Abstract

Fundo

Elucidação do repertório de proteínas secretadas e de superfície celular de células tumorais é relevante para diagnóstico molecular, imagiologia de tumores e terapias direcionadas. Temos caracterizou o proteoma da superfície da célula e as proteínas libertadas para o meio extra-celular de três linhas de células de cancro do ovário, CaOV3, OVCAR3 e ES2 e de células do tumor dos ovários enriquecido a partir de fluido ascite.

Metodologia e Descobertas

para diferenciar proteínas liberadas na mídia a partir de proteínas constituintes meios utilizados para a cultura, as células foram cultivadas na presença de [

13 C] marcado com lisina. Uma abordagem baseada em biotinilação foi utilizado para capturar as proteínas de superfície celular associados. A nossa estratégia consistiu experimental geral de fraccionamento de proteínas de compartimentos individuais, seguido por digestão proteolítica e análise por LC-MS /MS. No total, cerca de 6.400 proteínas foram identificadas com alta confiança em todas as amostras e frações.

Conclusões e significado

perfis de proteína das linhas celulares teve similaridade substancial para os perfis de células de cancro do ovário humanos de fluido ascítico e marcadores de proteína incluídos conhecidos por estarem associados com cancro do ovário. proteomic análise indicou grande derramamento a partir de domínios extra-celulares de proteínas expressas na superfície da célula, e as taxas de secreção extremamente elevadas para algumas proteínas (nanogramas por milh de culas por hora). proteínas de superfície celular e secretadas identificadas por in-depth profiling proteômica de células de cancro do ovário pode fornecer novos alvos para diagnóstico e terapia

Citation:. o Faça VM, Ventura AP, Fitzgibbon MP, Pereira-faca SR, Pitteri SJ, verde AE, et al. (2008) Proteômica A análise de células do cancro do ovário revela processos dinâmicos de secreção de proteínas e derramamento de domínios extra-celulares. PLoS ONE 3 (6): e2425. doi: 10.1371 /journal.pone.0002425

editor: Axel Imhof, Universidade de Munique e Centro de Ciência Protein Integrado, Alemanha |

Recebido: 24 Março, 2008; Aceito: 08 de maio de 2008; Publicado: 18 Junho 2008 |

Direitos de autor: © 2008 o Faça et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Fundação Canárias. A organização de financiamento não têm qualquer papel na coleta de dados ou análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é um dos cancros epiteliais mais agressivos e letais em mulheres [1]. Existem quatro principais tipos histológicos de câncer epitelial de ovário: seroso, endometrioid, de células claras, e mucinoso, que diferem, tanto no seu comportamento clínico e as características moleculares. O subtipo serosa é o mais comumente diagnosticado e é responsável por mortes por câncer de ovário mais [1]. Atualmente não há nenhum teste de diagnóstico não-invasivo acurado para câncer de ovário; a maioria dos pacientes são diagnosticados numa fase avançada [2], que apresenta com metástases e invasão da cavidade peritoneal e ascite [3]. Portanto, a identificação de proteínas que são abundantemente e predominantemente expresso no cancro do ovário apresenta um empreendimento valioso e pode fornecer pistas iniciais para a presença de câncer de ovário e /ou indicações de um subtipo molecular que poderiam ajudar a orientar o tratamento.

identificação do repertório de proteínas que são clivados a partir da superfície celular e das proteínas que são de outra forma libertadas para dentro do compartimento extracelular pode contribuir para a nossa compreensão do comportamento do tumor, para a identificação de potenciais marcadores de diagnóstico detectáveis ​​em circulação e de imagiologia potencial e alvos terapêuticos que permanecem exibidas na superfície da célula. Durante a metástase do cancro do ovário, a produção de proteases que degradam a matriz por células tumorais contribui para a disrupção das interacções de células através de um mecanismo de derramamento de moléculas de adesão. Estes mecanismos foram demonstradas em contexto de cancro do ovário para ALCAM [4] e para caderina epitelial (CDH1) [5].

