Abstract

Ptp4a3

(vulgarmente conhecido como PRL-3) é um membro do enigmática do

Ptp4a

família de proteínas tirosina fosfatases prenilados que são altamente expressos em muitos cancros humanos. Apesar das fortes correlações com a metástase do tumor e mau prognóstico do paciente, não há compreensão muito limitada do papel deste gene família em malignidade. Por isso, criamos um modelo knockout murino segmentadas gene para

Ptp4a3

, o

Ptp4a

membro da família mais amplamente estudado. Camundongos deficientes para o

Ptp4a3

foram grosseiramente normal. Menos machos homozigotos nulo foram observados ao desmame, no entanto, e eles mantiveram uma massa corporal diminuiu. Embora

Ptp4a3

é normalmente associado com câncer em estágio final e metástase, observamos aumento da

expressão Ptp4a3

no cólon de ratos de tipo selvagem imediatamente após o tratamento com o azoximetano cancerígena. Para investigar o papel da

Ptp4a3

em malignidade, foi utilizado o modelo de cancro do cólon associada a colite murina mais comumente estudada. ratinhos de tipo selvagem tratados com sulfato de dextrano e sódio azoximetano desenvolvido aproximadamente 7-10 tumores por rato no cólon distai. O tecido do tumor resultante tinha 4 vezes mais

Ptp4a3

mRNA em relação ao epitélio do cólon normal e aumento da proteína PTP4A3.

Ptp4a3-

ratos nula desenvolvido 50% menos tumores do cólon do que os camundongos de tipo selvagem após a exposição ao Azoximetano e sulfato de sódio dextrano. Tumores do

Ptp4a3

-null ratos tinham níveis elevados de ambos IGF1Rβ e c-MYC em comparação com tumores repletos de

Ptp4a3,

sugerindo uma célula reforçada sinalização engajamento via na ausência da fosfatase. Estes resultados fornecem a primeira evidência definitiva implicando

Ptp4a3

na tumorigênese cólon e destacar o valor potencial da fosfatase como um alvo terapêutico para a doença maligna fase inicial

Citation:. Zimmerman MW, Homanics GE, Lazo JS (2013) Supressão do Metástase-Associated fosfatase

alvejado Ptp4a3

(PRL-3) Suprime o cancro do cólon murino. PLoS ONE 8 (3): e58300. doi: 10.1371 /journal.pone.0058300

editor: Manlio Vinciguerra, University College London, Reino Unido

Recebido: 22 de novembro de 2012; Aceito: 01 de fevereiro de 2013; Publicação: 28 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zimmerman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este foi financiado pelo National Institutes of Health subvenção AA10422 e F31AA019597A comunhão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

proteína tirosina fosfatase-4a3 (

Ptp4a3

), juntamente com

Ptp4a1

e

Ptp4a2

, compreendem a 4a-família de proteína tirosina fosfatases. Esta família de genes modesta é comumente referido como as fosfatases de regeneração do fígado (PRL), devido à descoberta de

Ptp4a1

nas células do fígado em regeneração de ratinhos após hepatectomia parcial [1]. A homologia significativa ( 75% de identidade de aminoácidos) encontrado entre

Ptp4a

membros da família pode denotar enzimologia semelhante, mas todos os três membros da família são conservadas ao longo espécies de mamíferos, sugerindo funções biológicas não redundantes para cada um. O

in vivo

propriedades e funções destas fosfatases enigmáticas permanecem muito mal compreendida.

O interesse em

Ptp4a3

pode ser atribuído ao seu significativo potencial como um biomarcador e como terapêutica alvo para as neoplasias malignas. Muitos cancros humanos expressam níveis elevados PTP4A3 incluindo tumores do cólon [2], da mama [3], ovário [4], fígado [5], estômago [6], e estroma [7], e expressão PTP4A3 elevada, muitas vezes se correlaciona com o aumento invasão tumoral e prognóstico ruim [8]. Além disso, ectópica superexpressão PTP4A3 aumenta a migração de células tumorais e invasão

in vitro

[9]. Embora a prova definitiva que falta,

Ptp4a3

tem sido proposto para modular múltiplas vias de sinalização que envolvem SRC [10], GTPases Rho [9], e PI3K-Akt [11], em várias formas de cancro. A complexidade das alterações das vias vistas quando

Ptp4a3

é sobre-expresso pode também reflectir a sua capacidade para actuar como um fosfatidilinositol 5-fosfatase [12]. Não há relatórios têm demonstrado de forma conclusiva um papel para

Ptp4a3

na fisiologia de células ou tecidos normais.

