Abstract

Calcyclin-ligação às proteínas (CacyBP /SIP), identificado com base em sua capacidade de interagir com S100 proteínas de uma forma dependente de cálcio, verificou anteriormente para inibir a proliferação e a tumorigénese de células gástricas cancerosas no nosso laboratório. Mais importante, os efeitos das proteínas S100 no comportamento biológico da CacyBP /SIP em cancro gástrico permanecem obscuros. Relata-se a construção de vectores de expressão eucariotas para o tipo selvagem CacyBP /SIP e um mutante truncada sem o domínio de ligação da proteína S100 (CacyBP /SIPΔS100). As expressões do tipo selvagem e proteínas recombinantes truncadas foram demonstrados por transfecção de células de câncer gástrico MKN45. ensaios de co-imunoprecipitação demonstrou interação entre S100A6 e do tipo selvagem CacyBP /SIP em células MKN45. A remoção do domínio de ligação a proteína S100 reduziu dramaticamente a afinidade de CacyBP /SIP para proteínas S100, tal como indicado pela redução de co-imunoprecipitação de S100A6 por CacyBP /SIPΔS100. O experimento ensaio de MTT, ensaio FACS, ensaio clonogênica e xenotransplante tumoral foram realizados para avaliar o efeito da CacyBP /SIP no crescimento celular e tumorigênese

in vitro

e

in vivo

. Superexpressão de CacyBP /SIP inibiu a proliferação e tumorigénese de células de câncer gástrico MKN45; as taxas de proliferação e Tumorigênese foram ainda mais reduzidos pela expressão de CacyBP /SIPΔS100. Também mostrou que as proteínas S100 regular negativamente a inibição CacyBP /SIP-mediada de proliferação de células do cancro gástrico, através de um efeito sobre a expressão da proteína β-catenina e de activação da transcrição de Tcf /LEF. Embora o mecanismo subjacente da ação requer uma investigação mais aprofundada, este estudo fornece uma nova visão sobre a interação entre as proteínas S100 e CacyBP /SIP, que pode enriquecer o nosso conhecimento das proteínas S100 e ser útil para a nossa compreensão do desenvolvimento de câncer gástrico.

Citation: Ning X, Sun S, Zhang K, Liang J, Chuai Y, Li Y, et al. (2012) S100A6 Protein Negativamente Regula CacyBP /SIP-Mediated inibição de câncer gástrico proliferação celular e Tumorigênese. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10.1371 /journal.pone.0030185

editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Itália |

Recebido: 27 de outubro de 2011; Aceite: 15 de dezembro de 2011; Publicação: 25 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ning et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do National Nature Science Foundation da China (No. 30.872.964, No. 30.772.461). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução proteínas

S100 são o maior subgrupo dentro da EF-hand Ca

2 + liga�o ao família de proteínas e são caracterizados pela sua células e padrões de expressão específica do tecido. Estas proteínas são conhecidas por regular os processos intracelulares, tais como a transição do ciclo celular e crescimento celular, diferenciação e motilidade [1]. Uma característica única destas proteínas é que os membros individuais são localizados em compartimentos celulares específicos a partir dos quais alguns são capazes de mudar em cima Ca

2 + ativação [2], [3]. Após translocação, estas proteínas podem transduzir o sinal de Ca

2+ de uma forma temporal e espacial, interagindo com diferentes alvos específicos para a proteína S100. Curiosamente, a maioria dos genes S100 estão localizados em um agrupamento de genes no cromossoma humano 1q21, um local de anomalias cromossómicas frequentes [4]. Esta associação sugere uma ligação entre anormalidades cromossômicas e a desregulação da expressão do gene S100 em vários tumores. Até à data, muitos membros da família foram identificados S100 para ser associada com o desenvolvimento de tumores e metástase [5], [6]. No entanto, os papéis precisos e importância das proteínas S100 no desenvolvimento e promoção do câncer são mal compreendidos. Compreensão da função biológica (s) de proteínas S100 dependerá da identificação de alvos de proteína S100. Até agora, diversos alvos possíveis de proteínas, incluindo da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato, anexina II, anexina VI, XI anexina, caldesmona e CacyBP /SIP, têm sido mostrados para interagir com proteínas S100

in vitro

numa Ca

2 + maneira dependente [5], [7].