Em profundidade, proteômica quantitativa permite que esta delimitação de proteínas expressas em células tumorais e na sub- compartimentos celulares [6]. Vários estudos analisaram proteomic tecido de tumor do ovário [7], [8], linhas celulares [9] – [11], fluido de ascites [12] e no sangue de pacientes com cancro do ovário [13], [14]. No entanto, ainda existe uma necessidade de caracterizar e comparar sistematicamente conjuntos de proteínas cujas localizações torná-los especialmente relevantes para diagnóstico e tratamento, nomeadamente proteínas na superfície da célula ou aqueles libertados no meio extra-celular, e para determinar o mecanismo e da dinâmica de liberação de proteínas para o espaço extracelular.

Foram caracterizados três linhas ovarianos de células adenocarcinoma, OVCAR3, CaOV3 e ES2, bem como células de cancro do ovário enriquecidos de ascite fluido com uma análise proteômica em profundidade de lisados ​​de células inteiras, o proteoma da superfície celular e as proteínas libertadas para o compartimento extra-celular. exploração detalhada dos dados revelou vários fenómenos biológicos, incluindo interessantes extensa derramamento de domínios extra-celulares para proteínas expressas na superfície da célula e altas taxas de secreção de um subconjunto de proteínas. Os dados também inclui uma série de marcadores de proteína que se sabe estar associada com cancro ovariano. O conjunto de dados pública resultante é um recurso para a descoberta de alvos diagnósticos e terapêuticos e uma rica fonte de informações sobre a distribuição de proteínas entre o interior da célula, a superfície da célula e o espaço extracelular.

Métodos

Cultura e rotulagem isotópica de células de cancro do ovário

OVCAR3, células CaOV3 e ES2 foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen) contendo 0,1% de soro bovino fetal dialisado (FBS) (Invitrogen) e

13C-lisina lisina em vez de regular, durante 7 passagens (1:2) de acordo com o protocolo padrão SILAC [15]. Incorporação de

13C Lys isótopo excedeu 90% do teor de lisina total de proteínas. O mesmo lote de células foi utilizado para a extracção de proteínas de superfície celular e para a análise de meios condicionados e proteínas lisado celular total. As proteínas secretadas foram obtidos diretamente a partir do media de células condicionado após 48 h de cultura. As células e os detritos foram removidos por centrifugação a 5000 x g e filtração através de um filtro de 0,22 um. Os extractos totais de células foram obtidas por sonicação de ~ 2 × 10

7 células em 1 ml de PBS contendo o detergente octil- glucósido (OG) (1% w /v) e inibidores de protease (Completo de cocktail inibidor de protease, Roche Diagnostics , Alemanha), seguido por centrifugação a 20.000 x g.

As células de tumor foram obtidas a partir de 2,2 L de fluido de ascites a partir de um paciente com adenocarcinoma seroso do ovário. amostras de ascite foram recolhidos ao abrigo de um protocolo IRB aprovado. Após centrifugação a 2000 rpm durante 5 min, o sedimento de células foi lavado 3 vezes com PBS seguido de centrifugação a 2000 rpm durante 10 min. Um gradiente de Percoll (30 a 60%) foi utilizada para enriquecer a preparação em células derivadas de tumores e eliminar as células mononucleares do sangue contaminantes. As células tumorais composta ~ 80% de células viáveis ​​na amostra resultante, tal como avaliado por inspecção microscópica. O meio celular condicionado de ascite foi obtido após 24 horas de cultura em 0,1% de albumina de soro bovino (BSA), sem adição de soro fetal de bovino (FBS). As células e os detritos foram removidos por centrifugação a 5000 x g e filtração através de um filtro de 0,22 um.

