Abstract
complexo Ctf18-replicação fator C incluindo Dscc1 (replicação do DNA e irmã chromatid coesão 1) está implicado na irmã coesão chromatid, replicação de DNA, e estabilidade do genoma em
S. cerevisiae
e
C. elegans
. Nós previamente realizada a expressão do gene em células de cancro de perfil colorectais primários, a fim de identificar novos alvos moleculares para o tratamento de cancro colo-rectal. Uma característica da assinatura transcricional associado a um cancro revelou a partir deste esforço é a elevada expressão do proto-oncogene
DSCC1
. Aqui, nós interrogado a base molecular para a expressão desviante de DSCC1 humana em câncer colorretal e sua capacidade para promover a sobrevivência de células cancerosas. PCR quantitativa e imuno-histoquímica análises confirmaram que o nível de expressão DSCC1 é elevado em 60-70% dos tumores colorrectais, em comparação com a sua mucosa do cólon não canceroso correspondente. Um
in silico
avaliação do presumível
DSCC1 e região promotor para DNA consenso transcricional elementos reguladores revelou um potencial papel para a família E2F de proteínas de ligação de ADN no controle da expressão DSCC1. redução RNAi mediada por E2F1 reduzida expressão de DSCC1 em células de cancro colorrectal. Gain- e experiências de perda de função demonstrado que DSCC1 está envolvido na viabilidade das células do cancro em resposta a estímulos genotóxicos. Nós revelam que a expressão de E2F-dependente de DSCC1 confere propriedades anti-apoptóticos em células de cancro colorectal, e que a sua supressão pode ser uma opção útil para o tratamento de cancro colo-rectal
citação:. Yamaguchi K, Yamaguchi R, Takahashi N, Ikenoue t, Fujii T, Shinozaki M, et al. (2014) sobre-expressão de Coesão Estabelecimento Fator DSCC1 através E2F no câncer colorretal. PLoS ONE 9 (1): e85750. doi: 10.1371 /journal.pone.0085750
editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 28 de outubro de 2013; Aceito: 30 de novembro de 2013; Publicação: 17 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Yamaguchi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por Grant-in-Aid para Jovens cientistas (# 23.790.126), MEXT /JSPS, Japão para K. Yamaguchi, e da global COE Programa “Centro de educação e pesquisa para a medicina avançada baseada no genoma para a medicina ea personalizado controle de doenças infecciosas em todo o mundo “, MEXT /Japão Sociedade para a Promoção da Ciência, Japão para Y. Furukawa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é uma das neoplasias humanas mais frequentes no mundo. Em células CRC, interrupção de sistemas que regem a integridade genética ou epigenética torna características diferentes, tais como instabilidade cromossômica (CIN), instabilidade de microssatélites (MSI), e CpG fenótipo ilha methylator (CIMP). Uma grande maioria de tumores colo-rectais apresentam CIN que inclui alterações genéticas, tais como deleções grosseiras, amplificações, inversões, rearranjos, perda ou ganho de todo ou porções grandes de cromossomas, e translocações [1]. Um estudo anterior identificou mutações somáticas em cinco genes incluindo
MRE11
,
ZW10
,
ZWILCH
,
ROD
, e
DING
, entre 100 genes CIN-candidatos humanos que compartilharam similaridade com levedura ou voar “instabilidade” genes [2]. Seus dados sugerem que, pelo menos, uma das três funções, incluindo a reparação de dupla vertente pausa, função kinetochore, e segregação chromatid, é prejudicada em tumores CIN por mutação somática. Outro estudo procurou mutações de 102 homólogos humanos de genes CIN levedura em 132 cânceres colorretais. Consequentemente, eles identificaram um total de 11 mutações em cinco genes que incluíram quatro associado com a coesão de cromátides irmãs (
SMC1L1
,
CSPG6
,
NIPBL
, e
STAG3
, os homólogos de levedura
SMC1
,
SMC3
,
CAA2
, e
SCC3
, respectivamente) [3]. Desde cromátides irmãs de coesão é indispensável para os processos celulares como a segregação cromossômica, reparação de recombinação homóloga, e regulação da transcrição [4], as alterações genéticas nos componentes e reguladores devem desempenhar um papel crucial no CIN de tumores colorretais.