Calcyclin de ligação a proteína (CacyBP /SIP), uma proteína de 30 kDa identificado com base na sua capacidade para interagir com S100A6 numa Ca

2 + forma dependente em Ehrlich ascites tumor (EAT) células [8], foi previamente pensado como uma molécula de resistência a múltiplas drogas (MDR) -relacionados no câncer gástrico em nosso laboratório [9]. Através da utilização de um anticorpo monoclonal contra CacyBP /SIP [10], que demonstraram que a sobre-expressão de CacyBP /SIP e inibe a proliferação de células cancerosas tumorigênese renais [11]. Além disso estudo sugeriu que CacyBP /SIP suprime o crescimento de cancro gástrico [12]. Apesar deste progresso, os efeitos das proteínas S100 sobre CacyBP /SIP no câncer gástrico permanecem obscuros. Além disso, CacyBP /SIP também foi encontrado para ser um componente de um complexo de ubiquitinação através Siah1 e Skp1 [13] de ligação. E este ligase foi descrito para regular a degradação de β-catenina fosforilada não-[13].

CacyBP /SIP pode ligar S100, Siah1 e Skp1 por diferentes regiões. A região N-terminal (aa 1-80) de CacyBP /SIP tem sido demonstrado que têm afinidade para Siah1. A região C-terminal da CacyBP /SIP (aa178-229) é conhecido por formar um α-hélice; Este domínio pode interagir com as proteínas S100, incluindo S100A6 [14]. domínio de ligação Skp1 não se sobrepõe a região de ligação do S100 e Skp1 liga a parte do meio (aa78-155) de CacyBP /SIP [15], [16]. Para observar os efeitos das proteínas S100 sobre o comportamento biológico de CacyBP /SIP no câncer gástrico, os vectores de expressão eucarióticos para o tipo selvagem CacyBP /SIP e seu mutante truncada sem o domínio de ligação da proteína S100 (CacyBP /SIPΔS100), foram construídas com sucesso e eficácia expressas em células MKN45. Um ensaio de MTT, ensaio FACS, ensaio clonogênica e xenotransplante tumoral experimento foram realizados para avaliar os efeitos da CacyBP /SIP no crescimento celular e tumorigênese ambos

in vitro

e

in vivo

. Os resultados destes estudos podem contribuir para a elucidação dos efeitos das proteínas S100 no comportamento biológico da CacyBP /SIP em células de cancro gástrico.

Materiais e Métodos

linhas celulares e animais

a linha de células de câncer gástrico MKN45, que foi encontrado para ser o menor expressão de CacyBP /SIP em nosso estudo anterior [12], foi preservada em nosso laboratório. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 10% de soro inactivado por calor de vitelo fetal, penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /ml) num CO

2 incubadora (Forma cientícas, Marjetta, OH, EUA). ratinhos nus BALB /c de 4-6 semanas de idade foram fornecidos pelo Instituto do Câncer de Xangai para o

in vivo

estudo tumorigênese. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Quarta Universidade Médica Militar (Permit Number: 11016). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todo esforço foi feito para minimizar o sofrimento.

Imunofluorescência coloração

As células foram semeadas em lamelas limpas e fixadas com álcool 95% para 20 min na sala temperatura. As células sobre as lamelas foram lavadas com PBS e permeabilizadas durante 10 minutos com 0,5% de Triton X-100 em PBS. As células foram incubadas com anticorpo anti-S100A6 (diluído 1:2000) Após bloqueio com 3% de albumina de soro bovino durante 1 h. As células foram então incubadas com conjugado de IgG-FITC anti-murganho (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, EUA) e montadas em lâminas de vidro com uma mistura de glicerol e álcool polivinílico contendo DABCO (1,4- diazobicylo- [2,2 , 2,] – octano). Imunofluorescência foi analisada com um MRC-1024 Laser Scanning confocal Imaging System (Bio-Rad).

