Abstract

A quimioterapia e /ou radioterapia são amplamente utilizados como tratamentos de câncer, mas os efeitos anti-tumorais que produzem pode ser reforçada quando combinada com imunoterapias. A quimioterapia mata as células tumorais, mas também liberta o antigénio do tumor e permite a apresentação cruzada do antigénio tumoral para desencadear respostas imunitárias mediadas por células específicas de antigénio. Promoção de respostas imunes de células T helper CD4 + pode ser usada para melhorar a apresentação cruzada do antigénio do tumor após a quimioterapia. A panela de HLA-DR ligação ao epitopo (péptido PADRE) é capaz de gerar células específicas para o antigénio T CD4 + que se ligam a várias moléculas de classe II do MHC com elevada afinidade e tem sido amplamente utilizados em conjunção com vacinas para melhorar a sua potência por aumentar as respostas de células T CD4 + . Aqui, nós investigamos se a injecção intratumoral de PADRE e o adjuvante de CpG em E7 de HPV16-expressam TC-1 tumores seguintes quimioterapia com cisplatina pode levar a efeitos antitumorais potentes e respostas imunes mediadas por células específicas de antigénio. Observou-se que o tratamento com todos os três agentes produziram os efeitos antitumorais mais potentes em comparação com combinações emparelhadas. Além disso, o tratamento com cisplatina, e PADRE CpG foi capaz de controlar tumores num local distante, o que indica que a nossa abordagem é capaz de induzir a apresentação cruzada do antigénio tumoral. O tratamento com cisplatina, e CpG PADRE também aumentou a geração de células T CD4 + específicas de PADRE e células T CD8 + específicas de E7 e diminuiu o número de loci MDSCs no tumor. O regime de tratamento aqui apresentado representa uma abordagem universal para o controle do câncer

Citation:. Canção L, Yang MC, Knoff J, Wu TC, Hung CF (2014) Cancer Imunoterapia Empregando uma estratégia inovadora para melhorar CD4 + T celular Ajuda no microambiente tumoral. PLoS ONE 9 (12): e115711. doi: 10.1371 /journal.pone.0115711

editor: Thorbald van Hall, Leiden University Medical Center, Holanda

Recebido: 19 Março, 2014; Aceito: 27 de novembro de 2014; Publicação: 22 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Song et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional do Câncer Cervical Cancer SPORE P50CA098252 e 2R01CA114425-06 subvenções. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a quimioterapia e /ou terapia de radiação são amplamente utilizados como tratamentos de cancro. Tanto a quimioterapia e terapia com radiação ter sido mostrado para transformar o microambiente do tumor para um ambiente apropriado para a vacinação imunoterapêutico subsequente [1], [2]. Nós temos utilizado anteriormente quimioterapia com cisplatina para preparar o microambiente do tumor para a vacinação com uma proteína recombinante, e descobriu que este regime de tratamento induziu efeitos antitumorais potentes e respostas imunes mediadas por células específicas de antigénio [1]. Não só as células tumorais cisplatina matar, mas também liberta o antigénio do tumor e permite a apresentação cruzada do antigénio tumoral para desencadear respostas imunitárias mediadas por células específicas de antigénio. No entanto, os efeitos antitumorais produzidos pela quimioterapia pode ser melhorado quando combinado com imunoterapias.

Uma estratégia para aumentar a apresentação cruzada do antigénio tumoral após quimioterapia é para promover T CD4 + respostas imunes celulares ajudante. Um agente capaz de gerar células específicas para o antigénio T CD4 + que se ligam a várias moléculas de classe II do MHC com elevada afinidade, é a panela de ligação ao epitopo (péptido PADRE) HLA-DR [3]. O péptido PADRE tem sido amplamente utilizado em conjunto com vacinas para melhorar a sua potência por aumentar as respostas de células T CD4 [4] – [7]. Assim, a administração intratumoral de PADRE potencialmente pode criar células auxiliares T CD4 + específicas PADRE para melhorar ainda mais a apresentação cruzada para gerar células T CD8 + específicas de antigénio de tumor. O emprego de um adjuvante imunoestimulador com péptido PADRE pode aumentar ainda mais as células T CD8 + específicas de antigénio de tumor.