Azoximetano (OMA) é um pró-carcinogéneo que, quando metabolizado no cólon é mutagénica e dirige a tumorigénese. AOM em combinação com o sulfato de sódio dextrano agente inflamatório (DSS) produz um modelo murino amplamente utilizada que reproduz fielmente malignidades do cólon accionados por condições inflamatórias crónicas, tais como a colite ulcerativa [13]. Diversas vias de sinalização estão implicados na patogénese de cancro do cólon induzido por OMA incluindo KRAS [14], β-catenina [15], c-myc [16], Insulin-like growth factor-1 receptor β (IGF1Rβ) [17], e Transforming Growth factor de β (TGF) [18]. Curiosamente,

Ptp4a3

foi identificado como um alvo de regulamentação direta de TGF sinalização em câncer de cólon [19].

No presente estudo, foi utilizada uma abordagem de segmentação de genes para gerar ratos que faltam

Ptp4a3

e interrogar o papel potencial dos

Ptp4a3

no cólon tumorigênese. exposição AOM aguda aumentou

expressão Ptp4a3

no cólon.

Ptp4a3

-null ratos eram resistentes a tumorigênese cólon implicando este gene na patogênese da doença maligna. Além disso, os tumores derivados de

Ptp4a3

-null ratos overexpresssed o envolvimento câncer IGF1Rβ associado e c-MYC sugerindo destas vias de sinalização oncogênicas.

Resultados

Criação de ratos mutantes Ptp4a3

interrompido o

Ptp4a3

local genómico utilizando o sistema Cre-lox de recombinação específica do local com base na posição dos dois sítios loxP inserido (Fig. 1A e mais em pormenor na Fig. S1) . ratinhos mutantes foram retrocruzados com a estirpe /6J ratinhos C57BL durante pelo menos cinco gerações. O alelo knockout foi criada pelo cruzamento

Ptp4a3-

floxed camundongos com ratos transgénicos que expressam CRE-recombinase conduzido a partir de um promotor geral (EIIA) para recombinar o site de destino e criar camundongos knockout globais [20]. A inserção do sítio loxP 3 ‘destruído um sítio Hind III endógena aumentando o tamanho do fragmento de ADN genómico produzidos por digestão de restrição de 5,6 a 10,2 kb. eliminação subsequente da sequência alvo reduziu o tamanho do fragmento de restrição de 10,2 a 6,4 kb. tamanhos da banda distintas correspondentes a cada alelo são observados quando analisado por hibridação Southern blot com uma sonda de -300 pb correspondente ao exão 6 (Fig. 1B).

A) O

Ptp4a3

floxed alelo foi criado por inserção de locais loxP (setas vermelhas) em torno do exão 2. Esta mutação resultou na ruptura de uma sequência HindIII que aumenta o tamanho do fragmento de ADN produzido por digestão de restrição de 5,6 a 10,2 kb. Após expressão de Cre recombinase, a sequência entre os locais loxP é removido deixando um único sítio loxP e diminuindo o tamanho do fragmento de restrição de 6,4 kb. Esta mutação resulta em supressão do codão de iniciação causando uma mutação frameshift produção de um produto de proteína não funcional. B) análise Southern blot de DNA genômico foi usado para monitorar essas alterações genéticas e camundongos genótipo contendo o tipo selvagem, floxed, ou alelos knockout. Cada faixa é de um rato individual. C) Análise quantitativa RT-PCR em ARNm total de tecido cardíaco fetal revelou nenhuma mudança no

Ptp4a1

e

Ptp4a2

níveis de mRNA, enquanto

Ptp4a3

foi reduzido e não detectáveis ​​no heterozigoto e tecido homozigoto nulo, respectivamente. (* = P 0,05; n = 4 /genótipo). D) O produto de proteína PTP4A3 era detectável por western blot em lisados ​​de proteínas inteiras de tipo selvagem e tecido cardíaco fetal heterozigotos, mas não em homozigotos

Ptp4a3-

amostras nulos.

