Abstract

pâncreas adenocarcinoma ductal (PDA) é uma doença altamente letal, que geralmente é diagnosticada em um avançado etapa. Nós estabelecemos ratos transgénicos portadores de um

ras

gene mutado K- controlada por Cre activação /loxP. Os animais desenvolvem PDA que é histologicamente semelhante à que nos seres humanos. Anteriormente, relatou que os níveis séricos de N-ERC /mesothelin foram significativamente maiores nos ratos portadores PDA que nos controles. No presente estudo, para determinar se os níveis séricos de N-ERC /mesothelin correlacionada com o tamanho do tumor, medimos níveis de N-ERC /mesothelin em ratos portadores PDA. Níveis plasmáticos elevados de N-ERC /mesothelin correlacionadas com o tamanho aumentado tumor. Este resultado indica uma inter-relação entre o nível sérico de N-ERC /mesothelin e tamanho do tumor. A seguir, investigou o efeito da quimioterapia sobre os níveis séricos /mesothelin N-CEI. células de cancro do pâncreas de rato foram implantadas subcutaneamente no flanco de ratinhos NOD-SCID. Nos ratinhos tratados com 200 mg /kg de gemcitabina, o peso do tumor e o nível do soro de N-CEI /mesotelina foram significativamente diminuídos em comparação com os controlos. Estes resultados sugerem que o soro N-ERC medições /mesothelin pode ser útil para monitoramento da resposta à terapia

Citation:. Fukamachi K, Iigo M, Hagiwara Y, Shibata K, Futakuchi M, Alexander DB, et al. (2014) Rat N-ERC /mesothelin como um marcador para

In Vivo

Triagem de medicamentos contra o cancro do pâncreas. PLoS ONE 9 (10): e111481. doi: 10.1371 /journal.pone.0111481

editor: Mohammad Saleem, Instituto Hormel da Universidade de Minnesota, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de junho de 2014; Aceito: 25 de setembro de 2014; Publicação: 27 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Fukamachi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte pelo programa de transferência adaptável e Seamless Tecnologia através impulsionado-alvo R D (A-PASSO) do Japão Ciência e Agência de tecnologia; um Grant-in-Aid para a Investigação Científica (C) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência; um Grant-in-Aid para a Investigação em Nagoya City University; a Fundação do Câncer Aichi Research; Programa de desenvolvimento do sistema de apoio para a modernização da educação e da pesquisa do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia; e um Grant-in-Aid para Cancer Research (17S-6, 20S-8) do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Yoshiaki Hagiwara é um empregado de Laboratórios de Imuno-biológicos. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Os demais autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes.

Introdução

N-ERC /mesothelin é uma proteína 31-kDa que forma o fragmento N-terminal do full-length 71-kDa ERC /mesotelina proteína e é segregado para o sangue dos pacientes com mesotelioma [1] – [3]. O rato

Erc

(expresso em carcinoma de células renais) gene foi identificado como um gene altamente expresso em carcinoma de células renais do rato Equer [4], [5]. O homólogo humano de rato

Erc

é o

mesothelin

/

megacari�itos potencializando fator

(

MPF

) gene [6] – [8]. CEI /mesotelina também é expressa em tecido dos ovários e o carcinoma do pâncreas em seres humanos [9] – [12]. N-ERC /mesothelin é considerada relevante na monitorização da resposta quimioterápico em pacientes com mesotelioma [13], [14].

pâncreas ductal adenocarcinoma (PDA) carrega o prognóstico mais sombrio de todos os tumores sólidos [15] . Nós estabelecemos linhas de ratos transgénicos portadores de um H humana

ras

G12V (Hras250) [16] ou um K humana

ras

G12V (Kras301, Kras327) [17] oncogene em que a expressão do transgene é regulada pelo sistema Cre /loxP. Targeted activação do transgene é realizada por injecção de uma Cre-recombinase realização adenovírus (AxCANCre) dentro dos ductos pancreáticos através do ducto biliar comum. lesões neoplásicas em ratos transgénicos apresentam morfológica [16], [18] e biológica [17], [19] – [21] semelhanças com aqueles observados nas lesões pâncreas humano. Nós anteriormente relatado que N-CEI /mesotelina é facilmente detectado no soro de ratos portadores do pâncreas adenocarcinomas ductais [17]. No presente estudo, relatamos o uso de N-ERC /mesothelin como um marcador sorológico para avaliação da eficácia da quimioterapia.