construção de plasmídeo e transfecção de células

Os iniciadores oligonucleotidicos contendo o

Eco

RI ou

local de restrição de Eco RV

foram sintetizados, respectivamente, para a amplificação da sequência de CDS CacyBP /SIP ou um mutante de deleção do terminal C (aa178-229) de CacyBP /SIP (Adesão AF_314752). Os dois primers foram: 5 ‘gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3’ (sentido directo) e 5 ‘gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3’ (anti-sentido); 5 ‘gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3’ (sentido directo) e 5 ‘ccgatatcacacaatataagaactgta 3’ (anti-sentido), respectivamente. As condições de PCR foram: 5 min a 94 ° para a desnaturação inicial, seguido por 35 ciclos de 45 seg a 94 ° C, 45 seg a 60 °, e 60 seg a 72 °, com uma extensão final de 10 min a 72 °. Os comprimentos dos produtos de PCR eram 687 pb para a CDS e de 534 pb para eliminação C-terminal. Cada produto da PCR foi retirado com

EcoR

I e

EcoR

digestão de restrição V e clonados igualmente digerido pFLAG-CMV. Os novos vetores foram nomeados pFLAG-CacyBP (tipo selvagem) e pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). As sequências de inserção foi confirmada por sequenciação de ADN.

transfecção das células foi realizada com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) como descrito pelo fabricante. Resumidamente, as células foram plaqueadas e crescidas a 70-90% de confluência, sem antibióticos. Eles foram então transfectadas com 1 ug pFLAG-CacyBP ou pFLAG-ΔS100. Ao fim de 24 h após a transfecção, de G418 (350 mg /mL) foi adicionada ao meio de cultura para a selecção de células transfectadas. Os clones foram expandidos misturados durante mais 6 semanas. As células transfectadas com vector vazio, pFLAG-CMV, foram usadas como um controlo negativo. Estas linhas celulares estáveis ​​foram nomeados MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 e MKN45-pFLAG para o tipo selvagem, transfectantes de controlo truncadas e negativos, respectivamente.

Co-imunoprecipitação

Os transfectantes MKN45 foram lavadas em PBS, colhidas e submetidas a lise em gelo num tampão contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5), MgCl 8 mM

2, 150 mM de NaCl, 0,2 mM de EGTA, e 1% de Nonidet P-40. Os extractos foram centrifugados a 12000 rpm durante 25 min a 37 ° numa microcentrífuga. Os sobrenadantes foram utilizados para um ensaio de imunoprecipitação após a adição de inibidores de protease (10 mg /L de leupeptina, 5 mg /L de aprotinina, 20 mg /L de inibidor de tripsina de soja, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM) e quantificada através do método de Bradford. Os sobrenadantes foram incubados com 30 ul de proteína A /G-Sepharose e anticorpo não relacionado 1 ug durante 1-3 h a 37 ° C (pré-depuração). As fracções não ligadas foram, então, incubadas com soro contendo anticorpos contra CacyBP /SIP durante 1,5 h a 4 ° C. A mistura foi, em seguida, incubadas com proteína adicional A /G-Sepharose durante a noite a 4 ° C. A resina foi então lavada três vezes num tampão contendo Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) e 150 mM de NaCl, duas vezes num tampão contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5) e NaCl 500 mM, e, finalmente, em 20 mM de Tris -HCl a pH 7,5. Todos os tampões que foram utilizados foram suplementados com os inibidores de protease. As proteínas de resina e ligados foram solubilizados em tampão de amostra de SDS, fervidos durante 5 min a 98 °, e aplicada a um gel de poliacrilamida SDS. A expressão de S100A6 foi analisada por Western blotting com anticorpo contra S100A6.

Western blot

As células foram colhidas e lisadas em gelo em um tampão contendo [50 mmol /L de Tris-Cl (pH 7,5), 150 mmol /L de NaCl, 0,2 mmol /L de EDTA, 1 mmol de PMSF G /e 1% de NP 40], e depois quantificado pelo método de Bradford. Uma medida de 100? G de lisados ​​foi sujeito a electroforese em 10% SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com leite isento de gordura a 10% à temperatura ambiente durante 2 h e incubadas com anti-CacyBP (1:1500) e anti-actina β anticorpo (Sigma, 1:5000) a 4 ° durante a noite. Depois de três lavagens de 15 minutos cada uma em TBS suplementado com 0,1% de Tween 20 (TBST), a membrana foi incubada com cabra conjugado com peroxidase anti-rato /anticorpo IgG de coelho (Amersham-Pharmacia Biotech, Pequim, China) durante 2 h a sala temperatura. quimioluminescência aumentada (Amersham, Freiburg, Alemanha) foi usada para a detecção.