Uma análise da 500 crias que foram produzidas por pares de acasalamento heterozigotos indicado todos os genótipos possíveis foram observadas na descendência resultante. Enquanto as fêmeas foram observadas nas proporções esperadas Mendelian, observou-se uma diminuição significativa (p 0,05) no número de

Ptp4a3

-null machos ao desmame em relação à frequência prevista (Tabela 1). Tendo em conta esta constatação, é possível que nocaute machos quer possuía uma desvantagem de sobrevivência ou que

Ptp4a3

-null células germinativas teve um fenótipo preconceito.

Ptp4a3

-null ratinhos macho exibiu uma diminuição de aproximadamente 10% da massa corporal (P 0,003) e 7% de redução no índice de massa corporal (P 0,004) em comparação com crias da mesma ninhada de tipo selvagem em seis semanas de idade (Fig. S2). Este fenótipo também apareceu a ser confinado a ratos macho como a fêmea

Ptp4a3

-null ratos não apresentaram uma diminuição significativa da massa corporal ou índice de massa corporal.

Como o tecido cardíaco fetal teve sido previamente sugerido para ter níveis elevados de

Ptp4a3

expressão [21], o próximo realizada RT-PCR quantitativa em amostras de RNA total de tecido cardíaco fetal (E19.5) para determinar os níveis de mRNA relativa de

Ptp4a1

,

Ptp4a2,

e

Ptp4a3.

Enquanto

Ptp4a1

e

Ptp4a2

níveis permaneceram semelhantes entre os genótipos,

Ptp4a3

ARNm foi reduzida no tecido heterozigótica e não detectável em amostras de

Ptp4a3

-null tecido de coração fetal (Fig. 1C). Assim, a compensação por

Ptp4a3

perda por regulação positiva de ambos membros da família

Ptp4a1

ou

Ptp4a2

no nível de mRNA foi excluída. Os lisados ​​de proteína a partir de tecido de coração fetal foram testadas por Western blot quanto à presença do produto de proteína PTP4A3. Enquanto detectável em amostras a partir de embriões de tipo selvagem, PTP4A3 foi menor nos lisados ​​a partir de embriões heterozigóticos e homozigóticos tecido nulo não continha PTP4A3 detectável (Fig. 1D). Para além das observações fenotípicas acima mencionados, os ratos sem funcional

Ptp4a3

apareceu relativa grosseiramente normal a ninhada de tipo selvagem.

Expressão e knockout de Ptp4a3 em tecidos de camundongos

Uma vez que a expressão de endógeno proteína PTP4A3 em tecidos normais não foi bem caracterizada, examinamos amostras de proteínas de tecido de tipo selvagem e

Ptp4a3

-null ratos. Em primeiro lugar, nós ensaiados vários tipos de tecido para a expressão da proteína PTP4A3 por Western blot (Fig. S3). coração fetal, intestino fetal, adulto coração, músculo esquelético, pâncreas, pulmão, baço, cérebro, timo, cólon, intestino delgado e todos expressaram níveis detectáveis ​​de PTP4A3 em contraste ao fígado e rim, que não tinham proteína PTP4A3 detectável. Estes resultados também confirmam a eficácia da abordagem global deleção do gene, como nenhuma proteína PTP4A3 foi detectável em nenhum dos lisados ​​de

Ptp4a3

-null ratinhos. A análise histológica foi realizada também na de tipo selvagem e

Ptp4a3

-null amostras de tecidos (Fig. S4). Após examinar vários tipos de tecidos, sem anormalidades evidentes foram observados e todas as amostras apareceu qualitativamente normal.