Materiais e Métodos

Animais

Homem K

ras

G12V transgênica (Kras301) ratos (Jcl: SD fundo rato) foram estabelecidos como relatado anteriormente [17], [18]. ratos homozigotos foram gerados pela criação de ratos machos heterozigotos com ratas heterozigotos. ratos transgénicos homozigóticos foram identificados por PCR semi-quantitativa e em seguida confirmados por teste genético. Kras301 ratos foram criados para obter uma descendência transgénica homozigotos viáveis ​​e férteis. Fisher344 (/F344) DuCrlCrlj ratos foram adquiridos de Charles River Japan, Inc. (Yokohama, Japão). Sprague-Dawley (SD) (ratos Jcl: SD) foram obtidos a partir de CLEA Japan (Tóquio, Japão). SD (SLC: SD) e Wistar (Slc: Wistar /ST) ratos foram obtidos de Japan SLC, Inc. (Hamamatsu, Japan). Os ratos foram mantidos em gaiolas de plástico em uma sala com ar condicionado, a 12 h ciclo claro /escuro de 12 h. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes para a Experimentação Animal da Escola de Pós-Graduação Nagoya City University de Ciências Médicas, e aprovado pelo Comité de animal Cuidado e Uso da Escola de Pós-Graduação Nagoya City University de Ciências Médicas (H21-02, H22M-24) .

indução tumoral e patológica exame

Cre-expressam vectores de adenovírus foram amplificados em células HEK293 e, em seguida, purificado utilizando Vivapure Adenopack (Vivascience, Hannover, Alemanha) como relatado anteriormente [17]. Foram induzidos tumores do pâncreas, tal como descrito anteriormente [16] – [22]. O pâncreas foi fixada em paraformaldeído a 4% e processados ​​para observação histológica. Anti-rato C-CEI /mesotelina (306) foi adquirido a partir de Immuno-Biological Laboratories (Gunma, Japão), e a coloração foi realizada como descrito anteriormente [17].

Transplante de uma linha de tratamento e de células de pâncreas de rato com gemcitabina

a linha de células de carcinoma de pâncreas (634NOD) foi criado a partir de um tumor do pâncreas de um rato Hras250 [17], [23]. células tumorais 634NOD (2 × 10

6) foram transplantadas subcutaneamente em seis semanas ratinhos NOD-SCID macho de idade (CLEA Japan, Tóquio, Japão). Uma semana mais tarde, os ratinhos NOD-SCID recebido gemcitabina (2 ‘, 2’-difluoro desoxicitidina; dFdC) hydrochroride (Eli Lilly Japan K.K., Kobe, Japão) em solução salina quatro vezes dentro de nove dias por injecção intraperitoneal. Os tumores foram medidos pelo comprimento (a) e a largura (b), em milímetros usando compassos de calibre, e os volumes de tumor (V) foram calculados de acordo com a relação V = AB

2/2, onde “a” foi o mais longo dos dois medições [24]. Sete semanas após o transplante, os ratos foram mortos sob anestesia isoflurano profunda e os tumores foram removidos e pesados ​​e soro foi recolhido para análise de N-ERC /mesothelin.

Soro teste

O nível sérico de rato N-ERC /mesothelin foi quantificada por ELISA (Código No.27765, Kit Rat N-ERC /mesothelin Ensaio, IBL, Gunma, Japão), como descrito anteriormente [25].

resultados

o nível sérico de N-ERC /mesothelin em ratos Kras301

Para determinar se o nível sérico de N-ERC /mesothelin é diferente no tipo selvagem Jcl: ratos SD e heterozigotos e ratos Kras301 homozigotos, nós ensaiada N níveis -ERC /mesothelin em tipo selvagem Jcl: ratos SD e heterozigotos e ratos Kras301 homozigotos com a idade de 10 semanas: ratos F1 heterozigotos foram gerados pela criação de ratos machos Kras301 homozigotos com Jcl feminino: ratos SD. Não houve diferença significativa no peso corporal entre os machos e as fêmeas das diferentes genótipos (dados não mostrados). Os níveis séricos de N-ERC /mesothelin foi significativamente diferente entre os três genótipos (P 0,0001): 28,3 ± 4,0 ng /ml (n = 19) no tipo selvagem Jcl: ratos SD, 51,5 ± 9,2 ng /ml (n = 19) nos ratos Kras301 heterozigotos, e 77,9 ± 8,2 ng /ml (n = 13) no homozigoto Kras301 ratos (Figura 1A). Além disso, o nível sérico de N-ERC /mesothelin em ratos F1 heterozigotos foi claramente mais elevada do que os ratos heterozigotos originais [17]

ratos Heterozigótica Kras301 foram gerados pela criação de ratos Kras301 homozigotos com tipo selvagem Jcl: ratos SD. . (A) Os níveis séricos de N-ERC /mesothelin em tipo selvagem Jcl: ratos SD e heterozigotos e ratos Kras301 homozigotos. (B) Os níveis séricos de N-ERC /mesothelin no sexo masculino (barra fechada) e feminino (open bar) do tipo selvagem Jcl: ratos SD e ratos Kras301 heterozigotos e homozigotos. *, ** E #, P . 0,0001 em comparação com o outro