Metil tiazolilo tetrazólio (MTT)

As células foram semeadas numa placa de 96 poços a 2,5 x 10

3 células /poço em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de vitela inactivado pelo calor. Cada amostra tinha três repetições. O meio foi substituído com intervalos de 2 dias, durante 6 dias. As células foram incubadas com 50 uL de 0,2% de MTT durante 4 horas a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera. Após a incubação, MTT, uma alíquota de 150 ul de DMSO a 100% foram adicionados a cada cultura para dissolver os cristais. As células viáveis ​​foram contadas todos os dias através da leitura da absorvância a 490 nm utilizando um leitor de placa de 96, BP800 (Dynex Technologies, Chantilly, VA).

ciclo celular análise

subconfluentes de células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, suspensos em 0,5 ml de etanol e, em seguida, mantida a 4 ° C durante 30 min. A suspensão foi filtrada através de uma malha de nylon de 50 um, e o conteúdo de ADN de núcleos corados foi analisada com um citómetro de fluxo (EPICS XL, Coulter, Miami, FL). O perfil do ciclo celular foi analisada utilizando-ADN Multicycle Ciclo Celular Software analisado. Os índices de proliferação (PI) foram calculados como segue:. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2)

clonogênica ensaio

Para medir a taxa de proliferação de uma única célula

in vitro

, placa clonogênica e ensaios clonog�icas agar mole foram realizadas [17]. Para o ensaio clonogénico placa, 1 × 10

3 as células foram semeadas num prato de 9 cm e cultivadas em meio RPMI 1640 durante duas semanas para permitir a formação de colónias. As colónias foram fixadas em etanol a 70%, corados com solução de Giemsa e contadas. Para o ensaio clonogénico agar mole, as células foram destacadas e colocadas em 0,3% de agarose com um subpavimento de agarose a 0,5% (1 × 10

3 /poço numa placa de 24 poços). O número de focos 100 um foi contado após 20 dias

O crescimento do tumor em ratinhos nus

células de crescimento logarítmico (1 × 10

7 células) foram tratadas com tripsina, ressuspendeu-se em 0,1. D’ml de solução de Hanks, e injectado na hypodermia pescoço de cada ratinho nu atímicos. Os murganhos foram então monitorizados durante o volume do tumor, saúde geral, e o peso total do corpo. O tamanho da massa do tumor subcutâneo foi medido com um compasso de cinco semanas. O volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula: 0,5 x comprimento x largura

2. Cada grupo experimental consistiu de cinco ratos.

Reporter ensaio de gene

Para analisar o efeito de CacyBP /SIP e CacyBP /SIPΔS100 sobre a atividade transcricional de Tcf /LEF, o ensaio de gene repórter foi realizada como descrito [18]. Resumidamente, as células em uma placa de 24 poços (50.000 células por poço) foram co-transfectadas com ou sem pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 e o plasmídeo repórter, pTOPFLASH, contendo locais Tcf /ABL de ligação do tipo selvagem usando Lipofectamine 2000; PRL-TK

Renilla

repórter luciferase serviu como um controlo para a eficiência de transfecção. A actividade de luciferase foi medida e quantificada num luminómetro utilizando a luciferase dupla Reporter Assay System (Promega, Southampton, R.U.). As experiências foram realizadas em triplicado e repetidas duas vezes. Os resultados são expressos como a média da relação entre a actividade da luciferase do pirilampo e a actividade da luciferase de Renilla.

A análise estatística

Todos os dados foram analisados ​​utilizando o pacote de software estatístico SPSS (SPSS, Inc., Chicago, Illinois), e

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A significância da diferença na frequência de CacyBP /coloração SIP-positiva entre amostras tumorais adjacentes e os tumores foram analisados ​​pelo teste de Qui-quadrado. Estudante de

t

de teste e one-way análise de variância seguido por testes de comparação múltipla de Dunnett foram empregados para análise de outros dados.