Nós previamente realizada análise do gene perfil de expressão no CRC [5], e identificou que a replicação do DNA e chromatid irmã coesão 1 (
DSCC1
, também conhecido como
DCC1
) foi frequentemente elevados em tumores colorretais em comparação com a mucosa do cólon não-cancerosas. Dcc1p, um homólogo de DSCC1, foi pela primeira vez identificado como um membro do factor de replicação alterativo complexo C (RFC) na levedura, e associados fisicamente com Ctf8p Ctf18p e [4]. A deleção do componente, Ctf18p, Ctf8p, ou Dcc1p, resultou em defeitos de coesão de cromatídeos irmãos graves, e aumento da sensibilidade à despolimerização de microtúbulos drogas, sugerindo que estes componentes são essenciais para a manutenção da integridade da cromatina [4]. Embora Dcc1p não era essencial para a viabilidade da levedura, supressão de Dcc1p levou a letalidade sintético em combinação com a mutação de outras proteínas irmã cromatídeos coesão [6]. Além da implicação na coesão de cromátides irmãs, o complexo CTF18-DSCC1-CTF8-RFC desempenha um papel crucial na replicação do DNA através da interacção com o ADN de cadeia simples e preparado como um carregador de antígeno nuclear de proliferação celular [7]. Além disso, a análise de redes genética de genes funcionalmente relacionados na levedura sugeriu que os componentes do complexo CTF18-DSCC1-CTF8-RFC interagir com o BUB via MAD /fuso checkpoint, o DNA via de reparo RAD51 para quebras de cadeia dupla, o dano ao DNA RAD9 checkpoint, eo TOF1 /MRC via replicação do DNA checkpoint [8], [9]. A descoberta de que a mutação em CTF18-RFC aumento tripleto repetição instabilidade corroboram a função deste complexo no ponto de controlo de ADN de replicação [10]. Estes dados indicaram que DSCC1 desempenha um papel importante na replicação, checkpoint fuso e reparo do DNA, o que nos levou a investigar se a expressão desregulada de DSCC1 está envolvido na tumorigénese colorectal humano.
Aqui, nós mostramos pela primeira vez que DSCC1 é frequentemente sobre-regulada no CRC, pelo menos em parte, através da activação da transcrição melhorada por E2F. Nós também revelam que a expressão elevada de DSCC1 confere quimiorresistência em células de CRC, fornecendo células tumorais com propriedades anti-apoptóticas. Estas descobertas irão contribuir para uma melhor compreensão do CRC, e servir como um ponto de partida para o desenvolvimento de novas estratégias para o diagnóstico e tratamento da CRC.
Materiais e Métodos
Ética declaração
Este projeto foi aprovado pelo comitê de ética do Instituto de Ciências Médicas, da Universidade de Tóquio (IMSUT-IRB, 21-14-0806). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes neste estudo. Todos os tecidos de câncer colorretal e correspondentes tecidos não cancerosos foram obtidos de espécimes cirúrgicos de pacientes submetidos à cirurgia.
cultura celular
CRC Humano linhas de células HCT116, HCT-15, SW480, DLD-1 , LoVo, Caco-2, LS174T, HT-29, e RKO foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Todas as células foram cultivadas em meio adequado suplementado com FBS (Life Technologies, Carlsbad, CA) e solução de antibiótico /antimicótico (Sigma, St. Louis, MO).
Preparação de plasmídeos que expressam DSCC1 e E2F
A região codificadora de
DSCC1
ADNc (GenBank N ° NM_024094) foi amplificado por RT-PCR utilizando um conjunto de iniciadores; iniciador de sentido directo: 5′-CCGGAATTCATGAAGAGGACCCGCGAC-3 ‘e o iniciador inverso: 5′-CGGCTCGAGAGAAATGGGTCTTCTCGAATTAT-3’ (nucleótidos sublinhados indicam os locais de reconhecimento de enzimas de restrição). Os produtos de PCR foram clonados no
Eco
RI e
Xho
locais I de pcDNA3.1 /myc-His. Nós, plasmídeos, adicionalmente, gerados expressando DSCC1 marcada com HA (pCAGGS-DSCC1). As construções de pcDNA3-HA-E2F foram gentilmente cedidas pelo Dr. JR Nevins (Duke University, Durham, NC).