Ptp4a3 expressão aumenta imediatamente após a exposição AOM

Uma vez que os baixos níveis de PTP4A3 eram detectáveis ​​no epitélio do cólon normal, que ensaiada

Ptp4a3

expressão do gene imediatamente após o tratamento com o AOM intestinal pró-carcinogéneo (12,5 mg /kg) ou solução salina de controlo de tipo selvagem em ratinhos C57BL /6J. Os ratinhos foram sacrificados 8 e 24 h depois da injecção OMA e células epiteliais do cólon foram recolhidos para análise. Isolou-se ARNm total e quantitativa de RT-PCR foi realizada com o ensaio para

Ptp4a3

níveis de expressão génica. Curiosamente,

Ptp4a3

foi regulada positivamente em 78% às 8 horas e 60% às 24 h em-tratada OMA relativa epitelial normal, para controlar (Fig. 2C). Os lisados ​​de proteína a partir de ratinhos tratados AOM sugerem que os níveis de proteína PTP4A3 também são aumentados nestes tecidos (Fig. 2D). Embora o papel da

Ptp4a3

no câncer de cólon é tradicionalmente pensado para envolver tumores em estágio final e metástase, este achado sugere um papel potencial na doença em estágio inicial e tumorigênese.

A) A OMA paradigma de tratamento -DSS utilizado neste estudo apresenta uma única dose de AOM seguido por 3 ciclos de tratamento de DSS na água potável. B) representação histológica de tecido de cólon normal, em relação ao tecido tumoral demonstra a eficácia do modelo OMA-DSS. Após um ciclo de tratamento de DSS, displasia cripta e infiltração de células mononucleares eram aparentes. tecido do tumor estava presente em ambas as 12 e 16 semanas endpoints. Antes do sacrifício, os ratos foram tratados com BrdU durante 4 horas e a proliferação de células foi visualizada por coloração com um anticorpo BrdU. C) RT-PCR quantitativo foi usado para ensaiar

Ptp4a3

a expressão do gene em tecidos normais epiteliais do cólon após tratamento com qualquer OMA ou controlo de solução salina.

Ptp4a3

foi elevada de 73% no tecido do cólon seguinte quando medidos 8 horas após a injecção e 60% às 24 h (* = p 0,001; n = 6 /grupo de tratamento; barras = SEM). D) Western blot de lisados ​​cólon indicaram um aumento da proteína PTP4A3 após a exposição OMA. E) RT-PCR quantitativa indicaram mudanças nos níveis de expressão do gene de

Ptp4a

membros da família no cólon normal e tecido tumoral.

Ptp4a3

foi elevada 3,7 vezes (** = p 0,01), enquanto

Ptp4a1

e

Ptp4a2

níveis foram significativamente menores (* = p 0,0001 e p 0,05, respectivamente) (n = 15, barras = SEM). F) análise de transferência de Western demonstrando níveis elevados de proteína PTP4A3 em tumores do cólon, em comparação com o tecido normal. G) Western blot combinada com análise de qRT-PCR também demonstrou que quando se compara

Ptp4a3

níveis de mRNA (listado acima de cada pista) à proteína PTP4A3, a alta expressão de gene parecia corresponder a níveis de proteína mais elevados.

Knockout de Ptp4a3 suprime a formação de tumor intestinal

para explorar um papel funcional potencial para

Ptp4a3

na formação de tumores, que sujeita os ratos a um modelo AOM-DSS usado de associados a colite Cancer de colo. Tipo selvagem e

Ptp4a3

– ratinhos nulos foram injectados com uma única dose de AOM (12,5 mg /kg), seguido por três ciclos de 2,5% Consumo de DSS (Fig. 2A). Este modelo produz alterações histológicas distintas em relação a controlos normais, incluindo a inflamação correspondente ao DSS tratamento, e subsequente displasia (Fig. 2B). Os tumores foram visualmente óbvia no cólon distai de ratinhos de tipo selvagem no sacrifício às 12 ou 16 semanas após o tratamento inicial OMA e eram (Fig. 2B e 3A). Tal como indicado na Figura 3B,

Ptp4a3

-null ratinhos exibem uma diminuição de 54% no número de tumores (p 0,004) após 16 semanas de tratamento. Embora em menor número de tumores médios foram observados às 12 semanas em

Ptp4a3

-null ratos relativa à estirpe selvagem, este não foi estatisticamente significativa (p 0,2). Curiosamente, o número de tumores (p = 0,05), bem como o diâmetro do tumor (P 0,001) foi significativamente aumentada de 12 a 16 semanas, enquanto

Ptp4a3

-null tumores não aumentaram de forma significativa em número ou tamanho. O diâmetro médio de tumores produzidos por este modelo foi de 3-4 mm (Fig. 3C).