Captura de proteínas da superfície celular

Para isolar as proteínas da superfície das células a partir das três linhas de células de cancro do ovário aderentes, ~ 2 × 10

8 células foram biotinilados na placa de cultura após extensa lavagem PBS, com 10 ml de 0,25 mg /ml de sulfo-NHS-SS-biotina em PBS à temperatura ambiente (23-24 ° C) durante 10 min. O reagente de biotinilação residual foi neutralizada com 10 mM de lisina. células tumorais de ascite enriquecidas foram lavadas três vezes em PBS e biotinilado em suspensão (2,5 × 10

8cells /ml) com 0.48mg /ml de sulfo-NHS-SS-biotina em PBS durante 30 min à temperatura ambiente (23- 24 ° C). O reagente de biotinilação residual foi neutralizada com 10 mM de lisina em ambas as linhas de células e preparação de ascites. Extracção de proteínas foi realizada numa solução contendo detergente NP 40 2% (v /v) com o rompimento de células por sonicação seguido por centrifugação a 20.000 x g. proteínas biotiniladas foram cromatograficamente isolado por cromatografia de afinidade utilizando 1 mL de UltraLink Imobilizado neutravidina (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas ligadas à coluna foram recuperados por redução do reagente de biotinilação com 5 ml de uma solução contendo 65 umol de DTT e 1% de octil-glucósido (OG) detergente durante 1 h a 37 ° C. proteínas eluídas foram subsequentemente alquilado com 200 pmol de iodoacetamida à temperatura ambiente.

O fraccionamento de extractos de células

superfície celular, meios condicionados e extractos totais foram fraccionados por cromatografia de fase reversa, utilizando, respectivamente, 500 ug , 1 mg e 1 mg de proteína total. Todos os extractos de células foram reduzidas e alquiladas com iodoacetamida antes da cromatografia. A separação foi realizada numa Poros R1 /coluna 10 (Applied Biosystems-4,6 × 50 mm) em 2,7 mL /min utilizando um gradiente linear de 10 a 80% de solvente orgânico, durante 30 minutos de execução. sistema de solvente usado foi: solvente aquoso-5% acentonitrile /95% de água /0,1% de ácido trif luoroacético; solvente orgânico-75% de acetonitrilo /15% de isopropanol /água a 10% /0,095% de ácido trifluoroacético. As fracções foram recolhidas a uma velocidade de fracções de 3 /minuto.

Identificação de proteínas por LC-MS /MS

a digestão de proteínas e identificação por LC-MS /MS foi realizada como descrito anteriormente [16] . digestão Resumidamente, cada uma das fracções de fase reversa foi digerido individualmente em solução, com tripsina (400 ng /fracção), e agrupados em 15 a 21 de piscinas para cada linha de células e cada compartimento (ou seja, na superfície celular, os meios condicionados e inteiros solúvel lisado celular) com base nas características cromatográficas. Piscinas foram analisados ​​individualmente por LC-MS /MS em um espectrômetro de massa LTQ-Orbitrap (Thermo-Finnigan) acoplado a um sistema de cromatografia nanofluxo (Eksigent) utilizando uma coluna de 25 cm (Picofrit 75 mm ID, novos objectivos, embalado em casa com resina MagicC18) ao longo de um gradiente linear 90 minutos. dados adquiridos foi processado automaticamente pelo Computacional Proteomics Análise de Sistemas-CPAS [17]. Os espectros de massa em tandem foram pesquisados ​​na versão 3.13 do banco de dados IPI humano. Uma modificação fixa de 6.020129 unidades de massa foi adicionado em resíduos de lisina para banco de dados procurando dar conta de incorporação do isótopo lisina pesado. Para avaliar o significado partidas de peptídeos e proteínas, foi aplicado o ferramentas PeptideProphet [18] e ProteinProphet [19]. Identificações com uma probabilidade PeptideProphet maior que 0,75 foram selecionados e submetidos a ProteinProphet. Este último infere um conjunto mínimo de proteínas que explicam a evidência péptido, atribuindo uma probabilidade para cada uma das proteínas com base nas probabilidades de péptidos combinados. As identificações de proteínas derivados foram filtrados a uma taxa de erro de 1% com base na probabilidade de que a melhor correspondência obtido cairia na distribuição de jogos aleatórios de banco de dados [20]. O método de contagem espectral [21] foi utilizado para estimar o enriquecimento de proteína para cada compartimento. O número total de contagens espectrais para cada grupo de saída por proteína ProteinProphet foi utilizado para a análise semi-quantitativa. Cada conjunto de dados foi normalizado ao número total de contagens em todo o experimento. O fator de enriquecimento foi calculada pela seguinte expressão: [(C