Quantitative PCR e análise do número de cópias do gene
PCR em tempo real foi realizada utilizando o sistema LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Os ADN genómicos foram extraídos a partir de linhas celulares de CRC para a análise de número de cópias. Quantitative PCR foi realizada em ABI 7900HT Sequence Detection System Prism, utilizando sondas marcadas com FAM (5′-TCAGGTTTCCTACCTTCCGGCTGCTT-3 ‘) e um conjunto de iniciadores (directo: 5′-GGCGCGCTTTCAAACG-3′, reverso: 5’-3-GCGGGCAAGAAAGAAGTTCC ‘) para o
DSCC1
e TaqMan copiar o número de ensaios de referência RNase P como um controle quantitativo (Life Technologies). O número de cópias de
DSCC1
nas células cancerosas foi calculada em comparação com o DNA genômico de voluntários saudáveis utilizando CopyCaller Software.
fracionamento subcelular e immunoblotting
As células foram lisadas em radioimunoprecipita�o tampão de ensaio (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de Nonidet P-40, 0,1% de SDS), suplementado com um cocktail inibidor de protease Conjunto III (Calbiochem, San Diego, CA). Os extractos nucleares foram preparados utilizando o kit Nuclear Extract (motivo Activo, Carlsbad, CA). As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e análise de imunotransf erência foi realizada utilizando os anticorpos indicados. Peroxidase de rábano conjugado de cabra anti-ratinho ou anti-IgG de coelho (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) serviu como o anticorpo secundário para o sistema de detecção ECL (GE Healthcare).
A imunocoloração
primária Os anticorpos utilizados para coloração imuno-histoquímica e imunocitoquímica foram anti-DSCC1 (B01P, Abnova, Taipei, Taiwan) e anti-Myc (Sigma). A especificidade do anticorpo DSCC1 foi confirmado pelo bloqueio com a proteína recombinante DSCC1 (dados não mostrados). Estas experiências foram realizadas como descrito anteriormente [11].
A indução de apoptose e citometria de fluxo
Para o estudo da indução de apoptose, as células foram tratadas com camptotecina (Wako, Osaka, Japão), doxorrubicina (LC Laboratories, Woburn, MA), MG132 (Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha), ou exposto a irradiação y (Gammacell 40, Atomic Energy of Canada, Ontario, Canadá). Expressão de poli clivado (ADP-ribose) polimerase (PARP) e clivada da caspase-3 foi detectada por análise de Western blot utilizando anti-clivada PARP (9541) e anticorpos anti-3-caspase (9662), respectivamente (Signaling Technology celular, Danvers , MA). Avaliação da apoptose também foi realizada por anexina V e PI double-coloração usando Alexa Fluor 488 anexina V /Dead Cell Kit Apoptosis (Life Technologies). Resumidamente, as células cultivadas foram tratados com veículo ou camptotecina, durante 24 h. As células foram coradas com anexina V e PI, e, posteriormente, analisadas num FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), utilizando software FlowJo (árvore da estrela, Ashland, OR).
ensaio de viabilidade celular
expressam ARN curto hairpin (shRNA) utilizando um promotor U6 (psiU6BX3.0) foram preparados como descrito previamente [12]. Os plasmídeos que expressam DSCC1 shRNA (psiU6-shDSCC1) foram construídos por clonagem de oligonucleótidos de cadeia dupla no
Bbs
locais I do vector psiU6BX3.0. Duas sequências alvo, 5′-GUGGACAGAAGAAGAUAUU-3 ‘(shDSCC1 # 1) e 5′-GCAAACCAUAGGUGCAUUA-3′ (2 # shDSCC1), foram usadas para DSCC1 shRNAs. Como controlos negativos, preparamos um plasmídeo alvo reforçada proteína verde fluorescente (psiU6-shEGFP) e aqueles destinados sequências mexidos de shDSCC1 # 1 (5’-AAAUUGCGAAGGUGAUGAA-3 ‘; 1scr psiU6-shDSCC1 #) ou shDSCC1 # 2 (5’- AACACGUUAAUAACCGGUG-3 ‘; psiU6-shDSCC1 # 2scr). ensaios de viabilidade celular foram realizados como descrito anteriormente usando células HCT116, SW480 e RKO transfectadas com plasmídeos que expressam shEGFP, shDSCC1, ou embaralhar shDSCC1 [11]. Para investigar o efeito da sobreexpressão DSCC1 na proliferação de células, que transfectadas células SW480 e HCT116 com pCAGGS-DSCC1 e estabeleceu dois ou três clones estavelmente expressando DSCC1 exógeno. As células de controlo SW480 e HCT116 transfectadas com vector vazio, também foram estabelecidos como células simulados.