a) Imagem que descreve a aparência de tipo selvagem e

Ptp4a3

-null tecido de cólon após 16 semanas de tratamento com AOM-DSS. B) O número médio de tumores foi gravado em ratos por genótipo após 12 e 16 semanas de tratamento. O número médio de tumores aumentou significativamente em murganhos de tipo selvagem entre os 12 a 16 pontos de tempo sem (* = p = 0,05). Durante este tempo o número de tumores observados em

Ptp4a3

-null ratos era o mesmo (p = 0,70). Ao fim de 12 semanas, os ratos de tipo selvagem (n = 6) não têm significativamente mais tumores por rato que

Ptp4a3

-null (n = 5) ratos (p = 0,27). Em 16 semanas, os ratinhos de tipo selvagem (n = 14) exibido significativamente menos tumores do que por ratinho

Ptp4a3

-null ratinhos (n = 7) (** = p 0,005). C) O tamanho do tumor (medido pelo diâmetro médio do tumor para cada ratinho) foi determinado em cada ponto de tempo. o diâmetro do tumor foi observada para aumentar significativamente nos ratinhos de tipo selvagem a partir de 12 a 16 semanas (* = p 0,001). Não foi observada diferença significativa no

Ptp4a3

-null camundongos de 12 a 16 semanas, ou entre genótipos em um ou outro ponto de tempo. Bares = SEM.

Ptp4a3 é elevada em tumores de cólon AOM-derivados

Porque alta expressão de PTP4A3 tem sido relatada em tumores de cólon primários humanos [22], examinamos

expressão Ptp4a3

no modelo do rato do cancro do cólon. Primeiro, ARNm total foi extraído a partir de tecido de tumor a partir de ratinhos de tipo selvagem e quantitativa de RT-PCR foi utilizado para ensaiar o nível de expressão de cada

Ptp4a

membro da família (Fig. 2E). Em relação ao epitélio do cólon normal,

Ptp4a3

foi elevada de 3,7 vezes em média (p 0,01). Enquanto considerável heterogeneidade no

foi observada Ptp4a3

expressão, variando de 1,4 a 6,7 ​​vezes sobre-regulação,

Ptp4a3

níveis de mRNA em tecidos tumorais foram consistentemente mais elevada do que o tecido normal para cada amostra testada (n = 15 ). Interessantemente, os níveis de expressão do gene

Ptp4a1

e

Ptp4a2

foram regulados negativamente 64% e 36% (p 0,0001 e p 0,05), respectivamente, em tumores do cólon em relação ao tecido normal. os níveis de proteína em lisados ​​PTP4A3 normais epiteliais do cólon foram muito baixos quando testadas por Western blot (Fig. 2F). Em contraste, foi rapidamente detectável PTP4A3, mas variável, em amostras de tumores de cólon. Como seria de esperar, pareceu haver alguma correlação entre os níveis de proteína PTP4A3 e os níveis de ARNm (Fig. 2G). A falta de anticorpos funcionais para PTP4A1 e PTP4A2 se opõe a avaliação dos níveis de proteína tumor para estes membros da família.

Perda de Ptp4a3 aumenta a expressão IGF1Rβ e c-MYC em tumores

A seguir, examinou lisados ​​obtidos a partir de tanto do tipo selvagem e

tumores Ptp4a3

-null cólon. Primeiro usamos array de proteínas de fase inversa para testar os níveis de mais de 130 produtos de proteínas diferentes contidas no tipo selvagem e

Ptp4a3

-null tumores (Fig. S5). Enquanto os níveis de proteína nesses tumores exibiram uma heterogeneidade considerável, duas proteínas de sinalização conhecidos oncogénicos, tirosina-cinase do receptor IFG1Rβ e o factor de transcrição de c-myc foram expressas em níveis mais elevados em

Ptp4a3

-null tumores (Fig. 4A). Após quantificação, proteína IGF1Rβ era em média 2,1 vezes superior (p 0,001) e c-myc foi cerca de 2,5 vezes superior (p 0,02) em

Ptp4a3

-null em relação aos tumores de tipo selvagem do cólon (Fig. 4B-C). Em contraste, não foi observada uma diferença significativa na activação AKT entre os genótipos (Fig. 4D). Este resultado sugere que tumores podem potencialmente compensar

Ptp4a3

deficiência que vias de sinalização alterados.

