Sumário
de proteína relacionada com a hormona paratireóide (PTHrP) possui uma variedade de funções fisiológicas e de desenvolvimento e também é conhecida por facilitar a progressão de diversos tipos de cancro comuns, em particular a sua invasão esquelético, principalmente através do aumento da reabsorção óssea. A finalidade deste estudo foi determinar se poderia promover PTHrP epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), um processo implicado no cancro de células estaminais que é criticamente envolvidos na invasão e metástase do cancro. EMT foi observada em DU 145 células de cancro da próstata que sobre-expressam de forma estável, quer a 1-141 ou 1-173 isoforma de PTHrP, onde havia regulação positiva de Snail e vimentina e regulação negativa de E-caderina em relação ao DU parental 145. Por outro lado, o efeito oposto foi observado em células cancerosas PC-3 da próstata, onde altos níveis de PTHrP foram knocked-down via de transdução de siRNA lentiviral. O aumento da progressão do tumor foi observada em células que sobre-expressam DU 145 PTHrP enquanto que diminuiu a progressão foi observada em células PC-3-knockdown PTHrP. PTHrP que sobre-expressam DU 145 formado tumores maiores quando implantados orthoptopically em ratinhos nus e em um caso resultou na metástase espinal, um efeito não observado entre os ratinhos injectados com células DU 145 parentais. células DU 145-superexpressão PTHrP também causou destruição óssea significativa quando injetadas em tíbias de ratos nus, enquanto as células DU 145 parentais causou pouca ou nenhuma destruição do osso. Juntos, estes resultados sugerem que PTHrP pode funcionar através de EMT para promover um fenótipo metastático agressivo e no cancro da próstata, uma via de importância em cancro de células estaminais. Assim, continuou os esforços para elucidar as vias envolvidas no EMT induzida por PTHrP, bem como para desenvolver formas de atingir especificamente sinalização PTHrP podem levar a terapias mais eficazes para o câncer de próstata
Citation:. Ongkeko WM, Burton D, Kiang Um, Abhold E, Kuo SZ, Rahimy E, et al. (2014) Paratormônio proteína relacionada com Promove epitelial-a-mesenquimal Transição em câncer de próstata. PLoS ONE 9 (1): e85803. doi: 10.1371 /journal.pone.0085803
editor: Seema Singh, University of South Alabama Cancer Institute Mitchell, Estados Unidos da América
Recebido: 21 de junho de 2013; Aceito: 02 de dezembro de 2013; Publicação: 22 de janeiro de 2014
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Financiamento:. Award Administração de Veteranos Mérito (LJ Deftos) apoiaram este projecto (https://www.research.va.gov/services/csrd/merit_review.cfm # .UcI2KPY-UCG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores gostariam de declarar que, apesar de Robert M. Hoffman é filiado ao AntiCancer, Inc., não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados e todos os autores declaram não haver conflito de interesses.
Introdução
paratireóide proteína relacionada ao hormônio (PTHrP) possui uma variedade de fisiológico e funções de desenvolvimento, mas também é conhecido para facilitar a progressão de diversos cancros, incluindo o cancro da próstata. Nós e outros autores mostraram anteriormente que PTHrP estimula o crescimento celular do cancro da próstata, metástase e invasão, operando através de ambas as vias parácrinos e autócrinos /intracrine [1] – [3]. PTHrP é conhecida para activar uma variedade de vias mitogénicas incluindo a MAPK e PI3K /Akt, bem como vias que estimulam a metástases ósseas, uma das patologias que ameaçam a vida mais comuns associados com o cancro [4] – [6] .Secreted PTHrP é conhecido por medeiam os seus efeitos celulares através da interacção com o receptor de proteína G acoplado a PTH /PTHrP [7]. A co-expressão de PTHrP e o seu receptor tenha sido previamente identificadas em tumores de cancro da próstata primários e suas metástases ósseas correspondentes [8]. Além disso, Freemont et al anteriormente relatado um aumento na expressão de receptor de PTHrP na próstata metástases ósseas do cancro, em comparação com tumores primários, sugerindo um papel potencial da via mediada pelo receptor na formação de metástases ósseas [9].
epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) é um processo em que as células epiteliais sofrer alterações do citoesqueleto e morfológicas de adquirir um fenótipo mesenquimal e é importante em processos normais tais como fibrose [10]. Devido aos seus efeitos na adesão celular e mobilidade EMT também é criticamente envolvida na metástase e invasão [11] do cancro, [12]. EMT pode ser caracterizada pela perda de marcadores epiteliais, tais como a E-caderina e aumento da expressão de proteínas mesenquimais incluindo vimentina e N-caderina [13]. Os fatores de transcrição Snail, Slug e torção são conhecidos para reprimir a expressão da caderina-E e induzir EMT [14] – [16]. Outras vias oncogénicos incluindo Src, Ras, Wnt /β-catenina, PI3K /Akt, MAPK, e TGF-β foram todos ligados para EMT [17]. Vários estudos têm mostrado que as células do cancro tornam-se mais invasivo e metastático depois de submetidos a EMT. Além disso, EMT tem sido demonstrado para conferir propriedades de células estaminais para células de cancro da mama [18].
Dado que PTHrP tem um papel na promoção da invasão e metástases no cancro da próstata e que EMT é um dos principais reguladores de estas propriedades no cancro, a pergunta crucial é apresentado se PTHrP é capaz de promover EMT em células cancerosas. PTHrP foi mostrado para induzir EMT em alguns contextos, incluindo durante a formação da endoderme parietal e fibrogénese renal [19], [20], embora a capacidade de PTHrP para regular EMT no cancro permaneceu não investigada. No cancro da mama, os efeitos pró-metastáticos de TGF-β, um potente indutor de EMT, tem sido mostrado para ser mediada por PTHrP [21]. Tomados em conjunto, a literatura existente sugere que a regulação da EMT por PTHrP no câncer é altamente provável. Neste estudo procurou-se determinar o papel do PTHrP na regulação EMT em células de cancro da próstata, juntamente com a invasão e metástases. Estabelecer um papel de PTHrP na regulação câncer metástase óssea e EMT fornece ambas as lógicas básicas e clínicas para elucidar o mecanismo molecular das ações de PTHrP em muitos cancros comuns, como próstata.
Declaração de Ética Materiais e Métodos
O VA IACUC aprovou este estudo. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publicação Número 85-23) sob o número de garantia de A3873-01. Os animais foram mantidos sob anestesia de isoflurano durante a cirurgia, e todos foram feitos esforços para minimizar o sofrimento. Estes animais foram cuidadosamente observados, verificados diariamente e sacrificados aos primeiros sinais de desconforto. Sinais de desconforto incluir quaisquer movimentos anormais, de alimentação ou de beber comportamentos anormais, falta de auto-limpeza ou quaisquer outros comportamentos anormais.
Células
As linhas celulares de cancro DU 145 e PC-3 da próstata humana e foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em monocamada em meio RPMI 1640 (MediaTech, Herndon, VA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Gemini Bio Products, Woodland, CA) a 37 ° C numa incubadora humidificada com 95% de ar, 5% de CO
2. A linha celular DU 145 foi seleccionado porque tem uma expressão baixa PTHrP constitutiva e não cresce ou metastizar bem em modelos de tumor de rato, em contraste com as células PC-3 [22] – [24]. A linha de células PC-3, que foi originalmente isolado a partir de um adenocarcinoma da próstata que tinha metastizado para o osso, tem um fenótipo osteolíticas nos modelos de ratinhos imunocomprometidos [22], [25].