O receptor? Toll-like? 9 (TLR9) agonista CpG é um adjuvante vulgarmente utilizado que tenha sido mostrado para estimular células T CD8 + celular cross-priming através da promoção de interferon tipo I de produção [8], [9]. CpG também tem mostrado ter efeitos anti-tumor quando injectado directamente no tumor [10] – [12]. Além disso, o CPG foi mostrado para bloquear a actividade imunossupressora de MDSCs em ratinhos portadores de tumores [13]. Estes estudos sugerem que a função imunoestimuladora de CpG pode ser utilizado para melhorar a apresentação cruzada do antigénio tumoral de tumores para gerar respostas imunes mediadas por células T CD8 + específicas de antigénio.

No estudo actual, a hipótese de que a cisplatina seguido por tratamento adjuvante CpG e administração péptido PADRE iria melhorar a apresentação cruzada do antigénio tumoral, levando a efeitos antitumorais potentes. Para testar isso, usamos ratos portadores de HPV16 E7 expressam TC-1 tumores e tratou-os com várias combinações de cisplatina seguido por injecção intratumoral com CPG e péptido PADRE. Nós descobrimos que o tratamento com todos os três agentes produziu os efeitos antitumorais mais potentes. Além disso, o tratamento com cisplatina, e PADRE CpG foi capaz de controlar tumores num local distante, o que indica que a nossa abordagem foi capaz de induzir a apresentação cruzada do antigénio tumoral. Nós descobrimos que o tratamento com cisplatina, e PADRE CpG melhorou a geração de células T CD4 + específicas de PADRE, bem como células T CD8 + específicos para E7. O tratamento com cisplatina, e CpG PADRE também diminuiu o número de loci MDSCs no tumor, um processo verificou-se ser mediada pela via de apoptose Fas-FasL. O regime de tratamento aqui apresentado é uma nova aplicação de uma combinação de imunoterapias que induz respostas imunes anti-tumor potente sem a necessidade de conhecimento dos antigénios imunodominantes tumorais, tornando a abordagem potencialmente amplamente aplicáveis.

Materiais e Métodos

ética Declaração

Todos os procedimentos com animais utilizados neste estudo foram realizados de acordo com protocolos aprovados para este estudo específico e de acordo com as recomendações para o uso adequado e cuidados de animais de laboratório pela Johns Hopkins University animal Care e do Comitê Use. Todas as linhas celulares foram estabelecidos e mantidos com os protocolos aprovados. Os ratos foram sacrificados para a finalidade do presente estudo utilizando CO

2, de acordo com o protocolo animal. Em relação às normas de endpoint humanos, ratos que mostram sofrimento intensos, com tumores que excederam 20 mm de diâmetro foram submetidos à eutanásia com CO

2 em conformidade com o protocolo animal.

animais experimentais

seis a oito C57BL -week fêmea de idade /6 machos foram obtidos a partir Cancer Institute-Frederick animal Área Produção Nacional (Frederick, MD). Os ratinhos foram alojados na instalação oncologia animais do Johns Hopkins Hospital (Baltimore, MD).

Células

O modelo de tumor TC-1 foi produzido no nosso laboratório por transformação de células epiteliais do pulmão primário a partir de ratinhos C57BL /6 com Ras activo, em conjunto com os oncogenes E6 e E7 de HPV16 e a produção e manutenção sob protocolos aprovados desta linha de células foi descrito anteriormente [14]. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 10% de piruvato de sódio, aminoácido não essencial 10%, e 100 pg /ml de estreptomicina, em atmosfera humidificada de 5% de CO

2 /95% de ar a 37 ° C. As células T CD8 + específicas-E7 foram gerados a partir de esplenócitos de ratinhos vacinados e E7 foram estimuladas com células TC-1 irradiadas e 10 UI de interleucina-2 (IL-2) a cada semana. As células T CD4 + específicas PADRE-foram gerados a partir de ratinhos C57BL /6 imunizados com pcDNA3-II-PADRE por pistola de genes. As células foram estimuladas com DC pulsadas com péptido PADRE irradiados e IL-2 (10 UI) semanal [15].

Peptide, anticorpos e reagentes

O péptido PADRE (epitopo reactivo Pan-HLA-DR , AKFVAAWTLKAAA), e H2-D

b-restringido de HPV16 E7aa49-57 péptido (RAHYNIVTF) foram sintetizados pela Beckman Coulter com uma pureza de 90%.