A) amostra Cluster do heatmap gerado a partir da análise RPPA que foi realizada utilizando lisados ​​de tumor do cólon do AOM-DSS tratadas tipo selvagem e

Ptp4a3

-null ratos. proteínas alvo eram ou superior (amarelo), inferior (azul), ou inalterada (preto). B) Os níveis de proteína foram confirmadas por análise de transferência de western lisados ​​tumorais de cólon de tipo selvagem e

Ptp4a3

-null ratinhos. IGF1Rβ e proteína c-MYC foram escolhidos por causa de eles pareciam ser as proteínas mais consistentemente upregulated em

Ptp4a3

-null amostras. C) Quando quantificada, os níveis de proteína IGFIRβ eram 2,1 vezes mais elevada em

Ptp4a3

-null tumores (p 0,001). D) Os níveis de proteína c-Myc foram 2,5 vezes mais elevada em

Ptp4a3

-null tumores (p 0,02). E) Os níveis de AKT activado, como indicado por fosforilação de Ser473, não foram significativamente diferentes em relação ao genótipo por proteína Akt total.

Discussão

Uma série de genes têm sido implicados no desenvolvimento e progressão do cancro colo-rectal. estudos de perfis gene anterior de expressão identificados 144 genes que são regulados positivamente em amostras de fígado colorretal metastático [2]. O único gene, no entanto, que foi consistentemente elevados em todas as amostras foi metastáticos

Ptp4a3

. Tanto a amplificação de genes e a actividade de transcrição reforçada são susceptíveis causal para os níveis elevados. Apesar da aparente importância da

Ptp4a3

na biologia do tumor, o nosso entendimento da funcionalidade do

Ptp4a3

é solidariamente limitada devido em parte à falta de modelos animais informativos. O modelo do rato do gene alvo para a interrupção do

Ptp4a3

local genómico que desenvolvemos é útil não só para estudar as alterações fenotípicas que ocorrem com a perda global da fosfatase, mas também para investigações futuras sobre o tecido e temporal deleção do gene específico e interações colaborativas com outros genes, incluindo os dois outros membros da

Ptp4a

família. O nosso modelo estabelece que os ratos podem sobreviver na ausência de um gene funcional

Ptp4a3

, embora houvesse um número ligeiramente inferior de ratos machos produzidos, e que são capazes de viver até à maturidade em condições normais sem grandes deficiências de saúde . Isto está em contraste com o que foi relatado com ratinhos a que falta o altamente homóloga

Ptp4a2 de viajantes que se pensa ser o membro da família mais ubiquamente expressos sob condições normais.

Ptp4a2

-null ratos exibiu o desenvolvimento da placenta com defeito e ambos os sexos mostrou crescimento retardado em fases embrionárias e adultas [23].

Ptp4a2

perda diminui os espongiotrofoblasto e decídua camadas da placenta que prejudicam o transporte de nutrientes e causando retardo do crescimento embrionário. Além disso, a perda de

Ptp4a2

resulta em inactivação AKT, que não foi evidente em nossos dados sobre

Ptp4a3

perda. Colectivamente, as diferenças entre os dois modelos de deleção do gene são consistentes com funções não sobrepostos destes dois membros da família da fosfatase fim.

deleção de proteína PTP4A3 foi confirmada por análise de Western blot utilizando uma variedade de lisados ​​de tecido de tipo selvagem e

Ptp4a3

-null ratos. Embora os estudos iniciais sugeriram

Ptp4a3

expressão foi restringida ao coração, músculo esquelético, e pâncreas [24], os nossos dados revelaram um padrão de expressão mais onipresente. Enquanto foram observadas as maiores níveis de PTP4A3 de coração fetal, a proteína também foi detectada em níveis mais baixos no coração de adulto, músculo esquelético, baço, pâncreas, cérebro, pulmão, timo, do cólon, e do intestino delgado; nenhuma proteína PTP4A3 foi detectado no fígado ou nos rins.

Porque PTP4A3 humano é sido implicados na patogênese do câncer colorretal metastático humano, nós investigamos os efeitos do

Ptp4a3

deleção em um mouse modelo de cólon Câncer. O tratamento com OMA /DSS é um dos modelos de tumor do cólon de ratinho mais populares e da estirpe C57BL /6J com que este modelo foi retrocruzamento é particularmente susceptível a cancro associado a colite [13], [16], [17].

