento celular em HCT-116
linhas celulares de miR-211 e HCT vec-116 foram analisadas por Western blot e (B) semi-quantificados com base em intensidades relativas de proteína-alvo /p-actina. Os níveis de proteínas de vias relacionadas com a p53 em HCT-116
vec e HCT-116
linhas celulares de miR-211 foram analisados por Western blot (C) e semi-quantificados com base na proteína intensidades relativas segmentados /p-actina (D).
Discussão
CHD5 é um gene supressor de tumor recém-identificado [2] localizado na 1p36 [7]. A sua expressão reduzida ocorre em muitos tipos de tumor devido à hipermetilação do promotor de [8], [9], [11]. Vários estudos têm sugerido que CHD5 regula positivamente vias mediadas por p53. A regulação baixa e hipermetilação de CHD5 foi encontrado em CRC [2], [13], [15]. No entanto, pouco se sabe a respeito de se miRNAs, um outro aspecto da regulação epigenética, expressão CHD5 impacto e o fenótipo de células CRC.
Os miRNAs são previstos para regular mais de 30% de toda a expressão do gene e podem ser responsáveis por alguns dos expressão génica aberrante, em células cancerosas. Nós usamos ferramentas de bioinformática e descobriram que o miR-211 está previsto para pares de bases da região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) de CHD5 (Fig. 2A). miR-211 é significativamente regulada positivamente em outros tipos de cancro [22] e pode funcionar como um oncogene, que é consistente com a função supressora de tumores de CHD5. No entanto, se o miR-211 tem como alvo directamente CHD5 e afecta o fenótipo das células do intestino precisava de ser confirmada. No presente estudo, determinou-se que a expressão forçada de miR-211 em uma linha celular de cancro colorectal regula negativamente directamente CHD5, resultando no aumento da viabilidade celular, a progressão do ciclo celular, e a capacidade de migração e diminuição da apoptose. Nós confirmamos nossos resultados em vários níveis diferentes, incluindo cultura de células, xenotransplantes tumorais, e as mudanças de proteína nas vias relacionadas com a CHD5.
Nós estabeleceu com sucesso uma linha de células de cancro do cólon que expressa de forma estável EGFP-miR-211, HCT- 116
miR-211, utilizando a tecnologia de transfecção gene estável (Fig. 2A). RKO e HCT-116 são ambas as linhas celulares de cancro colorrectal. CHD5 foi modesto expresso em RKO e altamente expresso em células HCT-116 [14]. Os níveis de CHD5 e miR-211 em RKO, RKO-S, RKO-AS, e HCT-116 de expressão foram detectados por Western blot e PCR em tempo real. Enquanto RKO-S é a linha celular estavelmente transfectada-CHD5, HCT-116 teve o mais alto nível de CHD5 expressão. Desde HCT-116 também teve o menor nível de miR-211 expressão, selecionamos esta linha celular para transfectar estavelmente com miR-211 (Fig. 1D). Foi estabelecido com êxito executada EGFP-miR-211 a expressão na linha de células do cólon HCT-116
miR-211 usando o Sistema de Expressão de Lenti-X ™ Lentivirus. Nós também estabelecida uma linha de células transfectadas com o vector vazio de EGFP, HCT-116
VEC. Uma vez que o gene EGFP partilhavam o mesmo promotor P
CMV com o gene de miR-211, que foram capazes de controlar facilmente o miR-211 de expressão nas células sob um microscópio fluorescente. Uma vez que a expressão de miR-211 em HCT-116 e HCT-116
vec células foi semelhante, HCT-116
vec foi utilizada como a linha celular de controlo para as experiências seguintes. O nível de expressão de miR-211 foi 15 vezes mais elevada em HCT-116
miR-211 em comparação com células HCT-116
veccells.
Além disso, o nível de expressão foi significativamente reduzida CHD5 no HCT-116
miR-211 células em comparação com HCT-116
células VEC (Fig. 2B, C). expressão forçada de miR-211 em aumento da proliferação de células 116 HCT-, formação de colônias, viabilidade (Fig. 3), e capacidade de migração (Fig. 4)
in vitro
. trânsito celular da fase G0 /G1 para a fase S foi acelerada (Fig. 3C e D) e a expressão de proteínas de suporte da sobrevivência de células Bcl-2 e Bcl-XL aumentada enquanto que a expressão da proteína de promover a morte Bad diminuíram (Fig. 6A, B ). A sobre-regulação de miR-211 aumentou a proliferação de células de cancro colorrectal pode ser por downregulating CHD5 (Fig. 2D) e o crescimento do tumor também promovido
In vivo
. Seis semanas após o transplante subcutânea de HCT-116
miR-211 e HCT-116 células em ratos pelados, HCT-116
miR-211 desenvolvido em tumores com um peso médio de 0,592 g, enquanto as células HCT-116, apenas se formam tumores muito pequenos com um peso médio de 0,028 g. Tendo em contas que HCT-116 e HCT-116
VEC não apresentaram diferenças significativas no comportamento biológico, nossos resultados revelam que miR-211 promove o crescimento do tumor de xenoenxertos
in vivo
(Fig. 5 ).