FITC, PE e APC-conjugado anti-ratinho CD8a (clone 53.6.7), conjugado com FITC anti -mouse IFN-γ (XMG1.2 clone), PE- e FITC conjugado com anti-rato CD4 (clone RM4-5), a APC-conjugado anti-ratinho de CD11b (clone M1 /70), PE-anti-ratinho conjugada Ly6G (clone 1A8), conjugado com PE anti-ratinho de CD154 (CD40L, clone MR1), funcional anti-ratinho CD95 (Fas, clone JO2) anticorpos agonistas, e FITC anexina V de detecção da apoptose kit, foram adquiridos da BD Pharmingen (San Diego, CA). CD178 conjugado com PE (Fas-L, clonar MFL3), conjugado com PE anti-ratinho CD95 (Fas, clone 15A7), conjugado com FITC anti-ratinho CD40 (cloneHM40-3), funcional anti-ratinho CD40 agonista (1C10 clone) , e anticorpos anti-ratinho de CD154 (CD40L, clone MR1) foram adquiridos a eBioscience (San Diego, CA). PE-conjugado, péptido HPV16 E7aa49-57 e RAHYNIVTF carregado H2-D

b tetrâmeros foram obtidos do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas Facility tetrâmero (Atlanta, GA). Fas /Fas L antagonista Kp7-6 foi adquirido da Merck Química (San Diego, CA).

In vivo

experiências de tratamento de tumor e exaustão anticorpo

As experiências de tratamento de tumor foram realizadas duas vezes de forma independente. No dia 0, 1 × 10

5 TC-1 células tumorais foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos C57BL /6 (5 por grupo). Quatro dias mais tarde, os ratinhos portadores de tumores foram tratados com cisplatina (5 mg /kg de peso corporal) ou controlo de PBS por via intraperitoneal. No dia cinco, os ratinhos foram imunizados quer intratumoral com controlo de PBS, péptido PADRE 20 ug, 10 ug de CpG, ou a combinação dos dois últimos. Todos os tratamentos foram repetidos mais 3 vezes com intervalos de 7 dias. O crescimento do tumor foi monitorizado por inspecção visual, palpação e, calibrador digital (Scienceware) duas vezes por semana. Os ratinhos foram sacrificados quando o diâmetro do tumor atingiu 20 mm.

Para a avaliação sistémica antitumoral, ratos (5 por grupo) foram provocados subcutaneamente com 1 x 10

5 TC-1 células de tumor no flanco direito . Cinco dias mais tarde, 3 × 10

4 TC-1 células tumorais foram inoculadas subcutaneamente no flanco esquerdo. ratinhos portadores de tumor foram tratados quer com controlo de PBS ou foram submetidos a terapia tripla (cisplatina 5 mg /kg IP combinados com péptido PADRE 20 ug e 10 ug de CpG por injecção intratumoral) três vezes a intervalos de 5 dias. No grupo de depleção de células T CD8 +, 100 ug de anticorpo anti-rato CD8 (clone 2.43) foi dada aos ratinhos por meio de injecção intraperitoneal nos dias 3, 4, 5 após a inoculação do tumor. Subsequentemente, 150 de anticorpo anti-rato CD8 ug /ratinho foi entregue por semana para manter mais do que 90% a depleção de células T CD8 +.

Preparação de suspensões de célula única de TC-1 tumor subcutâneo

os tecidos tumorais foram cuidadosamente dissecados a partir de ratinhos. Os tumores sólidos foram, em seguida, cortados em fragmentos de 1 em pedaços de 2 mm e incubadas com isento de soro RPMI 1640 contendo 0,05 mg /colagenase ml de I, 0,05 mg /ml de colagenase IV, 0,025 mg /ml IV hialuronidase, 0,25 mg /ml de DNase I (ambos a partir de Roche, Indianapolis, IN), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina, e incubadas a 37 ° C durante 60 minutos, como previamente descrito [16].

coloração da superfície celular, citocinas intracelulares coloração e citometria de fluxo

Para a coloração tetrâmero, de uma única célula suspensa esplenócitos ou linfócitos infiltram no tumor foram coradas com anticorpos anti-rato CD16 /32 (bloco Fc, BD Pharmingen, San Diego, CA) em primeiro lugar, e depois com anti-rato CD8-FITC, conjugado com PE HPV16 E7 aa49-57 (RAHYNIVTF) carregadas com péptido a H2-D

b tetrâmero a 4 ° C. As células foram coradas com 7-AAD antes da citometria de fluxo para excluir as células mortas.

para detectar respostas de HPV16 específicos de E7 T CD8 + de células e células específicas-PADRE T CD4 + por coloração intracelular IFN-γ, PBMC, esplenócitos em suspensão de célula única ou linfócitos infiltrados no tumor foram estimuladas com HPV16 E7aa49-57 ou péptido PADRE (1 ug /ml) na presença de Golgiplug (BD Pharmingen, San Diego, CA) a 37 ° C durante a noite. As células estimuladas foram então lavadas uma vez com tampão de FACScan e corada com PE-conjugado monoclonal de rato anti-murganho ou anti-CD8a rato CD4. As células foram submetidos a coloração de citocinas intracelulares utilizando o kit Cytofix /Cytoperm de acordo com as instruções do fabricante (BD Pharmingen, San Diego, CA). Intracelular IFN-γ foi corado com rato conjugado com FITC anti-ratinho de IFN-γ. A citometria de fluxo foi realizada utilizando análise FACSalibur com @ software @ CELLQuest. Todas as análises foram realizadas com o software FlowJo (estrela Tree).