ensaios de repórter de Promotor e mutagénese dirigida
plasmídeos repórter da luciferase contendo o
DSCC1
promotor foram preparado por clonagem da região flanqueante 5 ‘de
DSCC1
no
Mlu
I e
Bgl
locais de enzimas de restrição II do vector pGL3-Basic (Promega, Madison, WI ). Um fragmento de DNA de aproximadamente 1,0 kb na região flanqueante 5 ‘de
DSCC1
foi amplificado por PCR utilizando ADN genómico a partir de voluntários saudáveis e um conjunto de iniciadores (directo: 5′-CGACGCGTATGTCTGCTCAGATCCTTTGAAT-3′, reverso : 5′-GAAGATCTCGCCGGGTCTAGGAGTCC-3 ‘). plasmídeos mutantes contendo substituições em sítios de ligação putativos de E2F o
DSCC1
promotor foram gerados por mutagénese dirigida ao local utilizando o QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). As células cultivadas em placas de 6 poços foram transfectadas com os plasmídeos repórter em conjunto com pRL-TK (Promega) utilizando FuGENE 6 de reagente. As células foram colhidas 24 horas após a transfecção, e actividades repórter foram medidas pelo sistema de luciferase duplo (TOYO B-líquido, Tóquio, Japão). Para o knockdown de expressão E2F1, E2F1 sintético siARN foi adquirido a partir de Sigma (sentido: 5′-GGGAGAAGUCACGCUAUGA-3 ‘, anti-sentido: 5′-AUAGCGUGACUUCUCCCCC-3’).
ensaio de imunoprecipitação da cromatina
para investigar a interação de E2F1 com o
DSCC1 e região promotor, a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio foi realizado de acordo com o protocolo Agilent Mammalian chip com ligeiras modificações. As células HCT116 foram reticulado com 1% de formaldeído, durante 10 min à temperatura ambiente e extinguiu-se com 0,4 M de glicina. extractos de cromatina foram cortados por digestão com nuclease microcócica, e subsequentemente os complexos DNA-proteína foram imunoprecipitadas com 3 ug de anticorpo policlonal anti-E2F1 (C-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ligado a anti-coelho Dynabeads revestidas com IgG ( life Technologies). IgG de coelho não-imune (Santa Cruz Biotechnology) foi utilizado como um controlo negativo. Os ADNs precipitados foram submetidos a análise quantitativa por PCR com um conjunto de iniciadores (para a frente (-26) 5′-CCGGAAACACGCCCATGGC-3 ‘e inverso (127) 5′-GGGTCCTCTTCATCGCAGC-3’) para amplificar o
DSCC1
a região do promotor. A especificidade do ensaio foi determinada por amplificação de uma região a montante distal na
DSCC1
promotor com os seguintes iniciadores: para a frente (-1279) 5′-AGTTGTAGGGAATGTTTCCCATT-3 ‘e inverso (-1111) 5’ GATTGGTTCATGTGACCTACTTC-3 ‘. Além disso, as amplificações de ciclo de divisão celular 2 (
CDC2
) e promotor da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (
GAPDH
) promotor foram utilizados para controlos positivos e negativos, respectivamente (iniciadores:
CDC2
frente 5′-CGCCCTTTCCTCTTTCTTTC-3 ‘,
CDC2
reversa 5′- ATCGGGTAGCCCGTAGACTT-3′,
GAPDH
frente 5′-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3 ‘,
GAPDH
reversa 5′- TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3 ‘).