xp /NF) +1] /(C

te p + 1), onde C

x representa as contagens de cada proteína (p) em o sub-proteoma (secreção ou da superfície celular); Nf é o factor de normalização (apresentada no topo da Tabela S1); C

te é a contagem para a mesma proteína (P) observada no extracto total da célula respectiva. A adição de 1 à contagem foi destina-se a ter em conta as proteínas para as quais não observação foi feita em um dos sub-proteomas e representa o factor de enriquecimento mínimo para que a proteína particular.

Resultados

Análise proteômica de células do cancro do ovário

foi realizado um perfil abrangente proteômica das linhas celulares OVCAR3, CaOV3 e ES2, e as células de cancro do ovário de ascite de um paciente com câncer de ovário seroso. O fluxo de trabalho experimental consistiu geral de fraccionamento de proteína intacta, seguido pela aquisição de dados de espectrometria de massa por LC-MS /MS e análise de dados, tal como descrito na Figura 1. Em geral, foram realizados 215 LC-MS /MS é executado, o que corresponde a mais de dois milhões varreduras MS.

lisados ​​celulares totais.

Um cromatograma de fase reversa, que representa o fraccionamento de proteínas intactas em todo o lisado celular de células ES2 é apresentado na Figura 2. em geral, o análise produziu cerca de 3.000 identificações de proteína de alta confiança para cada população de células analisadas (Figura 3). O número de identificações de proteína a partir de extractos celulares totais em comum entre as três linhas celulares foi 1179, e variou 2011-2267 para duas linhas de células (Figura 3A). Em média, 655 proteínas foram identificadas exclusivamente em uma linha de células. Além heterogeneidade biológica, parte da variabilidade em proteínas identificadas entre linhas celulares poderiam ser atribuídas a espectrometria de massa de subamostragem proteínas de baixa abundância.

O cromatograma mostra o perfil de fraccionamento de 1 mg de lisado de células inteiras. Nós recolhidas 18 fracções desta amostra, para posterior identificação de proteínas por LC-MS /MS. O descomplexa�o de amostras A análise por LC-MS /MS através de fraccionamento antes de proteína intacta melhora significativamente a identificação de proteínas de abundância baixas [16]. As caixas sob o perfil cromatográfica indicou as frações analisadas. A linha escura sólida indica o gradiente usado na separação.

diagramas de Venn mostrar sobreposição entre proteínas identificadas em diferentes populações de células analisadas. A. Identificações a partir de lisados ​​de células inteiras das três linhas celulares analisadas. B. As proteínas identificadas nas três sub-proteomas (lisado de células inteiras, meios condicionados e da superfície da célula). C. Proteínas identificados em células tumorais enriquecido a partir de ascites que exibem 80% de concordância com as proteínas identificadas nas três linhas de células de cancro do ovário. D. Número de proteínas identificadas em cada conjunto de dados. Tabela S1 lista as proteínas identificadas neste estudo.

proteínas de superfície celular.

Contamos com uma estratégia de marcação com biotina lipídica impermeável a marcar e proteínas de captura exposta na superfície da célula de linhas celulares OVACAR3, CaOV3, ES2 e células do tumor ascitico derivado (Figura 1). A partir de cerca de 2 × 10

8 células, obteve-se cerca de 500 ug de proteínas biotiniladas, representando ~1-2% da massa total de proteína celular. A lista de identificações de proteínas é apresentada na Tabela S1.

proteínas libertadas para o meio de

.