construção do plasmídeo
Os plasmídeos de expressão PTHrP utilizados neste estudo eram humanos prepro PTHrP1-87, PTHrP1-141 e PTHrP1-173; as formas prepro foram usadas para facilitar a secreção de PTHrP. As construções foram subclonados direccionalmente no vector de expressão pCI-neo (Promega, Madison, WI) e os fidelidades de todos os plasmídeos foram confirmadas por sequenciação de ADN e PTHrP imunoensaios específicos do local [23], [26].
transfecção PTHrP e silenciamento
mediada por lentivírus
As células da próstata DU 145 foram semeadas a uma densidade de 2 × 10
4 células /cm
2 em 12 poços pratos de cultura de células e transfectadas com 1 ug plasmídeo por poço. colónias individuais resistentes a G418 (800 ug de G418 /mL) foram isoladas 21-30 dias mais tarde. Os meios condicionados a partir das colônias de células colhidas foram avaliadas para a expressão PTHrP por imunoensaios específicos do local e do PTHrP expressando células DU145 estáveis foram expandidas [23], [26]. Foi previamente mostrado que a do tipo selvagem e transf ectadas com o vector de DU 145 apresentam um fenótipo semelhante [27], [28]. Tipo selvagem células DU 145 parentais assim foram utilizados como um controlo para RT-qPCR e experiências de invasão de matrigel, no entanto as experiências foram realizadas em paralelo com um derivado de controlo transfectadas com vector vazio. As células da próstata PC-3 foram submetidos a um knockdown estável de PTHrP via siRNA lentiviral. As células de controlo foram submetidos a transdução de siRNA lentiviral com uma construção sequência não-alvo.
quantitativa transcrição reversa PCR
As células foram colhidas dois dias depois de ser passadas a cerca de 70-80% de confluência. lisado celular total foi recolhido e o ARN foi extraído usando um kit RNeasy (Qiagen). O ADNc foi sintetizado utilizando Superscript III Transcriptase Reversa (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Em tempo real misturas de reacção de PCR foram preparadas utilizando a energia SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA), e é executada no 7300 Real-time PCR System (Applied Biosystems) utilizando o seguinte programa: 95 ° C durante 10 min, 95 ° C durante 30 s, e 60 ° C durante 1 min, durante 40 ciclos. Os resultados foram analisados usando o método comparativo DDCT e curvas de fusão foram realizados para assegurar a especificidade do produto. As experiências foram efectuadas em triplicado técnicos e foram repetidas pelo menos duas vezes de forma independente. a expressão do gene de GAPDH foi medida como controlo endógeno. Os iniciadores foram encomendados (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL) usando as seguintes sequências:
Snail directo 5′-TCTGAGTGGGTCTGGAGGTG-3 ‘, 5′-CTCTAGGCCCTGGCTGCTAC caracol reversa-3′, 5’-GAPDH Adiante CTTCGCTCTCTGCTCCTCC -3 ‘, 5′-GAPDH reversa CAATACGACCAAATCCGTTG -3′, E-caderina directo 5’-GGCGGAGAAGAGGACCAGGACT-3 ‘, E-caderina reverso 5′-TGGCAGGGCGGGGAAGATACC-3′, 5’-vimentina Adiante GGAAATGGCTCGTCACCTTCGT-3 ‘, reverso vimentina 5’-AGAAATCCTGCTCTCCTCGCCT-3 ‘.
imunofluorescência
As células foram tripsinizadas e cultivadas em lamelas. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e bloqueadas em soro de cabra em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, à temperatura ambiente, antes da incubação com o anticorpo monoclonal de ratinho para vimentina anti-humano (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). As células foram então incubadas com um anticorpo secundário conjugado de cabra anti-ratinho-FITC (Chemicon, Temecula, CA) e contrastadas com DAPI. Finalmente, SlowFade ouro antifade reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi usado para montar a tampa desliza para lâminas. As imagens fluorescentes foram obtidos em Leica 40X usando DMIRE2 microscópio de fluorescência invertido e um programa de computador simples PCI foi utilizado para captura de imagem.