resultados
a expressão de DSCC1 é frequentemente elevados em CRC
a fim de identificar novas moléculas-alvo para a tratamento e /ou de diagnóstico biomarcadores da CRC, que anteriormente realizada análise do perfil de expressão de tumores colorretais e seus tecidos colorretais normais pareados por cDNA microarray [5]. Entre os genes desregulados em tumores colorrectais, a expressão da replicação de ADN e uma coesão cromatídeos irmãos (
DSCC1
) foi aumentada mais de duas vezes em 5 de 7 cancros colo-rectais comparativamente com os correspondentes da mucosa do cólon não cancerosos (Figura 1A ). Em tempo real A análise de PCR subsequente usando um adicional de 20 tecidos de CRC e o correspondente mucosa não-canceroso revelou que
DSCC1
expressão foi elevada mais do que duas vezes em 12 dos 20 tumores (Figura 1A). Uma coloração imuno-histoquímica mostrou proteína DSCC1 acumulada em 29 de 40 tecidos de CRC em comparação com os correspondentes adjacente mucosa do cólon não cancerosos (Figura 1B). Embora nos procurou correlações entre a sua expressão e fatores clínico-patológicos incluindo a idade e sexo do paciente, localização, tamanho e dados histológicos dos tumores, como profundidade de invasão, comprometimento de linfonodos e vascular ou invasão de vasos linfáticos, nenhum dos factores foi significativamente associada com a expressão DSCC1 (Tabela S1). Além disso, a análise Western blot utilizando linhas celulares de CRC revelou que DSCC1 foi abundantemente expressa em HCT116,-DLD 1 células HT-29, e, e que foi expresso em níveis baixos em SW480, SW620 e células Caco-2 (Figura 1C) . Embora nós comparamos a estabilidade da proteína DSCC1 em HCT116 (DSCC1 de alta) e SW480 (DSCC1-baixo) células por ensaio cicloheximida perseguição, DSCC1 foi relativamente estável em ambas as células HCT116 e SW480. O tratamento com MG132, um inibidor de proteassoma também não aumentou a expressão DSCC1 (Figura S1A). Estes dados sugerem que a estabilidade da proteína não é susceptível de desempenhar um papel importante na expressão elevada de DSCC1 em células cancerosas.
(A) rácios de
DSCC1
em sete tecidos de cancro colorrectal para expressão relativa seus correspondentes tecidos normais em nossos dados de microarray (painel superior). os níveis de expressão relativa da
DSCC1
em um 20 tumores colo-rectais adicionais e o correspondente mucosa não-canceroso foi analisada por PCR quantitativa (painel inferior). Quantidade de
DSCC1
foi normalizada para expressão
HPRT1
. eixo Y indica a proporção da média de
expressão DSCC1
no tumor a que no tecido normal correspondente. Os dados representam média ± DP a partir de experiências em triplicado. (B) Imagem representativa de coloração imuno-histoquímica de DSCC1 em um tecido de câncer de cólon humano contendo células cancerosas e mucosa normal adjacente. (C) A expressão da DSCC1 em linhas celulares de CRC foi detectada por transferência Western usando anticorpo anti-DSCC1. (D) As células HCT116 foram sondadas com anticorpo anti-DSCC1 seguido por anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com FITC (verde). Os núcleos foram contra-coradas com DAPI (azul). (E) HCT116, RKO e DLD-1 As células foram separadas para a citoplasmática (CF) e fracções nucleares (NF), e as proteínas citoplasmáticas e nucleares foram sujeitos a SDS-PAGE seguido de western blotting. A pureza das fracções foi determinada pela presença de β-tubulina (marcador citoplasmático) e lamina B (marcador nuclear). (F) Cópia análise número de
DSCC1
em oito linhas celulares de CRC e células HEK293. número de cópias relativa de
gene DSCC1
foi determinada por PCR quantitativa usando
RPPH1
como uma referência endógena. O número de cópias foi calculado dividindo-se os seus produtos de PCR por aqueles de leucócitos periféricos de voluntários saudáveis, e em seguida multiplicando por 2.
análise imuno-histoquímica inesperadamente representado DSCC1 acumulada no citoplasma e núcleo de cancro DSCC1-positiva células (Figura 1B), embora Dscc1 foi reportada desempenhar um papel no estabelecimento de coesão durante a replicação de ADN na levedura. Para elucidar a sua localização subcelular, realizou-se coloração imunocitoquímico de DSCC1 endógena em células HCT116. Consistente com a coloração imuno-histoquímica de tecidos de cancro, DSCC1 proteína foi localizada em ambas citoplasma e no núcleo (Figura 1D e S1B). Além disso, a análise Western blot utilizando fracções citoplasmática e nuclear extraído de HCT116, RKO e DLD-1, células (Figura 1E) e células que expressam marcada com myc DSCC1 confirmou a sua localização subcelular no citoplasma bem como no núcleo (Figura S1C e S1D) .