A célula linhas foram crescidas em meio de cultura contendo isótopos pesados ​​de lisina. rotulagem isotópica de proteínas foi destinado para discriminar entre proteínas libertadas a partir de células de cultura e as proteínas intrínsecas para meio suplementado. Após 48 h de cultura, a concentração de proteínas aumentou de 100 ug /ml a 225 ug /ml no meio condicionado de células OVCAR3. Porque -15% de péptidos trípticos humanos previstos com mais de 6 aminoácidos são idênticos entre as proteínas humanas e os seus homólogos bovinos, a marcação isotópica de proteínas celulares previstos meios para diferenciar as proteínas humanas segregadas por células cultivadas a partir de proteínas de bovino presentes no meio. Para derivados de ascites de células, o meio foi recolhido após 24 h de cultura na presença de albumina de soro bovino a 0,1% (BSA). Aproximadamente 1 mg de proteínas a partir de meio condicionado a partir de linhas de células cancerosas e células de ascite foram fraccionadas utilizando o mesmo método de cromatografia de fase reversa, tal como utilizado para os lisados ​​de células inteiras, e as fracções individuais foram analisados ​​por LC-MS /MS. Para linhas de células cultivadas, as proteínas que foram identificadas exclusivamente a partir de péptidos sem resíduos de lisina rotulados e que eram idênticos em sequência entre o ser humano e bovino, foram atribuídas ao meio de cultura e não foram incluídos na lista de proteínas libertadas a partir de células.

o perfil proteoma em células de cancro do ovário, conduzir à identificação de proteínas 6.462 (Figura 3D). Nós usamos critérios rigorosos para a identificação de proteínas, considerando apenas válidas essas proteínas com limite de probabilidade ProteinProphet mínima de 0,9. Para este limiar, a taxa de identificação falsa estimativa seja inferior a 1%. Este conjunto de dados representa o estudo de proteômica mais detalhada e completa de populações de células de cancro do ovário. A profundidade da análise e a cobertura conseguida ao nível da proteína neste estudo é equivalente à profundidade da análise para descobrir genes expressos ao nível de ARN.

Proteína distribuição entre a intracelular, da superfície das células e compartimentos extracelulares

Uma análise comparativa de proteínas em diferentes compartimentos permite a avaliação do grau de enriquecimento de proteínas na superfície da célula e do compartimento extracelular. Contamos com o método de contagem espectral [21] para estimar o enriquecimento de proteína para cada compartimento. Após a normalização para o número total de contagens espectrais, proteínas com um maior número de contagens num compartimento (superfície celular ou meio condicionado) em comparação com os lisados ​​de células totais foram considerados enriquecido em que o compartimento (Figura 3). Os fatores de enriquecimento correspondentes observados para todas as proteínas identificadas são apresentados na Tabela S1.

Proteínas atribuídos aos três compartimentos celulares foram analisados ​​com o Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com), e com algoritmos para a previsão dos domínios de hélice alfa transmembranar (TMHMM) [22] e a presença de péptidos de sinal (SignalP) [23] (Figura 4A). Esta análise mostrou concordância substancial entre a localização comprovado com base no nosso perfil proteômica e as previsões de análise de banco de dados. Esta concordância foi particularmente evidente para os 10% mais proteínas enriquecidas quando contrastado com os 10% de proteínas menos enriquecido (Figura 4B e 4C), apoiando a estratégia utilizada para analisar compartimentos específicos. O número significativo de proteínas anotados como nuclear ou citoplasmática e presente entre as identificações de ambos os meios de comunicação e da superfície celular sub-proteomas condicionado é notável. Em certa medida, a ocorrência destas proteínas predominantemente intracelulares pode ser devida a lise celular uma vez que cerca de 1% de células em cultura foram estimadas para serem mortos com base na coloração com azul de tripano. No entanto, há evidências de prévia para a ocorrência de proteínas citoplasmáticas ligados à membrana extracelular, particularmente no cancro [24], [25].