Resultados

expressão endógena de S100A6 no câncer gástrico linha de células MKN45

S100A6 foi selecionado como um modelo para observar o efeito das proteínas S100 sobre a função biológica do CacyBP /SIP. A expressão endógena de S100A6 na linha de células de câncer gástrico MKN45 foi detectada pela primeira vez por western blot e imunofluorescência. Como mostrado na Fig. 1A, S100A6 foi expressa em células MKN45. imunofluorescência indica que S100A6 foi distribuído principalmente na membrana nuclear com muito pouco encontrada no plasma nuclear das células MKN45 (Fig. 1B).

(A) a expressão endógena de S100A6 nas células do câncer gástrico MKN45 foi detectada por western blot. (B) coloração de imunofluorescência de S100A6 em células MKN45. (A) coloração de imunofluorescência de S100A6 com o anticorpo anti-S100A6 (em verde); (B) detecção de núcleos com iodeto de propídio (a vermelho); (C) imagem Fundido.

Interação de S100A6 e CacyBP /SIP em células cancerosas gástricas MKN45

Em um relatório anterior, CacyBP /SIP, que foi expressa em um nível relativamente baixo em células MKN45, foi amplamente expressa em vários tipos diferentes de linhas celulares de cancro gástrico [12]. A fim de avaliar a interacção entre S100A6 e CacyBP /SIP, de tipo selvagem e mutante (aa178-229) CacyBP /SIP cDNAs foram clonados no vector pFLAG-CMV e transfectado estavelmente em células MKN45. Foi avaliada a expressão de CacyBP /SIP nestas linhas celulares estáveis ​​através de Western blot. Como mostrado na Fig. 2A, marcado com FLAG CacyBP /SIP foi detectado na de tipo selvagem e transf ectantes CacyBP /SIP mutantes com anticorpo anti-Flag, enquanto nenhum sinal foi encontrado em células transfectadas com vector vazio

.

(A) Western blot análise do transfectantes CacyBP /SIP e CacyBP /SIPΔS100 transfectantes com anticorpos anti-FLAG e anti-CacyBP. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (B) ensaio de co-imunoprecipitação para detectar uma interação entre S100A6 e CacyBP /SIP em células MKN45. Após a incubação com o anticorpo anti-CabyBP, os locais de ligação foram detectados por anticorpos anti-S100A6.

A interacção entre S100A6 e CacyBP /SIP em transfectante de células MKN45 foi então avaliada por co-imunoprecipitação. Após a incubação com o anticorpo anti-CacyBP, imunoprecipitado pelo anticorpo foram detectados S100A6. Como mostrado na Fig. 2B, uma interacção entre S100A6 e de tipo selvagem CacyBP /SIP foi observada em lisados ​​de células MKN45-CacyBP; No entanto, CacyBP mutante /SIP que foi truncada a partir da região aa178-229, produzido pouco do sinal no ensaio de co-imunoprecipitação. Portanto, o truncada mutante CacyBP /SIP foi nomeado CacyBP /SIPΔS100 e fornece uma ferramenta útil para a investigação dos efeitos da S100A6 sobre o comportamento biológico de CacyBP /SIP em células cancerosas gástricas.

Efeitos de S100A6 sobre a proliferação celular induzida por CacyBP /SIP na linha de células de câncer gástrico MKN45

in vitro

MTT e FACS ensaios foram realizados para examinar os efeitos de S100A6 sobre a proliferação celular induzida por CacyBP /SIP em células MKN45

in vitro

. Em comparação com os transfectantes vector vazio, MKN45-pFLAG, tanto de tipo selvagem e /CacyBP SIPΔS100 transfectantes mostrou diminuiu significativamente as taxas de proliferação de células pelo ensaio MTT (

P

0,05) (Fig. 3A). No entanto, CacyBP /SIPΔS100 transfectantes apresentaram significativamente mais diminuição da taxa de crescimento em comparação com o tipo selvagem transfectantes CacyBP /SIP (

P

0,05).