Copiar análise número de
DSCC1
Para abordar se a amplificação do gene está envolvida no superexpressão DSCC1, realizamos a análise do número de cópias por PCR quantitativa utilizando RNase P como um controle . Comparado com leucócitos periféricos de voluntários saudáveis, o número de cópias de
DSCC1
não foi aumentado em quaisquer linhas celulares de CRC testados (Figura 1F). Vale a pena notar que uma diminuição no número de cópias foi observada em células HT-29 que expressa abundantemente DSCC1 (Figura 1C). Analisamos ainda mais número de cópias alteração do
DSCC1
no cólon e adenocarcinoma do recto (O projeto Cancer Genome Atlas Cancer Colorectal), utilizando o banco de dados cBioPortal (https://www.cbioportal.org/public-portal/). Como resultado, as alterações no número de cópias putativa foram encontrados em 7 de 257 adenocarcinomas colorretais (2,7%), sugerindo que a amplificação do
DSCC1
não desempenha um papel importante na expressão aumentada DSCC1.
Regulamento do
DSCC1
atividade do promotor
Para resolver o mecanismo de expressão DSCC1 elevada no CRC, investigamos a atividade do promotor de
DSCC1
em células HCT116. ensaio de repórter usando plasmídeos que contêm uma região flanqueante 5 ‘de
DSCC1
(pDSCC1-1023 /+ 109) mostrou que esta região tem uma actividade de promotor substancial (dados não mostrados). Na região, identificamos um motivo putativo E2F-vinculativo, EBS1 (-3 /+ 5; 5′-CTTGGCGC-3 ‘) usando o Jaspar (https://jaspar.genereg.net/) e bases de dados TFSEARCH (http: //www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (Figura 2A). Este sítio de ligação putativo partilhada elevada similaridade com o motivo de consenso para a E2F, TTTSSCGC com S = G ou C. Uma vez que os factores de transcrição E2F são frequentemente desregulada em uma variedade de tumores, testou-se o efeito de E2F no
DSCC1
a actividade do promotor. Embora E2F1, E2F2, E2F3, E2F4 e aumentou a actividade do promotor, E2F6 não alterou a actividade. E2F1, que mostrou a indução mais forte entre os quatro membros, aumentada a actividade de uma forma dependente da dose (Figura 2B e S2A). Esta melhoria também foi observada em outras linhas celulares, incluindo LoVo, HeLa e HEK293 (dados não mostrados). Para analisar o possível envolvimento de EBS1 no acessório, medimos a actividade repórter usando as construções pDSCC1-10 /+ 109 e 10 + /+ 109, na presença ou ausência de E2F1 (Figura 2C). actividades repórter basal destes plasmídeos repórter não foram significativamente diferentes na ausência de plasmídeos E2F1. Supressão de EBS1 (pDSCC1 + 10 /+ 109) diminuiu drasticamente a actividade repórter induzido por E2F1 (a partir de 20,4 vezes a 3,2 vezes). Inesperadamente, o aumento da atividade de repórter por E2F1 ainda foi observada em + 10 /+ 109. Além disso deleção de até 70 do promotor (pDSCC1 + 70 /+ 109) completamente diminuída actividade repórter induzido por E2F1 (Figura 2C). De acordo com este resultado, encontramos dois EBSS presuntivo adicional, EBS2 (+ 31 /+ 38; 5′-CTTCCGGC-3 ‘) e EBS3 (+ 57 /+ 64; 5′-TTGCCCGC-3’) na região entre +10 e +70. Para abordar as responsabilidades de EBS1, EBS2, e EBS3 para a indução, preparámos quatro construções repórter mutante (Figura 2D), substituindo o segmento rico em GC em motivos de consenso de E2F, TTTSSCGC (S = C ou G) ou STTTS, porque estes núcleo motivos teriam sido crucial para E2F de ligação [13], [14]. Em comparação com o tipo selvagem pDSCC1-10 /+ 109 (14,8 vezes de indução), ambos os tipos de plasmídeos EBS1-mutante (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1, e Mut1 ‘) diminuiu notavelmente a actividade repórter em resposta a E2F1 (5,2-dobra e 5,8 vezes, respectivamente). As mutações em ambos EBS1 e EBS2 (pDSCC1-10 /+ 109 + Mut1 2) diminuiu ainda mais na actividade induzida por E2F1 (3,7 vezes). contendo substituições mutante plasmídeo repórter nos três elementos (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1 + 2 + 3) quase diminuiu o aumento (1,7 vezes), sugerindo que os três motivos de ligação a E2F são responsáveis pela regulação da
DSCC1
atividade do promotor.