células Matrigel Invasão Ensaio
Invasão de PC3 e DU 145 foi medida utilizando um Matrigel ensaio de invasão (Becton Dickinson, Bedford, MA). Transwell inserções de tamanho de poro 8 foram revestidas com uma concentração final de 1 mg /ml de Matrigel em meio DMEM isento de soro frio. As células foram tripsinizadas, e 500 ml de suspensão de células (1 x 10
5 células /mL) foram adicionadas em cavidades triplicadas. A câmara inferior do Transwell foi preenchida com 750 ul de meio de cultura contendo 0,5% de soro como um quimioatractor e deixada a incubar a 37 ° C durante 48 horas. Invadir as células na superfície inferior que passaram através do filtro foram fixadas e coradas com violeta de cristal em gluteraldeído e fotografada. O número de núcleos corados foi contado em uma seção pré-determinada e consistente de cada poço.
Animais
macho de seis meses de idade, os ratos Imunodeficiência Combinada Grave (SCID) foram alojados em uma barreira sala de filtro e alimentados Purina roedores ad lib ração. Os animais foram sangrados no final do estudo, utilizando um método de retro-orbital.
Tumor ortotópico Implantação
subconfluentes DU145 e estavelmente transfectadas DU145 PTHrP-(1-173) -GFP células foram recentemente tripsinizadas, contadas e colocadas em gelo imediatamente antes da injecção. Os ratinhos foram injectados com 10
6 células espaço subcutâneo do flanco do animal num volume total de 0,25 ml de soro RPMI 1640 livre. Os ratos foram sacrificados para a colheita de tecido tumoral 4 semanas após as injecções de células de tumor. fragmentos de tumor (1 mm
3) foram preparadas de fresco a partir de tumores subcutâneos e implantadas na próstata lobo lateral de outro ratinho SCID (22-24). Os 1 mm
3 fragmentos de tumores foram dissecados, medidos com compassos de calibre, e pesado para assegurar a quantidade exacta de tumor de partida, foi usado para cada animal. A cápsula da próstata foi exposto a seguir uma linha de incisão abdominal média inferior e um fragmento de tumor foi inserido no interior da cápsula. A cápsula da próstata foi então fechada com uma sutura cirúrgica 8-0 e a incisão na parede abdominal foi fechada com uma sutura cirúrgica 6-0 em uma camada [29].
Os animais foram mantidos sob anestesia de isoflurano durante cirurgia. Todos os procedimentos da operação descrita acima foram realizadas com um microscópio de ampliação 7 X. Os ratinhos foram avaliados 60 dias após o implante do tumor para a progressão do tumor e metástases por fluorometria e para anormalidades esqueléticas por raios-X. imagiologia de alta ampliação dos tumores de expressão de GFP foi realizada com um estereomicroscópio fluorescente Leica, modelo LZ12, equipado com uma imagem de 50 W lâmpada de mercúrio e todo o corpo foi levada a cabo numa caixa de luz iluminado por azul de luz de fibra óptica (Research Lightools , Encinitas, CA) e fotografada usando um termoeletricamente arrefecida câmera CCD de cor (Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ).
intra-ósseos Injeções
Para avaliar o efeito da PTHrP no crescimento do câncer de próstata nos ossos, usamos um modelo intra-tibial de próstata metástase do cancro de osso (1, 24). Foram estudados cinco tipos de GFP expressando estavelmente transfectadas células DU145: (1) tipo selvagem, (2) Vector (pCI-neo), (3) PTHrP (1-87), (4) PTHrP (1-141) e ( 5) PTHrP (1-173) células transformadas. Os ratinhos foram injectados com 10
6 células em 15 ul de PBS estéril para a medula óssea da tíbia proximal direito, utilizando uma agulha de calibre 26 e uma seringa de vidro de Hamilton. A tíbia esquerdo serviu como controlo negativo. Os ratos foram avaliados 60 dias após as injeções intra-ósseas para anormalidades esqueléticas por raios-X [24]. Raios-X do esqueleto foram expostos com 40 keV por 20 segundos em um gabinete de raios-X série 5000 Faxitron e filmes Kodak X-Omat TL foram processados em um processador de filme Kodak. Para imagens de maior resolução das anormalidades ósseas, foi utilizado um GE explorar Micro CT (GE Healthcare).