. A classificação localização celular usou uma combinação de anotações de software Ingenuity Pathway Analysis e predição computacional de transmembrana alfa-hélice (TMHMM) e peptídeos sinal (SignalP). B. e C. Comparação das principais 10% de proteínas enriquecidas em meios condicionados ou da superfície celular (B e C, respectivamente) com o mínimo enriquecido a 10% demonstrando forte concordância entre localização celular previsto e o sub-proteoma específico analisado.

as proteínas secretadas pelas células espera-se difundem através dos tecidos e entram na circulação. Portanto, em contraste com as proteínas intracelulares, as proteínas secretadas podem ser mais provável detectável no plasma. Foram comparados os perfis de proteínas de células de ovário de compartimento com proteínas listadas na Human Plasma Peptide Atlas [26]. Do total de 6.462 proteínas identificadas no presente estudo, 2.341 (36%) ocorreu no plasma Péptido Atlas humano (Tabela S1). Os 100 primeiros proteínas que foram enriquecidas em meios condicionados de cada uma das populações de células foram analisados ​​mais altamente representado no Atlas Péptido (65 a 78%) em comparação com a representação global de 36%. Estes resultados sugerem que as proteínas secretadas são mais abundante no plasma que as proteínas não segregadas.

Semelhanças entre linhas de células e as células do tumor ascitico

As três linhas de células neste estudo representam bem caracterizada

modelos in vitro

para câncer de ovário. OVCAR3 e CaOV3 são derivadas de adenocarcinoma seroso humano do ovário [27], [28] e ES2 é derivada de carcinoma de células claras [29]. As diferenças na histologia são paralelo por diferenças nos perfis de proteínas, como refletido na análise de agrupamento utilizando as contagens espectrais como medidas de abundância de proteínas (Figura S1). Isto é evidente a partir de observações de que os sub-proteomas secretadas e de superfície de ES2 são significativamente diferentes dos das duas outras linhas celulares analisadas.

As células tumorais enriquecidas a partir de ascites analisadas foram derivadas de um paciente com ovário seroso adenocarcinoma. Oitenta por cento das proteínas identificadas nas células tumorais de ascite, também foram identificados em um ou mais das linhas de células (Figura 3C). Tal como indicado na Figura S1, padrões de células de tumor do paciente a partir de ascites isoladas têm uma maior semelhança com CaOV3 e OVCAR3 do que com ES2.

Outra maneira de explicar semelhanças pode confiar na observação de proteínas já conhecidas como estando associadas com a doença. Vários calicreínas tenham sido previamente associadas com adenocarcinoma de ovário seroso [30]. KLK6, KLK7 KLK e 9 eram abundantes no meio condicionado a partir de ascites de tumor, derivadas de células OVCAR3 e CaOV3, mas não em meio condicionado de células ES2 (Tabela S2). Estas observações sugerem novamente maiores semelhanças entre as linhas de células OVCAR3 adeonocarcinoma serosa e CaOV3 e as células derivadas de tumor, bem como as diferenças em relação ao derivado de células limpar linha celular de ES2.

Foram observadas algumas diferenças entre células derivadas de ascites e linhas de celular. Algumas proteínas foram detectadas exclusivamente e enriquecido na superfície ou em meios de cultura de ascite derivados células tumorais. Estes incluem proteínas tais como ABP1 (sensível à amilorida oxidase de amina) e MMP7 (e mettaloprotease matriz 7), os transcritos para o que são especialmente abundantes em vários sub-tipos de cancro do ovário, e os outros codificadas por mRNAs com os níveis de expressão elevados em histológico específico tipos de câncer de ovário (Tabela S3). É digno de nota o facto de que várias das proteínas enriquecidas exclusivamente em células tumorais de ascite têm uma expressão muito baixa em tecido de ovário normal [31] (Tabela S3). Estas proteínas são possivelmente derivado de leucócitos e células mesoteliais que teria sido co-purificadas de fluido ascite.

derramamento de proteínas de membrana de superfície para o compartimento extra-celular

Em apoio da nossa experimental e abordagem analítica, verificou-se que uma proporção substancial de proteínas anotada como proteínas da membrana foram identificados em meio de cultura, o que representa mais de 25% de todas as proteínas identificadas como, por exemplo, em OVCAR3 e células do tumor ascitico derivado (Figura 4A). Várias destas proteínas foram enriquecidas significativamente tanto na superfície da célula e no meio de cultura (Tabela S4). Análise dos péptidos identificados indicaram que para a maior parte, estes péptidos foram derivados a partir de domínios extracelulares de proteínas de superfície celular, como mostrado na Figura 5A, sugerindo ectodomínio derramamento.