(a) sequência de nucleótidos do humano região -10 a +90 bp
DSCC1
. Três motivos de ligação a E2F putativos estão sublinhados. (B) pDSCC1-1023 /+ 109 foi transientemente transfectada com pRL-TK e pcDNA3 HA-E2F em SW480, ou com pRL-TK e pcDNA3 HA-E2F1 (0,01-1 ug) em SW480 e células HCT-116. (C) pDSCC1-10 /+ 109 ou as construções de promotor mais curtos foi transfectada com E2F1 ou o vector vazio em células SW480. (D) a análise de mutação dirigida ao local de sítios putativos de ligação E2F na região promotora proximal. pDSCC1-10 /+ 109 ou seus clones mutantes foram transfectados com o vector de E2F1 ou vazio em células SW480. Os dados representam média ± SD de três experiências independentes. atividade do promotor indica a unidade luciferase parente ou a indução vezes sobre transfectante vector vazio. (E) Cromatina imunoprecipitação foi realizada utilizando anticorpos anti-E2F1. Os ADNs precipitados foram sujeitos a amplificação de
DSCC1
promotor por PCR quantitativa. Para determinar a ligação ao EBS, a amplificação de uma região a montante distal na
DSCC1
promotor foi utilizado para normalização específicas. Uma diferença significativa foi determinada pelo teste t. As células HCT-116 (F) foram transfectadas com ARNsi de controlo ou E2F1 (25 nM) durante 48 h.
DSCC1
expressão foi detectada por PCR quantitativa. Uma diferença significativa foi determinada pelo teste t. células SW480 (g) foram transfectadas com ARNsi de controlo ou E2F1 (25 nM), seguido de 8 h mais tarde através de transfecção com o plasmídeo repórter (pDSCC1-10 /+ 109) e o vector de expressão E2F1 ou o vector vazio. Após 48 h, a actividade da luciferase foi medida. Os dados representam média ± SD de três experiências independentes.
Interação de E2F1 com o
DSCC1 e região promotora
Para determinar se E2F1 se liga à região promotora de
DSCC1
, foi realizado ensaio ChIP quantitativa realizada com o anticorpo anti-E2F1 e um conjunto de primers, abrangendo os três elementos E2F-ligação putativos. O promotor do gene da divisão do ciclo celular 2 (
CDC2), um alvo E2F1 bem conhecido, foi enriquecida de 13,4 vezes com o ADN imunoprecipitado (Figura S2B). Expectedly, o
DSCC1 e região promotora foi enriquecido em até 15,4 vezes no DNA, o que sugere uma interação da região promotora
DSCC1
com E2F1 (Figura 2E).
Para confirmar o envolvimento de E2F1 na regulação da expressão DSCC1, nós investigamos o efeito de silenciamento de expressão em E2F1 DSCC1. PCR em tempo real e análises de Western blot mostrou que a diminuição de E2F1 diminuição da expressão DSCC1 (Figura 2F e S2C). knockdown mediada por ARNi da actividade E2F1 foi confirmada por ensaio de repórter que mostra uma redução significativa da
DSCC1
actividade do promotor de 10.4 (Ctrl siARN) a 4,7 vezes por E2F1 siRNA em células SW480 (Figura 2G). Estes resultados sugeriram que
DSCC1
transactivação é, pelo menos em parte, regulada pelo E2F1 em CRC através da sua interacção com a região promotora de
DSCC1
, e que os três EBSS desempenhar um papel importante na activação da transcrição. Para investigar mais se a expressão DSCC1 é modulada por E2F atividade transcricional, comparamos a expressão relativa da
DSCC1
com
CDK1
(
CDC2
), com a leitura da atividade transcricional E2F , utilizando-se dois conjuntos de dados independentes (e-MEXP-3715 e GEOD-23878) no banco de dados Atlas Gene Expression (https://www.ebi.ac.uk/gxa/). Nos conjuntos de dados,
DSCC1
e
CDK1
foram significativamente sobre-regulada em tumores colorretais em comparação com os tecidos normais do cólon (Figura 3). Notavelmente, ambos os conjuntos de dados calculados valores elevados de coeficiente de correlação (E-MEXP-3715,
r
= 0,912 e GEOD-23878,
r
= 0,864) entre
DSCC1
e
CDK1
, apoiando a visão de que
DSCC1
é outro gene a jusante regulada por E2F.