Curiosamente, a regulação negativa de CHD5 por miR-211 impactos do fenótipo da linhagem celular colorrectal afectando a expressão de proteínas da via relacionada com a p53 (Fig. 6C e D). p53 é um dos supressores de tumor mais estudados e mais de 50% dos tumores humanos são portadores de mutações de perda de função [23]. p53 suprime a tumorigénese através da indução de programas de células-ciclo-paragem ou apoptose em resposta a uma variedade de sinais de estresse celular diferentes [24]. A função supressora de tumores de p53 também inclui outros mecanismos, incluindo vias metabólicas que regulam [25]. CHD5 parece modular carcinogénese através de uma via relacionada com a p53 [7]. Em nosso estudo, descobrimos que a regulação positiva de miR-211 em HCT-116 células resultou na regulação negativa da CHD5, afetando a expressão de várias proteínas da via regulada por p53, incluindo MDM-2, p53 e Bax. O nível de Mdm-2, um regulador negativo da p53, foi aumentada, enquanto os níveis de p53 e do seu gene alvo, Bax, foram reduzidos, indicando que a deficiência CHD5 compromete vias regulada por p53 e facilita a tumorigénese. O fenótipo maligno das células HCT-116 foi aumentada por sobre-regulação de miR-211 e o aumento da proliferação e migração de células HCT-116 pode ser envolvido alterações subsequentes em vias relacionadas-p53. serão necessários mais estudos para determinar se a sinalização relacionada com a p53 é o único alvo para miARN-211 regulação da CHD5.
Tomados em conjunto, a expressão aberrante de miR-211 e subsequente alteração no nível de CHD5 estão associados com tumorigénese colorectal. Os nossos resultados demonstram que a expressão forçada de miR-211 na linha celular de cancro colorrectal HCT-116 aumentou o fenótipo maligno das células por regulação negativa directamente a expressão do CHD5 e pode ser por modulação de vias relacionadas-p53. Especificamente, executada expressão de miR-211 promoção reforçada e migração, apoptose reduzida, acelerou a transição de G0 /G1 para a fase S
in vitro
e proliferação reforçada
in vivo
. No entanto, uma vez que um único miRNA pode modular diversos alvos diferentes das outras funções possíveis de miR-211 no cancro colorectal precisam ser melhor estudados. Além disso, mais estudos são necessários para validar a relação entre o miR-211 e CHD5 no desenvolvimento do cancro colorectal humano e prognóstico. Nosso estudo fornece uma melhor compreensão da capacidade reguladora do miR-211 na promoção tumorigênese colorretal, visando a expressão CHD5.
Materiais e Métodos
As linhas celulares e cultura
Dois pontos humanos linhas celulares de cancro (RKO e HCT-116) e uma linha celular de rim embrionário humano (HEK293T) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Foram utilizados dois CHD5-Sens e CHD5-antisens forçado expressão estabelecidos de forma estável linhas de células RKO (CHD5 regulada linha de células RKO-S e seu anti-sense RKO-AS) [26]. As células RKO foram cultivadas em MEM e RKO-S e células RKO-AS foram cultivadas em MEM contendo 900 ug /ml de G418. As células HCT-116 foram cultivadas em meio de McCoy 5A (ATCC). células HEK293T foram cultivadas em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco, EUA). Todos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal bovino e 1% de Penicilina /Estreptomicina, e todas as linhas de células foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO
2 e 95% de humidade.
A identificação de alvos de microRNA
Os algoritmos de Miranda (https://www.sanger.ac.uk), PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu) e TargetScan (http: //www.targetscan. org /) foram utilizados para prever quais miARNs humanos podem ligar-se a 3′-UTR de CHD5 (ID Gene 26038). Resumidamente, esses algoritmos fornecer alinhamentos 3′-UTR com os locais previstos e links para vários bancos de dados públicos para a predição de locais de ligação de miRNA.
extração de miRNA e RT-PCR quantitativo
O RNA total foi extraído utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, EUA). Um miR-211 para a frente de iniciadores (5′-TTCCCTTTGTCATCCTTCGCCT-3 ‘) foi sintetizado na Sigma (Woodlands, TX). O RNA total foi poliadenilado por poli polimerase de
E. coli
, e então a síntese de ADNc de primeira cadeia e PCR quantitativa foram realizados com a especificidade de alta-kit de miARN QRT-PCR de detecção (Stratagene, La Jolla, CA). reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada num instrumento Mx3000P ™ (Stratagene Laboratório), com U6 como um controlo interno devido à sua expressão estável em tecidos humanos e linhas celulares, tal como sugerido pelo fabricante e outros investigadores [27]. Foi utilizado o método comparativo ciclo limiar (Ct) para medir mudanças relativas de expressão miRNA. TC é o número do ciclo no qual o sinal de fluorescência da amplificação trama passa um limiar fixo. ΔCt = Ct (o miR-211) -Ct (U6), ΔΔCt = ΔCt (vector) -ΔCt (miR-211). valor da expressão vezes = 2
-ΔΔCt. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. Um controlo negativo sem um modelo foi executado em paralelo para avaliar a especificidade global da reacção.