. Identificação de péptidos abrangendo domínios extracelulares de proteínas transmembranares detectados no meio condicionado, de acordo com um processo de derramamento. CDH1 (caderina epitelial) ilustra bem este processo, uma vez que os péptidos abrangendo apenas o domínio extracelular são observados em meios condicionados enquanto péptidos abrangendo regiões tanto intracelulares e extracelulares foram detectados na superfície das células OVCAR3 e ascite. traços vermelhos indicam domínios extracelulares e traços azuis indicam domínios intracelulares. regiões transmembranares são indicados nos quadros amarelo. caixas pretas indicam peptídeos identificados. blotting B. ocidental de CDH1 usando um anticorpo específico contra o domínio intracelular (clone de rato anti-E-caderina 36, ​​# 610181, BD Biosciences) demonstrando a clivagem da CDH1 comprimento total. Não houve péptidos derivados a partir do domínio intracelular no meio condicionado.

caderina epitelial (CDH1) ilustra claramente o processo de desprendimento, uma vez que a cobertura sequência do domínio extracelular é predominante na fracção segregados, ao passo que a cobertura de péptidos abrangendo domínios celulares tanto intra e extra foi observado para a proteína isolada a partir da fracção da superfície celular. Foram comparados os resultados com base espectrometria de massa com análise de western blot da linha de células de ovário e células tumorais derivadas de ascite. formas intactas de CDH1 foram observadas nos lisados ​​de células inteiras, em conjunto com fragmentos moleculares inferiores contendo o domínio intracelular. No entanto, em células de ascite há uma predominância de fragmentos de baixo peso molecular contendo apenas o domínio intracelular tanto no extracto celular total de células e a superfície, o que indica que o processo de desprendimento é mais extensa em células tumorais do que em linhas celulares. Formas de CDH1 contendo o domínio intracelular não foram detectados no meio condicionado destas células (Figura 5B). O processo de derramamento de CDH1 foi recentemente descrito para as células do cancro do ovário [5], em apoio às nossas investigações baseadas espectrometria de massa. Digno de nota é a observação em nosso estudo de proteínas adicionais da família caderina de moléculas de adesão em meios condicionados, como caderina neural (CDH2), calsyntenin-1 (CLSTN1), alcadein beta (CLSTN3), desmogleínas-1 (Dsg1) e desmogleína-2 (DSG2). Com base em Engenho Pathway Analysis anotação, a maior parte destas proteínas da membrana identificados enriquecidas nos meios condicionados são relacionadas com os processos de adesão celular e o movimento celular (Tabela S4). O processo de clivagem e derramamento não é uniforme para todas as proteínas que temos observado um número significativo de proteínas enriquecidos na fracção da superfície celular que não são detectados no meio de cultura de células (Tabela S4).

taxas de secreção de proteínas

Analisando proteínas liberadas para o meio de cultura de células é uma estratégia atraente para identificar potenciais marcadores circulantes. O potencial para a detecção de níveis elevados de uma proteína em circulação é dependente, em parte, a taxa à qual a proteína é libertada para o espaço extracelular e, finalmente, o compartimento do sangue pelo tumor, relativamente a outros tecidos. Na lista de proteínas enriquecidas em mais de meios de cultura em relação ao lisados ​​de células inteiras eram dois inibidores de metaloprotease de tecido (TIMP 1 e TIMP2) (Tabela S2). Estas proteínas têm diagnósticos diretos potenciais no cancro do ovário [32].