PTHrP Immunoassay
Os extractos celulares e PTHrP media foram medidos por RIA baseado em PTHrP (1- 34), de PTHrP (38-64), e PTHrP (109-141), como descrito anteriormente [30]. Todas as amostras foram ensaiadas em várias diluições e em triplicado.
Análise estatística
Todas as experiências foram realizadas em triplicado e as barras representam erros desvio padrão. A significância estatística foi testado utilizando um duas amostras teste t independente (2 caudas de teste) com o limiar fixado em
P
. 0,05
Resultados
PTHrP superexpressão Promove expressão de Marcadores mesenquimais
Para estudar regulação de EMT, PTHrP foi super-expresso de forma estável em DU 145, uma linha de células de cancro da próstata com baixa expressão PTHrP basal, como determinado por imunoensaio (Figura 1A). Dois clones foram criados, com uma sobre-expressam a isoforma de 1-141 PTHrP e a outra que sobre-expressam a isoforma de 1-173 (Figura 1B). Ambos os clones de marcadores apresentado EMT, que expressam os níveis mais elevados, nomeadamente das proteínas mesenquimais caracol e vimentina e níveis mais baixos de E-caderina em relação ao DU parental 145, conforme determinado por qRT-PCR (Figura 1B). Após a superexpressão estável de full-length PTHrP- (1-173) em DU 145, vimentina e mRNA caracol expressão foram elevados por 115 e 6,82 vezes, respectivamente, enquanto que a expressão da caderina-E diminuiu comprovadamente até 2080 vezes. Da mesma forma, a sobre-expressão estável de PTHrP- (1-141) aumentou vimentina e expressão de ARNm de caracol de 23,5 e 3,88 vezes, respectivamente, e a diminuição da expressão de E-caderina de 12,3 vezes. Os dados são mostrados com o derivado parental de tipo selvagem como um controlo. Numa experiência paralela, as células DU 145 que sobre-expressam PTHrP demonstrou uma indução de dobragem de caracol 6,06 e 9,68 diminuição na expressão de E-caderina, em comparação com o vazio transfectadas com vector derivado de DU 145 (dados não apresentados). A indução de EMT é verificada por meio de um ensaio de imunof luorescência. Overexpressions de ambas as isoformas de PTHrP demonstram uma diminuição da E-caderina com um aumento na expressão da proteína vimentina (Figura 1C).
A) A quantificação dos níveis da proteína PTHrP no controle e que sobre-expressam PTHrP DU 145 células por imunoensaio. B) expressão de mRNA de PTHrP e EMT marcadores no controle e células DU 145-superexpressão PTHrP. C) imagens de imunofluorescência confirmando a superexpressão de PTHrP, a regulação positiva de vimentina e regulação negativa da E-caderina em células DU 145-superexpressão PTHrP.
PTHrP Knockdown reduz a expressão de marcadores mesenquimais
Para demonstrar ainda mais a regulação da EMT por PTHrP no cancro da próstata, PTHrP permanente knockdown via de transdução retroviral foi realizada em PC-3, uma linha celular de cancro da próstata com elevada expressão basal PTHrP como determinado por imunoensaio (Figura 2A). Em células PC-3-Kd, expressão de PTHrP foi reduzida para 15% do controlo por PC-3 (Figura 2B), enquanto que os níveis de Snail e vimentina foram regulados negativamente por 3,03 e 3,73 vezes, respectivamente, e E-caderina expressão foi elevada por 2,30 vezes (Figura 2B). A alteração na expressão da proteína EMT é demonstrado com um ensaio de imunofluorescência. Derrubando PTHrP regula negativamente vimentina e regula positivamente a E-caderina, o que confirma os dados qPCR (Figura 2C). Em conjunto com a figura 1, estes dados sugerem que a actividade ou a expressão PTHrP promove EMT no cancro da próstata.