Esta associação foi demonstrada por dois conjuntos de dados de microarranjos, e-MEXP-3715 (a) e GEOD-23878 (B), na base de dados Atlas Gene Expression (https://www.ebi.ac.uk/gxa/). coeficiente de correlação de Pearson (r) entre
DSCC1
e
CDK1
valores de expressão foi então calculado para avaliar a sua correlação.
Efeito da DSCC1 sobre a proliferação de CRC células
Para abordar o papel da sua expressão elevada em células de CRC, nós investigamos se DSCC1 está envolvida na proliferação de células cancerosas. Foi realizado ensaio de viabilidade celular utilizando plasmídeos que expressam tanto DSCC1 shRNA (shDSCC1 # 1, ou 2 shDSCC1 #) e o gene resistente à neomicina. Os plasmídeos contendo a sequência de mexidos DSCC1 shRNAs (shDSCC1 # 1scr e 2scr shDSCC1 #) e o plasmídeo contendo EGFP shRNA (shEGFP) serviram como controlos. A transfecção com estes DSCC1 shRNAs (shDSCC1 # 1, ou 2 shDSCC1 #) reduziu a expressão de DSCC1, ao passo que a transfecção com os controlos (shEGFP, shDSCC1 # 1scr e 2scr shDSCC1 #) não teve nenhum efeito (Figura 4A). As células HCT116 foram cultivadas em meios contendo concentrações adequadas de G418 e a viabilidade celular foi medida. Verificou-se que o número de células viáveis transfectadas com DSCC1 # 1 ou DSCC1 # 2 shRNA foi significativamente diminuída em comparação com as transfectadas com EGFP, DSCC1 # 1scr, ou DSCC1 # 2scr shRNA, indicando que DSCC1 desempenha um papel na viabilidade das células cancerosas (Figura 4B). Consistente dados foi obtida em SW480 e células RKO (Figura S3A). Estes resultados foram confirmados em experiências repetidas.
Células HCT116
(A) foram transfectadas com o controlo (Mock e EGFP) e DSCC1 shRNAs durante 48 h utilizando o kit de Nucleofector, e análise de Western blot foi realizada. Expressão de β-actina serviu como um controlo. (B) a viabilidade das células transfectadas com shRNAs foi medida por ensaio de WST-8. Os dados representam média ± SD de três transf ecções independentes. Os valores de P foram calculados pelo teste de Dunnett para comparações múltiplas de células shEGFP-transfectadas. (C) A sobre-expressão de DSCC1 em células SW480 foi confirmada por transferência Western usando anticorpo anti-DSCC1. número equivalente de três células simuladas e três DSCC1 foi plaqueada em placas de 96 poços, e os ensaios de proliferação celular foram realizadas nos pontos de tempo indicados. Os dados representam SD ± média de cinco experimentos. Uma diferença significativa entre as células simuladas e DSCC1 foi determinada por two-way ANOVA de medidas repetidas.
Além disso, nós estabelecemos SW480 células que expressam constitutivamente DSCC1 exógena, e comparou a sua proliferação com células de controlo transfectadas com simulação vetor (Figura 4C). Consistente com os dados DSCC1-knockdown, células que expressam DSCC1 exógena mostrou proliferação celular aumentada em comparação com células SW480 parentais ou células de controlo (
p
= 2,2 × 10
-5). Da mesma forma, exógeno DSCC1-expressão aumentada da proliferação de células HCT116 (Figura S3B).
Papel de DSCC1 na indução de apoptose
Desde E2F1 conferiu resistência a insultos genotóxicos [15], [16 ], [17], que ainda investigado se a expressão elevada DSCC1 desempenha um papel na sensibilidade das células cancerosas à genotóxico estímulos. SW480 células que expressam DSCC1 exógeno (SW480-DSCC1 # 1, # 3 e # 8) foram expostas a irradiação y, e a indução da apoptose foi analisada por imunotransf erência com anticorpos anti-PARP clivada.