Foi avaliado o fator de enriquecimento para TIMP1 por análise de Western blot (Figura 6a). TIMP1 ocorreu predominantemente no compartimento segregada de todas as linhas de células, de acordo com previsões baseadas na contagem espectral. Também foi realizada uma medição do tempo-curso de TIMP1 e concentração TIMP2 no meio condicionado para estimar a taxa de secreção destas proteínas para todas as três linhas celulares (Figura 6B). TIMP1 mostrou ter uma taxa de secreção baixa em células OVCAR3 em relação a outras linhas celulares, o que é consistente com a análise de Western blot. Foram calculadas as taxas de secreção de TIMP1 e TIMP2 para ser da ordem dos nanogramas de proteína por milhão de células, por hora. Com base numa taxa de secreção de 3 ng de TIMP1 por milh de culas por hora e, sem ter em conta a taxa de degradação e depuração no soro, que seria necessário cerca de 10

8-10

9 células tumorais e vários dias de saída para alterar os níveis de TIMP1 que ocorrem no soro humano normal, que é 87-524 ng /ml.

. O Western blot mostra a presença de TIMP1 apenas nos meios condicionados de células de todos os 4 de cancro do ovário. OVCAR3 expressa significativamente menos TIMP1, em comparação com as outras células. Mesma massa de proteína (5 ug) foi carregada em cada faixa do gel para esta análise. std corresponde a TIMP1 recombinante utilizada como um controlo normalizado; TE corresponde ao lisado de células inteiras; SE ao meio condicionado; e SU para proteínas de superfície celular. B. a medição da taxa de secreção de kits ELISA comerciais Timp1 e TIMP2 usado (R D systems). Os meios condicionados foram diluídos 1:15 e 1:60 para a análise de TIMP1 e TIMP2, respectivamente. A taxa de secreção foi estimado com base na inclinação da curva em pontos de tempo linear.

Discussão

Nós apresentamos aqui uma análise proteômica em profundidade de linhas celulares de cancro do ovário e cancro do ovário células tumorais, incluindo análises separadas de superfície de células e proteínas secretadas. O estudo foi baseado em proteína intacta fraccionamento seguido pela tripsina e LC-MS /MS [16], [33], o que permite a detecção sensível de proteínas de baixa abundância. Ao todo, que gerou um grande perfil de proteínas consistem em mais de 6.500 identificações únicas, com uma taxa de erro inferior a 1%. Um estudo recente de fluido ascite que consiste em proteínas derivadas a partir de populações mistas de células [12] identificado 2,737 proteínas. 2307 (84%) das proteínas relatados neste estudo foram englobadas entre proteínas identificadas no nosso estudo.

O uso de contagens espectrais como uma medida da abundância juntamente com comparações de proteínas encontradas na superfície de células ou compartimentos extracelulares e em perfis de lisado celular total, permitiu a identificação de proteínas enriquecidas em compartimentos particulares. contagem peptídeo fornece estimativas de abundância que se correlacionam razoavelmente bem com os valores determinados por outros métodos [34]. Em nosso estudo observamos também uma boa correlação entre as estimativas de abundância de inibidor tecidual de metaloproteinase 1 (TIMP1) e caderina epitelial (CDH1) com base na contagem espectral e avaliação com base em análise de Western blot. marcação isotópica com SILAC [15] também proporcionou um meio eficiente para distinguir proteínas em meios condicionados que são liberados a partir de células cultivadas a partir de proteínas contribuíram pelo soro bovino no meio de cultura.

Nossas análises forneceram uma visão sobre a contribuição de proteína de superfície de derramamento e libertar a composição proteica do compartimento extracelular. Proteínas altamente enriquecido em meios de cultura representam uma fonte potencial de marcadores circulantes de cancro do ovário. Os transcritos correspondentes a algumas destas proteínas (por exemplo, KLK6, 7 e 9) são relativamente abundante em tumores ovarianos em comparação com a maioria dos tecidos normais [35]. Já existe evidência para a ocorrência da maior parte destas proteínas em plasma humano normal. Dos 60 proteínas listadas na Tabela S2, 48 (80%) estavam presentes no plasma humano Péptido Atlas [26].