(A) determinação da taxa de crescimento celular

in vitro

. O número de células foi avaliada pela absorvância a 490 nm, utilizando o ensaio de MTT nos tempos indicados. O valor mostrado representa a média de três determinações. (B) distribuição do ciclo celular e os índices de proliferação (IP) das células transfectadas. As células foram extraídos detergente, coradas com iodeto de propidio, e analisados ​​por citometria de fluxo. PI = (G2 + S) /(S + G1 + G2).

Os resultados da análise do ciclo celular por FACS similarmente indicam que a sobre-expressão de ambos os selvagem ou mutante CacyBP /SIP reduz a proliferação MKN45. No entanto, os índices de proliferação médios (PI) de células MKN45-ΔS100 (0,19 ± 0,03) foi menor do que a de células MKN45-CacyBP (0,29 ± 0,02) (

P

0,05) (Fig. 3B) . Tomados em conjunto, estes dados indicam fortemente que a do tipo selvagem CacyBP /SIP inibe a proliferação de células MKN45, enquanto CacyBP /SIPΔS100 intensifica esta inibição de proliferação.

Efeitos de S100A6 na tumorigénese induzida por CacyBP /SIP no MKN45 linha de células de câncer gástrico

in vitro

e

in vivo

crescimento Anchorage-independente é uma característica importante da

in vitro

crescimento do tumor. Portanto, nós examinamos se a regulação positiva da expressão CacyBP /SIP inibiu o crescimento celular MKN45 na mídia e agar mole. Como mostrado na Fig. 4A e B, CacyBP expressão /SIP resultou numa redução acentuada do crescimento celular MKN45 num ensaio de formação de colónias, com uma redução média de 32,1% em média e 62,0% em agar mole (

P

0,05) . No entanto, a transfecção de CacyBP /SIPΔS100 resultou numa redução ainda maior no crescimento, com uma redução média nas taxas de 84,2% nas médias e 82,8% em agar mole (

P Art 0,01).

(a) a detecção da formação clonogénico no meio. (B) Detecção de formação clonogénico em agar mole. As células foram colocadas em meio contendo agar mole ou sobre uma placa e incubaram-se durante 20 dias. O número de focos 100 um foi contado. As barras verticais representam a média ± DP a partir de pelo menos três experiências separadas, cada uma realizada em triplicado. (C)

In vivo

tumorigenicidade foi avaliada por um ensaio de ratos sem pêlo. Os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 1 x 10

7 transfectadas. O volume de cada tumor foi calculada de acordo com a fórmula de 0,5 × comprimento x largura

2. Dois experimentos independentes foram realizados e cada grupo experimental consistiu de cinco ratos.

*

P Art 0,05

vs

MKN45-pFLAG,

**

P Art .. 0,01

vs

MKN45 -pFLAG,

#

P Art .. 0,05

vs

MKN45-CacyBP

Para confirmar este efeito

in vivo

, nós injetado subcutaneamente MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 e células MKN45-PFLAG para o hypodermia pescoço de ratos nus. Depois de três semanas, o volume médio do tumor em cada grupo foi significativamente diferente da dos outros. No 5

th semanas, o volume médio do tumor no grupo MKN45-pFLAG foi 776,9 ± 90,9 milímetros

3, que é significativamente mais do que a do grupo MKN45-CacyBP (578,9 ± 51,2 milímetros

3 ) (

P Art 0,05), e ainda mais do que a do grupo MKN45-ΔS100 (364,9 ± 71,9 milímetros

3) (

P Art 0,05) (Fig. 4C).