A) A quantificação dos níveis da proteína PTHrP no controle e PC-3 de células PTHrP-knockdown por imunoensaio. B) expressão de mRNA de PTHrP e EMT marcadores no controle e células PC-3 PTHrP-knockdown. C) imagens de imunofluorescência confirmando a superexpressão de PTHrP a regulação positiva de vimentina e regulação negativa da E-caderina em células PC-3 de controlo e PTHrP-knockdown.
PTHrP Regulamenta a invasão e regulação positiva de MMP-9
a fim de estabelecer que a activação dos resultados PTHrP EMT ou no aumento da capacidade de invasão no nosso sistema experimental, um ensaio de invasão de matrigel foi realizado para determinar a capacidade de invasão relativa de DU-145 PTHrP (1-141), DU-145 PTHrP (1-173), e células PC-3-KD em comparação com os respectivos controlos. DU-145 PTHrP (1-141) e DU-145 PTHrP (1-173) foram encontradas células de 3,0 (p 0,01) e 2,9 (p , 05) vezes mais invasiva do que as células parentais DU 145, respectivamente ( Figura 3A). Enquanto isso, as células PC-3 kD foram encontrados para ser apenas 0,5 vezes (p 0,01) como invasivos como células PC-3 parentais (Figura 3B). Numa experiência paralela, PTHrP- (1-141) e – (1-173) células DU 145 demonstrou um 2,0 (p 0,5) e 2,1 vezes (p 0,05) aumento na invasão de matrigel, em comparação com o vetor vazio DU 145 transfectadas derivado, respectivamente (dados não mostrados). Por último, a sobre-expressão em PTHrP DU 145 foi observada para regular positivamente a expressão de MMP-9 foi de 17,1 e 7,10 vezes em PTHrP- (1-141) e PTHrP- (1-173) expressa derivados, respectivamente, enquanto knockdown no PC-3 downregulated MMP-9 em 25,1 vezes (Figura 3C).
a) ensaio de invasão de Matrigel mostrando aumento na invasão de células DU145 cima sobre-expressão de ambos os PTHrP 1-141 ou 1-173. B) ensaio de invasão de Matrigel com diminuição na invasão de células PC3 em cima do knockdown de PTHrP. níveis C) de ARNm de MMP-9 em células que sobre-expressam DU145 PTHrP, PTHrP células PC3-knockdown em relação aos seus respectivos controlos. * Indica p 0,05, ** indica p . .01
PTHrP Promove crescimento do tumor e osso destruição em um /intra-óssea do rato modelo ortotópico
DU 145 e DU 145- (1-173) PTHrP células foram estavelmente transfectadas com um plasmídeo de expressão da GFP e foram implantadas ortotopicamente na cama da próstata de ratos pelados ou directamente no osso, tal como anteriormente descrito (1). Apesar de todos os tumores de ratos formado, os implantados com DU-145 PTHrP (1-173), as células formaram tumores significativamente maior em comparação com os injectados com células normais DU 145. Imagens representativas mostram grande massa do tumor em ratinhos injectados com DU-145 PTHrP (1-173) em relação a células de ratinhos injectados com parental DU 145 (Figura 4A). Além disso, as metástases para a coluna vertebral foi observada em um dos ratinhos injectados com 145 DU-PTHrP (1-173), enquanto não há ratinhos injectados com metástases formadas DU 145 (Figura 4B). DU 145 ou DU células 145-vetor formado nenhum tumor quando injetadas em ratos tíbias enquanto DU 145-PTHrP (1-141) ou DU 145-PTHrP (1-173) células injetadas em camundongos tíbias resultou na formação de tumores, invasão e destruição de osso (Figura 5), confirmando o papel bem estabelecido do PTHrP na reabsorção óssea. Finalmente, a expressão do PTHrP na tumores foram confirmados por imuno-histoquímica (Figura 5B).