Não houve diferença significativa nos níveis de soro de N-ERC /mesothelin entre homens (30,3 ± 4,2 ng /ml, n = 9 ) e feminino (26,4 ± 2,8 ng /ml, n = 10) do tipo selvagem Jcl: ratos SD. Em contraste, houve uma diferença significativa nos níveis séricos de N-ERC /mesothelin entre ratos Kras301 F1 heterozigotos do sexo feminino (masculino masculino e, 59,2 ± 8,0 ng /ml, n = 8; sexo feminino, 45,9 ± 5,0 ng /ml, n = 11: P 0,0001) e ratos Kras301 homozigóticos (macho, 83,4 ± 6,2 ng /ml, n = 6; fêmeas, 73,2 ± 6,7 ng /ml, n = 7: P 0,05) (Figura 1B)

.

o nível sérico de N-ERC /mesothelin em linhagens de ratos diferentes

Para determinar se o fundo genético afetado os níveis séricos de N-ERC /mesothelin, os níveis de N-ERC /mesothelin no soro foram medido em três linhagens de ratos diferentes: F344 /DuCrlCrlj, a SLC: Wistar /ST e SLC: SD. Os níveis de N-ERC /mesothelin foram significativamente diferentes entre linhagens de ratos (P 0,0001) (Figura 2A). Os níveis de N-ERC /mesothelin foram 45,0 ± 1,5 (n = 12) em F344 /DuCrlCrlj, 31,4 ± 5,9 (n = 12) em Salt Lake City: SD e 19,6 ± 3,0 (n = 12) em Salt Lake City: ratos Wistar /ST . Os níveis de N-ERC /mesothelin também foram significativamente diferentes entre os machos das diferentes cepas e as fêmeas das diferentes estirpes (Figura 2B). Nas estirpes individuais, não houve diferença significativa entre o macho (n = 6) e fêmea (n = 6) ratos (Figura 2B). Além disso, não houve diferença significativa entre Jcl: SD (n = 19) e SLC:. SD (n = 12) ratos

(A) Diferenças de tensão nos níveis séricos de N-ERC /mesothelin. (B) Os níveis séricos de N-ERC /mesothelin no sexo masculino (bar fechado) e fêmeas (barra) das diferentes linhagens de ratos. *, P 0,0001; **, P 0,005; #, P . 0,0001 em comparação com o outro

O nível sérico de N-ERC /mesothelin correlacionada com o tamanho do tumor em ratos

Para determinar se os níveis séricos de N-ERC /mesothelin correlacionada com o tamanho do tumor, nós ensaiada níveis mesothelin N-ERC /em ratos Kras301 homozigotos tendo pâncreas adenocarcinomas ductal. ratos Kras301 homozigotos machos adultos foram mortos 4 semanas após a injecção de AxCANCre recombinante para o ducto pancreático através do ducto biliar comum: ver Fukamachi et al. 2013 [22] para uma descrição detalhada da activação mediada AxCANCre do oncogene Kras em ratos Kras301. Muitos nódulos tumorais esbranquiçadas grosseiramente visíveis foram observados ao longo do pâncreas em ratos transgénicos. O exame histológico mostrou que estes nódulos eram adenocarcinomas, como foi reportado anteriormente [16], [17]. lesões neoplásicas não foram encontrados em quaisquer outros órgãos. Estudos imuno-histoquímicos mostraram maior expressão de CEI /mesotelina em lesões de carcinoma comparação com o tecido circundante normal, tal como foi reportado anteriormente [17]. Além disso, estudos de imuno-histoquímica mostrou ERC /mesothelin também foi expressa de forma positiva na neoplasia intra-epitelial pancreáticas lesões (pancreáticas intraepiteliais) (Figura 3).

A imunocoloração da ERC /mesothelin em PanIN1 (A e B), PanIN2 (C e D) e PDA (e e F) lesões. A, C, E, H E de coloração; B, D, F, ERC /coloração mesothelin. . Barras = 100 fim

Um aumento no nível sérico de N-CEI /mesotelina correlacionada com o tamanho do tumor aumentou (P = 0,89665, P 0,0001, n = 14) (Figura 4). Este resultado indica uma inter-relação entre o nível sérico de N-ERC /mesothelin eo tamanho do tumor nestes ratos.