Efeitos de S100A6 sobre CayBP /β mediada por SIP -catenina degradação

Como um componente do complexo de ligase de ubiquitina, CacyBP /SIP está envolvido na degradação de não fosforilada β -catenina através Skp1 e Siah1 vinculativo. Então expressão de -catenina β foi detectado para avaliar indiretamente a influência do S100 em Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ligase unbiquitin. Em primeiro lugar, o ensaio de co-imunoprecipitação mostraram que truncado mutante ligamento CacyBP /SIP tanto Skp1 e Siah1 (Fig. 5A), sugerindo S100A6 não afetou a formação de Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 complexo ligase unbiquitin. Em segundo lugar, a proteína β- catenina em células MKN45-ΔS100 significativamente é diminuída, em comparação com células MKN45-CacyBP, enquanto que, sem qualquer alteração ocorreu no mRNA (Fig. 5B). Além disso, porque β-catenina é necessário como um cofactor para a activação do factor de transcrição, Tcf /LEF, foram determinados os efeitos de CayBP /SIPΔS100 sobre a actividade /LEF Tcf utilizando ensaios de gene repórter de transfecção transiente. Expressão de CacyBP /SIPΔS100 resultou em menor atividade /LEF Tcf de tipo selvagem CacyBP /SIP (Fig. 5C). MG132, inibidor do proteassoma, poderia eliminar o efeito de ambos do tipo selvagem CacyBP /SIP e CacyBP /SIPΔS100 sobre a atividade /LEF Tcf. Tomados em conjunto, nós inferir que S100A6 pode afetar CayBP /SIP β mediada -catenina degradação via interagindo com CayBP /SIP.

ensaio (A) Co-imunoprecipitação mostraram que truncado CacyBP mutante /SIPΔS100 vinculam ambas Skp1 e Siah1, sugerindo S100A6 não afectou a formação de Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 complexo ligase unbiquitin. (B) Western Blot e semi-quantitativo de RT-PCR foram utilizados para análise de proteína β-catenina e ARNm em células transfectadas, respectivamente. β-catenina proteína em células MKN45-ΔS100 é significativamente reduzida, em comparação com células MKN45-CacyBP, enquanto que, sem qualquer alteração ocorreu no ARNm. (C) Os ensaios de gene repórter da luciferase foram usadas para avaliar o efeito de CacyBP /SIPΔS100 na actividade repórter Tcf /LEF. A transfecção de tipo selvagem CacyBP /SIP diminuir a actividade /LEF Tcf, comparado com o controlo de plasmídeo. E expressão de CacyBP /SIPΔS100 resultou em menor atividade Tcf /LEF que o tipo selvagem CacyBP /SIP. MG132 (inibidor do proteassoma) poderia eliminar o efeito de ambos do tipo selvagem CacyBP /SIP e CacyBP /SIPΔS100 sobre a atividade /LEF Tcf. *

P Art 0,01, em comparação com o controlo;

#

P Art 0,05, CacyBP /SIPΔS100

vs

do tipo selvagem CacyBP /SIP.. Estas experiências foram repetidas em triplicado

Discussão

proteínas da família S100 ganharam interesse devido à sua expressão diferencial em tecidos tumorais e seu envolvimento na progressão e metástase [19] câncer -. [ ,,,0],22]. proteínas S100 interagir com algumas proteínas-alvo na forma de cálcio-dependente ou independente do cálcio e regular ainda mais a função destes objectivos [5], [23]. CacyBP /SIP é uma nova proteína alvo que podem interagir com as proteínas S100, incluindo S100A6, S100A1, S100B, e S100P, mas não para S100A4, calbindina D, parvalbumina calmodulina ou [8], [16]. Trabalhos anteriores de nosso laboratório mostraram que a superexpressão de CacyBP /SIP poderia inibir a proliferação e tumorigênese do câncer gástrico e carcinoma de células renais [11], [12]. Apesar deste progresso, os efeitos das proteínas S100 sobre CacyBP /SIP continuam a ser investigado.

Para elucidar a regulação das proteínas S100 na função /SIP CacyBP, construímos o truncada mutante CacyBP /SIP, sem domínio de ligação da proteína S100 , de modo que a proteína mutante não podem interagir proteínas S100 e retém a capacidade de interagir com e Siah1 Skp1. Neste estudo, os vectores de expressão eucarióticos para a de tipo selvagem CacyBP /SIP e do seu mutante truncado foram eficazmente expressas em células MKN45. Co-imunoprecipitação demonstrou uma interação entre S100A6 e do tipo selvagem CacyBP /SIP em células MKN45. No entanto, CacyBP /SIPΔS100 mostrou pouca sinal pelo ensaio de co-imunoprecipitação, indicando uma fraca ou nenhuma interacção com S100A6. MTT, ensaio FACS, ensaio clonogênica e xenotransplante tumoral experimento em camundongos nus foram realizados para testar o efeito de selvagem e mutante CacyBP /SIP no crescimento celular e tumorigênese ambos