A) modelo de ratinho ortotópico mostrando um rato injectado com células DU145-GFP. B) do rato injectado com DU 145-PTHrP (1-173) células. C) A prova da destruição óssea em camundongos injetados com (1-173) células 145-PTHrP DU. D) metástase Spine em um rato injectado com (1-173) células 145-PTHrP DU.
A) de raios X e UCT Imagens que mostram o efeito da PTHrP superexpressão na destruição óssea em um mouse intra-óssea modelo. Tíbia de ratos que receberam PTHrP-superexpressão DU 145 exibida destruição significativa do osso em relação ao controle. B) O tumor da próstata DU 145-GFP-PTHrP1-173 foi removido a partir do ratinho, fixadas e coradas imuno-histoquimicamente para PTHrP usando um sistema de biotina com peroxidase de rábano-estreptavidina (produto de reacção castanho indica expressão PTHrP).
Discussão
Nós identificamos PTHrP não apenas como um mediador fundamental para a progressão do tumor no câncer de próstata, mas também como promotor da EMT. Enquanto PTHrP foi mostrado para induzir EMT em desenvolvimento [10], [31], a nossa observação de que ele promove EMT no cancro assim continua a ser uma nova descoberta. Esta descoberta implica que PTHrP pode ter um papel ainda mais significativo na progressão do câncer do que se acreditava anteriormente, uma vez que a capacidade de regular EMT implica o potencial para regular uma variedade de propriedades relacionadas com a progressão do câncer, incluindo invasão, metástase, cell-motilidade, de adesão celular , angiogênese e stemness /tumorigenicidade [11], [18], [32] – [34]. O prognóstico para o câncer de próstata avançado continua pobre devido a metástases ósseas frequente e invasão [35], [36]. Assim, o alvo da PTHrP pode levar a terapias mais eficazes para o cancro da próstata.
Nossos dados mostraram que PTHrP superexpressão em DU células 145 induzida EMT e promoveu a invasão, tumorigenicidade e metástase, enquanto PTHrP knockdown em células PC-3 induzidos efeitos contrários. Além disso observou-se que a linha de células PC-3 tem elevada expressão basal por PTHrp, conforme determinado por imunoensaio e PTHrP é inerentemente mais invasiva e metastática DU em comparação com 145, que tem uma baixa expressão basal PTHrP. Estas observações postular que PTHrP não só pode facilitar a metástase através da promoção da reabsorção óssea, mas pode também ser um regulador importante do fenótipo agressivo no cancro da próstata. Ambos 1-141 e 1-173 isoformas de PTHrP foram encontrados para promover EMT, consistente com o facto de o sítio activo clássica está localizado perto do terminal amino como mostrado por estudos anteriores [37]; No entanto, os péptidos processados por PTHrp adicionais podem também ser mediadores importantes da presente acção. Segmentação todas as isoformas de PTHrP para a terapia anti-câncer pode necessário, embora a segmentação do 1-141 isoforma pode ser de primordial importância, uma vez que representa a maioria de expressão PTHrP em seres humanos.