transfecção estável de miR-211
modificado o vector pLVX-Tight-puro comercial (Clontech, mountain View, CA) com uma cassete de expressão que contém a P
promotor de CMV, EGFP, miARN ligante, e pré-miR-211, substituindo o P
promotor apertado [28]. O ligante miARN continha um local de clonagem múltipla. A sequência de cadeia dupla pré-miR-211 foi concebido com base em miRBase Sequência de banco de dados versão 12.0. Os vectores construídos foram verificados por sequenciação de ADN. As partículas lentivirais recombinantes contendo o vector de miR-211 ou o vector de controlo de EGFP foram transfectados em células de empacotamento HEK 293T utilizando o sistema de embalagem lentiphos HT ™ e seguindo as instruções do fabricante (Clontech, Mountain View, CA). As células HCT-116 foram cultivadas até 70-80% de confluência em placas de 6 poços e infectadas com 200 ul de lentivírus que contêm o vector de miR-211 ou o vector de controlo, durante 2 h. Depois, 2 ml de meio de McCoy 5A com 10% de FBS foi adicionado a cada poço. Após 48 h, as células infectadas foram seleccionadas com meio fresco contendo 5 ug /ml de puromicina para 4-5 passagens. As linhas celulares que expressam de forma estável, quer o miR-211 ou o vector de controlo foram geradas e as células infectadas podem ser vistas sob um microscópio de fluorescência.
repórter luciferase ensaio
Um ensaio de repórter de luciferase foi usado para verificar que a sequência complementar de miR-211 liga-se à 3′-UTR do mRNA CHD5. Um fragmento de ARNm CHD5, que incluiu local de ligação de miR-211 foi clonado no vector repórter de luciferase pHCMV-FSR (Genlantis, San Diego, CA). células HEK 293T foram semeadas numa placa de 24 poços de modo a que eles estavam 50% confluentes no momento da transfecção. O vector repórter de luciferase e o vector de controlo de GFP ou o miR-211 vector de expressão foram co-transfectadas em células HEK 293T utilizando precipitação com fosfato de cálcio. A actividade de luciferase foi medida em células vivas após 48 h de acordo com o protocolo do fabricante utilizando imagiologia de bioluminescência com um instrumento Xenogren IVIS (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
3- (4, 5-dimetiltiazol-2- il) 2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT)
Um ensaio de MTT foi realizado como anteriormente descrito [29]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade inicial de 5.000 células /poço. Após 72 h, a 200 ul de solução de MTT (5 mg /mL, Sigma, St. Louis, MO) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 4 h a 37 ° C. O sobrenadante foi em seguida descartado, e 200 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado a cada poço para dissolver o precipitado. Após 30 min à temperatura ambiente as placas foram digitalizados espectrofotometricamente com um leitor de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA) ajustado a 560 nm para medir a absorvância. Cada teste foi repetido em cinco poços.
Colónia ensaio de formação de
Um ensaio de formação de colónias foi realizada como previamente descrito [29]. Resumidamente, HCT-116
vec células HCT-116 e miR-211 foram plaqueadas em placas de 6 poços de cultura de tecidos (Palo Alto, CA). Quinhentos células HCT-116
VEC e HCT-116
miR-211 foram semeadas em cada poço em triplicado, incubadas por 10 dias, e as colónias foram coradas com 0,1% de azul de tripano em 50% de etanol. As colónias contendo 50 ou mais células foram contadas como células clonogénicas viáveis. Pelo menos duas experiências independentes foram executadas.
ciclo celular ensaio
análise do ciclo celular foi realizada como previamente descrito [29]. Resumidamente, HCT-116
vec e HCT-116
miR-211 células na fase logarítmica de crescimento foram recolhidas e fixadas com etanol frio a 75% e armazenadas a -20 ° C durante 24 h. Depois o etanol foi removido, as células foram incubadas com 1 mg /ml de RNase A em PBS durante 30 min à temperatura ambiente, e, em seguida, as células foram incubadas mais 30 min no escuro em 0,5 ml de 50 mg /ml de iodeto de propídio. A distribuição de células ao longo do ciclo celular foi analisada por Becton-Dickinson FACScan, e histogramas de ADN foram analisadas com o software modificado. Cada teste foi repetido em triplicado.
O ensaio zero
Resumidamente, uma área aberta ou ‘scratch’ foi produzido em 90% HCT-116 monocamadas de células
miR-211 usando um 200 ponta da pipeta ul, como descrito anteriormente [30]. As células HCT-116
miR-211 foram lavadas com PBS para remover as células deslocadas na área aberta, e cultivadas em 5A de McCoy por vezes designadas. HCT-116
vec foram igualmente tratadas e cultivadas em 5A de McCoy. Migração para a área aberta foi observada a olho nu.
análise de Western blot
HCT-116
VEC e HCT-116
células miR-211 foram lavadas com PBS frio e lisadas em tampão de lise RIPA em gelo durante 30 min.