Ptp4a3

é tradicionalmente classificada como um gene associado com a metástase e não conhecidas por estarem envolvidas nas fases iniciais da progressão do cancro. No estudo atual, nós fornecemos evidências de que o

Ptp4a3

níveis de proteína de mRNA e PTP4A3 são aumentadas logo após a exposição a AOM, o passo inicial em nosso modelo de cancro do cólon. Esta é uma evidência importante que PTP4A3 poderia também estar envolvido na fase de pré-neoplásica de malignidade.

Ratos submetidos ao modelo /DSS AOM tumores consistentemente desenvolvidas na região distal do cólon. Estes tumores primários apresentaram níveis mais elevados de

Ptp4a3

em relação ao epitélio normal do cólon – semelhante ao que é visto em pacientes com câncer de cólon humano [22]. Notavelmente, camundongos deficientes para

Ptp4a3

estiveste 50% de redução na formação de tumores fornecendo mais evidências de que

Ptp4a3

é um mediador chave da progressão do câncer de cólon. No entanto, a ausência completa de PTP4A3 fosfatase era insuficiente para suprimir tumorigenese do cólon, o que sugere que um subconjunto de tumores podem não requerer

Ptp4a3

como um controlador da doença. Isto é suportado pela descoberta de que nem todos os tumores neste modelo teve alta. ( upregulation 2 vezes)

Ptp4a3

níveis de expressão

O modelo animal que desenvolvemos apresenta uma oportunidade única para abordar o papel da

Ptp4a3

na biologia do tumor. exposição AOM causa danos ao DNA e estresse genotóxico. Uma resposta proeminente ao dano no DNA é a indução de

p53

, o que pode induzir

Ptp4a3

expressão [25] e pode fornecer uma explicação para a indução de

Ptp4a3

no cólon AOM de ratinhos tratados. Além disso,

Ptp4a3

tem sido identificada como um alvo directo reguladora de TGFp sinalização em células cancerígenas do cólon. O sinal de TGF ativo induz Smad3 /4 ligação ao

Ptp4a3

lócus genômico e, portanto, a inibição da transcrição de genes [19]. Perda de TGFp é um fenómeno frequente em cancro do cólon humano [26], bem como o modelo de ratinho de cancro do cólon AOM [18]. É provável que este evento contribui para a elevada

Ptp4a3

expressão genética no cancro através Smad3 /4 inativação. Curiosamente, um modelo de rato deficiente em

Smad3

tem sido relatada a desenvolver espontaneamente cancro do cólon [27], e

deficiência Smad4

agrava grandemente um mouse modelo de cancro do cólon [28]. A formação de lesões neoplásicas no

Ptp4a3

-null camundongos pode ser a consequência do envolvimento de vias ou oncogenes sinalização do fator de crescimento adicionais, como IFG1Rβ e c-MYC. c-MYC é conhecido por ser aumentada em tumores após tratamento AOM /DSS e ambos IFG1Rβ e c-MYC foram marcadamente elevada no

Ptp4a3

-null tumores relativos aos tumores derivados de tipo selvagem.

Enquanto

Ptp4a3

produto do gene inicialmente foi pensado para ser envolvido na metástase do tumor e doença em estágio final, nossos resultados fornecem evidências de possíveis papéis em outros estágios da doença, incluindo transformação pré-neoplásica e carcinogênese cedo. O conceito de segmentação terapeuticamente

Ptp4a3

poderia, portanto, ser atraente em vários estágios do câncer.

Materiais e Métodos

Criação de

ratinhos mutantes Ptp4a3

O vector-alvo gene condicional foi construído usando uma

E-base fago. coli

sistema de recombinação [29]. Detalhes específicos sobre a construção do vetor e segmentação estratégia estão descritos na Fig. S1. Nós especificamente alvejado exão 2 por conter o sítio de iniciação da transcrição e da tradução era necessário para a correcta do transcrito de ARNm. Após transfecção da construção para células estaminais embrionárias R1 [30], os ratinhos foram criados a partir de clones correctamente alvejados utilizando técnicas de produção animal quimérico padrão com ratinhos C57BL /6J de blastocistos. A nova estirpe foi retrocruzado de C57BL /6J (The Jackson Laboratory) para 5 gerações e ratos para experiências foram produzidas usando casais heterozigotos. A genotipagem foi realizada por análise de mancha de Southern com uma sonda radiomarcada correspondendo a -300 pb do exão 6, que foi externo ao gene vector de direccionamento. Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Todos os protocolos relevantes foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Pittsburgh