O isolamento de células supressoras derivadas mielóides em camundongos e supressão da proliferação de células T

CD11b + Ly6G

MDSCs Oi eram portadores de tumores isolado a partir de suspensões de esplenócitos de células únicas de TC-1 portadores de tumor ratinhos C57BL /6, utilizando kits de isolamento de CD11b + Ly6G e colunas LS para a separação magnética de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec). A pureza foi de não menos do que 95%.

In vitro

MDSC apoptose avaliação

MDSCs purificadas foram incubadas a 37 ° C ou co-cultivadas com específica PADRE-T CD4 + células a uma razão de 1:01 até 24 horas em placas de 96 poços. As células foram então coradas com APC de ratinho anti-CD11b, anti-ratinho Ly6G PE, anticorpos FITC anti-ratinho de anexina V e 7-AAD (kit de detecção de apoptose FITC anexina V, BD Pharmingen, San Diego, CA) e examinadas por citometria de fluxo. MDSCs foram fechado pela primeira vez em CD11b + e Ly6G

Oi, e depois a frequência de apoptose foi medida por anexina V + e 7-AAD.

Para avaliar anticorpos induzida apoptose MDSC, isolado MDSC foram cultivadas durante 12 horas com anticorpo agonista anti-Fas (2 ug /ml, BD Pharmingen, clone JO2, San Diego, CA), ou mAb de isotipo. Para ensaio in vitro, bloqueando, MDSCs isolado co-cultivadas com células T CD4 + específicas PADRE- na ração 01:01, em seguida, incubadas com o mAb de isotipo, ou Fas-Fas L antagonista (Kp7-6, Calbiochem) durante 24 horas.

a análise estatística

Todos os dados apresentados neste estudo são expressos como média ± sE onde indicado. As comparações entre os pontos de dados individuais para a coloração de citocinas intracelulares com citometria de fluxo e análise do tumor de tratamento foram feitas utilizando o teste t de Student bilateral por Gráfico Prism 6.0. Nos experimentos de tratamento de tumor, o principal resultado de interesse foi a duração até ratos foram sacrificados. As distribuições de tempo de eventos para ratos diferentes foram comparados pelo método de Kaplan-Meier eo teste de log-rank por Graph Prism 6.0. Todos os valores de p foram considerados significativos menor que 0,05.

Resultados

Tratamento de TC-1 ratos com cisplatina portadores de tumor, CPG e péptido PADRE gera potentes efeitos anti-tumorais

TC-1 ratinhos portadores de tumor foram utilizados para examinar os efeitos antitumorais de diferentes tratamentos que combinam a quimioterapia cisplatina intraperitoneal, injecção intratumoral de péptido PADRE e /ou injecção intratumoral de CpG. Ratinhos C57BL /6 foram inoculados com 1 x 10

5 TC-1 células tumorais no dia 0, e divide-se em cinco grupos de tratamento. Os ratinhos do grupo um eram não tratada, os do grupo 2 foram tratados com cisplatina seguido por intratumoral CpG, os do grupo 3 foram tratados com cisplatina seguido de péptido PADRE intratumoral, os do grupo 4 foram tratados com intratumoral CpG e PADRE, e aqueles no grupo 5 foram tratados com cisplatina seguido por CPG e intratumoral PADRE (Fig. 1A). Como mostrado na Fig. 1B, o tratamento com cisplatina seguido de CpG intratumoral e PADRE volume tumoral significativamente reduzido em relação ao controle e tratamento com apenas CPG e PADRE. Além disso, o tratamento com cisplatina seguido por CpG intratumoral e PADRE sobrevivência significativamente melhorada em comparação com todos os outros grupos de tratamento (Fig. 1C). Estes dados sugerem que a combinação de cisplatina, e de CpG PADRE tem efeitos significativos anti-tumor contra tumores TC-1.