in vitro

e

in vitro

. Estas experiências mostraram que a superexpressão de CacyBP /SIP poderia inibir a proliferação e tumorigénese de células de câncer gástrico MKN45. Importante, as células transfectadas com CacyBP /SIPΔS100 exibiu efeitos mais intensos em relação aos transfectantes de tipo selvagem, sugerindo que as proteínas S100 pode regular negativamente a inibição da proliferação de células induzida por CacyBP /SIP em células de cancro gástrico.

O mecanismo empregue por S100A6 para modular a função /SIP CacyBP poderia estar em interações proteína e funções. CacyBP /SIP se destinar a ser envolvido na ubiquitinação e degradação de β-catenina [24] – [28]. catenina β- foi encontrado para ser sobre-expressa ou activada nas células em proliferação e, em muitos tumores [29] – [31]. Fukushima et al. [32] verificaram que as células CacyBP /SIP knockout mostram auditivos (-catenina degradação e um ponto de controlo G1 do ciclo celular defeituosa, indicando que a via de degradação β-catenina mediada por CacyBP /SIP define um ponto de controlo essencial para o desenvolvimento de timócitos e na progressão do ciclo celular. A nossa estudos anteriores também demonstraram que CacyBP /SIP inibe o crescimento e proliferação de células de cancro gástrico, em parte, através de degradação de -catenina β. Se S100 regula CacyBP /SIP mediada por ubiquitina ligase mantém desconhecida. evidências Acumulando mostrou que vários membros da família de proteínas S100 poderia regular a activação das suas proteínas-alvo [33], [34]. Um homólogo de levedura recentemente descoberto de CacyBP /SIP, Sgt1, não só interage com as proteínas S100 em cálcio regulados por forma, mas também se associa com Skp1 para formar Skp1 /cullin1 /F -.. complexo caixa de ubiquitina-ligase [35] verificou-se que S100A6 poderia inibir a fosforilação de Sgt1 por caseína-quinase II de afectar a actividade de [36] na nossa presente experiência, que também identificaram que CacyBP /SIPΔS100 reter a capacidade de se associar com Skp1 e Siah1, sugerindo molécula de S100 pode não afetar a formação de Siah1 /Skp1 /CacyBP complexo ubiquitina ligase. No entanto, a proteína β-catenina sem uma alteração do nível de ARNm em células /SIPΔS100 transfectadas CacyBP é marcadamente menor do que as células transfectantes de tipo selvagem. A atividade transcricional de Tcf /LEF, um gene alvo de β-catenina, foi diminuída em conjunto com mutante CacyBP /SIP sem ligação S100, em comparação com selvagem CacyBP /SIP. Accoding a estes resultados, podemos postular que a proteína S100 pode regular negativamente a actividade de Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ubiquitina ligase por interacção com CacyBP /SIP. Assim, bloquear a combinação de S100 e CacyBP /SIP pode promover a degradação -catenina β, resultar na inibição da proliferação de células cancerosas. Esta especulação pode ser parcialmente suportada por Lee et ai que em células com diminuição do nível de S100A6 a quantidade de -catenina β é reduzida [26]. Os resultados estão de acordo com dados relativos a uma regulação positiva de proteínas S100 e degradação deficiente de -catenina β no tumor e células de proliferação [37]. Além disso, CacyBP /SIP foi mostrado para interagir com tubulina e ERK1 /2 e desempenham papel importante na rearranjos do citoesqueleto, diferenciação celular ou degeneração [38] – [42].

Conclusões

proteína S100A6 regula negativamente CacyBP /inibição mediada pelo SIP da proliferação de células de câncer gástrico, em parte através efeito sobre a degradação β-catenina e ativação da transcrição do Tcf /LEF. No entanto, os mecanismos subjacentes à regulação da S100A6 na ubiquitinação de proteínas e outras funções via CacyBP via /dependente da SIP exigem uma investigação mais aprofundada.