modelo de câncer de AOM

tipo selvagem e

Ptp4a3

-null ratos (machos, 6. -8 semanas) foram administradas numa dose única de AOM (12,5 mg /kg) (Sigma) em solução salina estéril, por injecção IP. foi administrada uma solução de DSS (2,5%) (MP Biomedicals)

ad libitum durante 7 d

seguido de 14 d de água potável normal e este ciclo foi repetido um total de 3 vezes [13]. murganhos experimentais foram sacrificados às 12 ou 16 semanas após o início do tratamento, no qual o tecido do cólon ponto foi isolado, lavado, e aberto longitudinalmente para análise. Tumor e tecido normal ou foram congeladas rapidamente em azoto líquido ou submersa em 10% de formalina tamponada neutra. Para cada rato, tumores individuais foram contados e medidos com um paquímetro digital e contagem média do tumor e diâmetro foram determinados para cada genótipo.

análise de Western blot

Células e tecidos foram lisadas usando tampão RIPA e quantificado por ensaio de Bradford. Uma amostra de proteína total de 40 ug foi separada usando reagentes Novex de SDS-PAGE (Invitrogen) e transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas em tampão Odyssey (LiCor Biosciences) e incubadas durante a noite com anticorpos primários seguido de anticorpos secundários fluorescentes de acordo com as instruções dos fabricantes. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários disponíveis comercialmente: PTP4A3 clone 318 (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH, IGF1Rβ, c-MYC, p-AKT (S473) e AKT (Cell Signaling Technology)

quantitativa RT-. PCR

o ARN total foi extraído a partir de tecido usando o reagente Trizol, conforme o protocolo do fabricante (Invitrogen). Um total de 500 ng de mRNA foi convertido em cDNA usando o kit de síntese da primeira cadeia iScript (Bio-Rad). Os iniciadores (Tab. S1) utilizados para a amplificação do alvo foram diluídos para uma concentração final de 500 pM, e monitorização em tempo real da reacção de PCR foi realizada num termociclador IQ5 Biorad com 2X SYBR Green Mastermix (Bio-Rad). O programa seguinte foi executada durante 40 ciclos: 95 ° C durante 0:30; 58 ° C durante 1:00; e 72 ° C para 0:30.

matriz inversa proteína de fase

lisados ​​de proteína (100 ug de cada) a partir de amostras de tumor de cólon (n = 5 /genótipo) foram desnaturadas e enviada congelada para MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) para análise. Em resumo, os lisados ​​foram de duas vezes em série diluída para 5 diluições e dispostas em lâminas revestidas com nitrocelulose, sondadas com anticorpos, e visualizados por reacção colorimétrica diaminobenzidina. Os níveis de proteína relativos de cada amostra foram determinadas por interpolação das curvas de diluição de cada corrediça do anticorpo curva padrão. Todos os pontos de dados foram normalizados para a carga de proteína e transformado para valor linear. valores lineares foram transformados em valor Log2 e depois mediana centrada para a análise de agrupamento hierárquico. O heatmap foi gerada em Cluster 3.0 como um cluster hierárquica usando Correlação de Pearson e uma métrica centro (detalhes adicionais são fornecidos é Fig. S5).

Estatísticas

A análise estatística do genótipo prole foi calculada pela o teste do qui-quadrado comparar dados observados e os resultados esperados. Dados a partir de ensaios celulares, Western Blot, e quantificações qRT-PCR foi analisada utilizando o teste t de duas caudas. Em ambos os casos, a significância foi definida como p ≤ 0,05.

Informações de Apoio

Figura S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s001

(PDF)

Figura S2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s002

(PDF)

Figura S3.

doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s003

(PDF)

Figura S4.

doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s004

(PDF)

Figura S5.

doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s005

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Tabela S1.

doi:. 10.1371 /journal.pone.0058300.s006

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Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Carolyn Ferguson por sua especialização e assistência técnica