O nível sérico de N-ERC /mesothelin em ratos Kras301 homozigotos tendo pâncreas carcinoma ductal. O nível sérico de N-ERC /mesothelin correlacionada com o aumento do peso do tumor (R = 0,897).

N-ERC /mesothelin como um marcador do efeito quimioterapêutico de um anti-câncer droga

a seguir, investigou se os níveis de soro de N-ERC /mesothelin foram afetados pelo tratamento do adenocarcinoma do pâncreas com a gemcitabina quimioterápico. 634NOD células [17], que foram derivadas de um adenocarcinoma ductal do pâncreas de uma ratazana Hras250, foram implantadas subcutaneamente no flanco de ratinhos NOD-SCID. Após 1 semana, os ratos foram administrados gemcitabina (200 mg /kg, i.p.) quatro vezes dentro de nove dias por injecção intraperitoneal. Desde a semana 1 para a semana 7 do tamanho do tumor continuou a aumentar tanto no controlo e os ratos tratados gemcitabina (Figura 5A). Embora, devido à grande dispersão de tamanhos de tumor, não houve uma diferença significativa no tamanho do tumor entre os dois grupos, o tamanho médio do tumor foi marcadamente menor nos ratos tratados com gemcitabina em comparação com os ratinhos de controlo a partir da semana 3 à semana 7 ( Figura 5A). No final da semana 7, os ratinhos foram sacrificados e os tumores removidos e pesados; o peso do tumor nos ratos tratados com gemcitabina (0,33 ± 0,26 g, n = 9) foi significativamente diminuída em comparação com os ratinhos de controlo (1,60 ± 1,37 g, n = 10) (p 0,05) (Figura 5B). Não houve diferenças morfológicas entre os tumores dos murganhos tratados com gemcitabina e de controlo (dados não apresentados). No final da semana 7, o nível sérico de N-CEI /mesotelina foi diminuiu significativamente (P 0,01) em ratinhos tratados com gemcitabina (22,4 ± 22,6 ng /ml, n = 9) quando comparado com os murganhos de controlo (123,7 ± 100,6 ng /ml, n = 10) (Figura 5C). Em contraste, nem o peso, nem soro de tumor níveis de N-CEI /mesotelina foram significativamente diferentes do controlo (n = 10) em ratinhos tratados com 75 (n = 10) ou 150 (n = 9) mg /kg de gemcitabina (Figura S1 ). Embora, devido à grande dispersão dos tamanhos dos tumores e níveis /mesothelin N-ERC, não houve uma diferença significativa no tamanho do tumor ou níveis /mesothelin N-ERC entre os ratinhos tratados com 75 ou 150 mg /gemcitabina kg e os ratos de controle, a média de ambos os valores foi menor nos ratos tratados com gemcitabina em comparação com os ratinhos de controlo. Assim, o nível de soro de N-CEI /mesotelina bem correlacionada com o efeito de gemcitabina (R = 0,96597, P 0,0001). (Figura 5D)

células cancerosas Rato pâncreas (634NOD células) foram implantadas subcutaneamente no flanco de ratinhos NOD-SCID. Após 1 semana, os ratos foram administrados gemcitabina (0 ou 200 mg /kg, i.p.) quatro vezes dentro de nove dias por injecção intraperitoneal. (A) de observação periódica de tumores em ratinhos NOD-SCID tratados com gemcitabina (0 mg /kg, círculos abertos; 200 mg /kg, círculos fechados). (B) O peso do tumor e (C) o nível sérico de N-CEI /mesotelina foi significativamente reduzida por tratamento com gemcitabina (200 mg /kg, círculos a cheio) em comparação com o controlo (círculos abertos) (P 0,05, P 0,01, respectivamente, ). (D) correlação do peso do tumor e níveis séricos de N-ERC /mesothelin. O nível sérico de N-ERC /mesothelin correlacionado com o peso do tumor e tratamento gemcitabina (R = 0,966). Os círculos abertos, 0 mg /kg; círculos fechados, 200 mg /kg.