alvos a jusante que são ativados pela PTHrP incluem caracol, AP-1, CREB, ERK1 /2, VEGF, PI3K /Akt e a Ciclina D1 [20], [38] – [45]. Caracol promove EMT através da repressão da transcrição direta de E-caderina [15]. CREB regula positivamente VEGF que por sua vez promove EMT, invasão e angiogênese [46], [47]. A via PI3K /Akt é um regulador chave da proliferação das células e também tem sido demonstrado induzir EMT em uma variedade de cancros [48]. AP-1 mostrou estar envolvida na EMT induzida por TGF-β [49]. A sobre-expressão de ciclina D1 foi mostrado para induzir a invasão de glioma, aumentando a actividade de metaloproteinase e motilidade das células [50]. estudos dominantes mostram que PTHrP, TGF-β, EGF e VEGF cooperar através de activação de ERK1 /2 para induzir EMT durante fibrogénese renal [19], e que Snail é um alvo precoce imediato do PTHrP na formação parietal endoderme murino [20]. Um ou uma combinação destas vias é provável para explicar a indução da invasão de EMT e que foram observados nas nossas experiências, nas quais foi confirmada a indução de Snail por PTHrP. Embora tenha sido demonstrado anteriormente que PTHrP é capaz de regular positivamente caracol transcrição na ausência da síntese de proteínas Novo de [20], ainda não está claro se este efeito é através de ligação directa para o promotor do caracol ou através da activação de vias de sinalização, tais como Akt que são conhecidas por regular o caracol. De qualquer maneira, seriam necessários mais estudos para confirmar o mecanismo de EMT induzida por PTHrP no cancro da próstata.
É possível que várias outras vias dependem PTHrP para promover EMT, invasão e metástase. TGF-β, um potente indutor de EMT, tem sido demonstrado em cancro da mama para promover a expressão PTHrP, resultando na destruição de osso [21]. Vários oncoproteínas Ras incluindo, Tpr-Met, Src têm sido mostrados para segmentar PTHrP e também provaram papéis em EMT, invasão e metástase [51] – [53]. De particular interesse seria hedgehog indiana, que é conhecido por regular PTHrP durante óssea precoce e o crescimento da cartilagem [54], [55]. Os membros da família hedgehog são aberrantemente activadas numa variedade de cancros, incluindo cancro da próstata, têm sido mostrados para promover indirectamente EMT, e são teoricamente ter um papel na transformação de células estaminais adultas em células estaminais do cancro [56] – [59] . Seria interessante determinar se Ihh depende de PTHrP para indução de EMT e outras propriedades malignas do câncer.
A pesquisa em curso continua a reforçar a teoria de que as células-tronco cancerosas são os principais motores de progressão do câncer e principais determinantes da resposta terapêutica [60]. Assim, uma questão importante a considerar é se PTHrP pode regular as células-tronco do câncer de próstata através de uma via mediada por EMT. Como EMT tem sido mostrado previamente para induzir as propriedades das células de haste do cancro [18], segue-se que PTHrP potencialmente deve ser capaz de regular as propriedades das células estaminais no cancro da próstata e, portanto, pode ser um alvo terapêutico útil na prevenção da recorrência e metástase. as células-tronco do câncer de próstata foram previamente isoladas e caracterizadas por um CD44
+ /CD133
+ /α2β1
fenótipo oi [61]. o trabalho futuro deve concentrar-se na capacidade de PTHrP para regular este compartimento no cancro da próstata.
A verificação de que induz PTHrP EMT ao promover a invasão e o crescimento do tumor sugere que os tratamentos que visam PTHrP podem ser utilizados em conjunto com tratamentos convencionais para inibir invasão e metástase no câncer de próstata, especialmente para tumores recorrentes. Temos previamente rastreada uma biblioteca de compostos e identificado diversos que são capazes de inibir a expressão PTHrP e crescimento de células do cancro do pulmão [62]. Seria de grande interesse clínico para estender estes resultados para o cancro da próstata e para determinar se tais medicamentos também são capazes de bloquear EMT induzida por PTHrP e invasão. Enquanto isso, os esforços para caracterizar as vias envolvidas na EMT induzida por PTHrP pode conduzir à elucidação de um papel para PTHrP no desenvolvimento de células-tronco do cancro e para novas terapias que possam melhorar significativamente o prognóstico do cancro da próstata metastizado (1, 57).