Discussão

Temos relatado anteriormente que o nível sérico de N-ERC /mesothelin correlacionada com o tamanho do tumor em ratinhos com células de câncer de pâncreas de ratos transplantados (634NOD células) [17]. No presente estudo, de acordo com nosso relatório anterior, o nível sérico de N-ERC /mesothelin correlacionada com o tamanho do tumor de pâncreas em ratos (Figura 4). Estes resultados mostraram que o tamanho do tumor do pâncreas relativa pode ser calculada a partir dos níveis séricos de N-CEI /mesotelina, sem sacrificar os animais. Também mostramos que a N-CEI /mesotelina no soro era um biomarcador que possa ser utilizado para monitorizar a resposta à quimioterapia. Quando os ratinhos com tumores derivados de células transplantadas 634NOD foram tratados com gemcitabina, o peso do tumor e o nível de N-CEI /mesotelina no soro foram reduzidos em comparação com o controlo. O nível de soro de N-CEI /mesotelina correlacionada com o efeito terapêutico da droga anti-cancro (Figura 5). Portanto, N-CEI /mesotelina pode ser utilizado para análise quantitativa do efeito terapêutico de agentes anti-cancro em cancro do pâncreas, nos modelos de animais utilizados neste estudo.

O nível de soro de N-CEI /mesotelina em Kras301 ratos homozigóticos era significativamente maior do que aqueles dos ratos de tipo selvagem. O nível de soro de N-CEI /mesotelina na F1 heterozigotos de ratos homozigóticos também foi significativamente mais elevada do que em ratos do tipo selvagem. No entanto, o nível sérico de N-CEI /mesotelina nos ratos heterozigotos originais não eram diferentes das do tipo selvagem Jcl: ratos SD [17]. Os ratos Kras301 homozigotos eram mantidos por reprodutores machos homozigotos e ratas homozigotos. É provável que os ratos com altos níveis de N-ERC /mesothelin foram selecionados acidentalmente no curso de estabelecer os ratos Kras301 homozigotos.

O nível sérico de N-ERC /mesothelin foi significativamente diferente entre linhagens de ratos (F344 /DuCrlCrlj, Slc: SD e SLC: Wistar /ST). Estes resultados sugerem que o fundo genético de diferentes estirpes de ratos afecta o nível basal de soro de N-CEI /mesotelina. Portanto, para a avaliação das respostas quimioterapêuticos que utilizam soro de N-CEI /mesotelina, é importante o uso de controlos apropriados.

N-CEI /mesotelina foi detectado nos sobrenadantes das células cancerosas humanas cultivadas pâncreas e correlacionada com a níveis de ERC /mesothelin [26] expressão. CEI /mesotelina é frequentemente expressa em carcinoma ductal, mas não no pâncreas normal [11], [26] – [28]. Assim, a expressão do CEI /mesotelina pode ser encontrado em ambas as pâncreas humano e de rato de adenocarcinoma ductal. No entanto, ao contrário das expectativas, não houve diferença significativa nas concentrações de N-ERC /mesothelin séricos entre pacientes com câncer de pâncreas e grupos de controle saudáveis ​​[26]. Por conseguinte, enquanto que o N-CEI /mesotelina pode ser utilizado como um biomarcador de soro para o carcinoma ductal do pâncreas em modelos animais utilizados no presente estudo, não é apropriado para seres humanos.

Actualmente, não existe nenhum fármaco eficaz contra cancro do pâncreas; por conseguinte, a utilização de modelos animais para testar a capacidade de resposta do cancro do pâncreas para terapia continua a ser da maior importância. A utilização de rato N-CEI /mesotelina como um marcador sérico reside na sua capacidade para distinguir entre ratos com ou sem cancro do pâncreas sem abrir a cavidade abdominal. A gemcitabina é geralmente considerada como terapia de primeira linha para câncer de pâncreas. A dose máxima tolerada de gemcitabina em ratos foi de 50 mg /kg uma vez por semana. Esta dose não teve efeito sobre o tamanho do tumor em ratos Kras301. Portanto, o nível sérico de N-ERC /mesothelin não foi significativamente afetada nestes animais (os nossos resultados não publicados). Notavelmente, em camundongos tratados com gemcitabina, os níveis de gemcitabina que não afetaram significativamente o tamanho do tumor não afetou o nível sérico de N-ERC /mesothelin (Figura S1). Enquanto gemcitabina sozinha não mostra efeitos anti-cancerígenos no cancro do pâncreas endogenamente desenvolvido em ratos (nossos resultados não publicados) ou em modelos de rato [29], os resultados aqui apresentados demonstram a utilidade de N-CEI /mesotelina como um marcador do soro no controlo pré-clínico ensaios para a terapia em ratinhos e ratos modelos de adenocarcinoma ductal do pâncreas: diagnóstico sorológico em modelos animais podem ser utilizados para melhorar a triagem para agentes quimioterapêuticos candidato que pode ser avaliado para uso humano

Informações de Apoio

Figura S1..

Efeito de gemcitabina em ratinhos NOD-SCID transplantados com células 634NOD. O nível de peso do tumor e soro de N-ERC /mesothelin não foi diminuída pelo tratamento com 100 ou 150 mg /kg de gemcitabina

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111481.s001

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