ratinhos C57BL /6 (5 ratinhos /grupo) foram inoculados subcutaneamente com o CT-1 e as células tumorais tratadas com várias combinações de cisplatina, e de CpG péptido PADRE. Diagrama esquemático A. dos regimes de tratamento. B. Lote de cinética do crescimento tumoral. C. Kaplan-Meier sobrevivência. (*

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o tratamento com cisplatina, CPG e péptido PADRE provoca fortes efeitos antitumorais sistêmica

Uma vez que o tratamento com cisplatina, CPG e PADRE gerado os efeitos mais potentes anti-tumorais (Fig. 1), o próximo examinou se a terapia com todos os três agentes poderiam gerar efeitos antitumorais em um tumor secundário. Ratinhos C57BL /6 foram desafiados subcutaneamente com 1 de CT-células tumorais no flanco direito no dia 0, e, em seguida, novamente no flanco esquerdo no dia 5. Um grupo de ratinhos foi então tratada com anticorpo anti-CD8 nos dias 3-5 e depois semanalmente a depleção das células T CD8 +. Os ratinhos foram tratados tal como mostrado na Fig. 2A, com cisplatina por via intraperitoneal e com CPG e PADRE injetado intratumoral no tumor primário no flanco direito. Como mostrado na Fig. 2B, o volume do tumor primário foi significativamente reduzida em ratos tratados com cisplatina, o CPG e PADRE em comparação com ratinhos não tratados. Além disso, o volume do tumor médio no flanco esquerdo foi também diminuiu significativamente em ratinhos tratados com todos os três agentes, em comparação com ratinhos não tratados (Fig. 2C). A depleção de células T CD8 + diminuiu significativamente o efeito terapêutico da cisplatina, CpG e tratamento PADRE em ambos os tumores primários e secundários, indicando que as células T CD8 + são importantes para a eficácia do tratamento (Fig. 2B e C). FIG. 2D mostra que o tratamento com cisplatina, e CpG PADRE prolonga significativamente a sobrevivência de TC-1 ratinhos portadores de tumor em comparação com os ratos com depleção de células T CD8 + e murganhos não tratados. Da mesma forma, a depleção de células T CD4 + significativamente prejudicados os efeitos antitumorais do regime de tratamento triplo (S1A Fig.). Além disso, a infusão de células T CD4 + específicas de PADRE em ratinhos portadores de tumor significativamente aumentada efeito antitumoral (S1B Fig.). Estes resultados mostram que as células T CD4 + também são importantes para o efeito terapêutico observado. Tomados em conjunto, os dados indicam que o tratamento com cisplatina seguido por CPG e PADRE gera respostas imunes antitumorais sistémica potentes capazes de actuar contra tumores em locais distantes.

ratinhos C57BL /6 (5 ratinhos /grupo) foram desafiadas sequencialmente com células tumorais TC-1 no dia 0 (flanco direito) e no dia 5 (flanco esquerdo) e depois foram ou não tratados ou tratados com cisplatina combinada com a injecção intratumoral com CpG e péptido PADRE no tumor primário. No grupo de depleção de células T CD8 +, os ratinhos foram tratados como acima, com a Adição de 100 ug de anticorpo anti-CD8 de ratinho (clone 2.43) injectada intraperitonealmente nos dias 3, 4 e 5 após a inoculação do tumor, e, em seguida, 150 mg por semana posteriormente. Diagrama esquemático A. do regime de tratamento. B. Scatter plot da cinética de crescimento do tumor primário. C. Scatter lote de cinética de crescimento do tumor secundário. D. Kaplan-Meier sobrevivência. (***

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O tratamento com cisplatina, CPG e PADRE aumenta PADRE sistêmica. espec�icos respostas de células T CD4 + em ratinhos TC-1

Próximo apresentando tumores, examinámos o efeito do tratamento com várias combinações de cisplatina, e de CpG PADRE sobre as respostas imunitárias de células T CD4 sistémicos. TC-1 ratos portadores de tumores foram tratados com várias combinações de cisplatina, e de CpG péptido PADRE, como mostrado na Fig. 1A e PBMC foram analisadas por citometria de fluxo de 1 semana após a última administração do antigénio quanto à presença de IFN-γ secretoras de células T CD4 + específicas de PADRE. Como mostrado na Fig. 3A e B, os ratinhos portadores de tumor tratados com cisplatina seguido por CPG e PADRE gerado o maior número de PADRE-específica de células T CD4 + IFN-γ + sistemicamente em comparação com todos os outros grupos de tratamento. Isto indica que o tratamento com cisplatina, e CpG PADRE é capaz de gerar as respostas das células T CD4 + específicas de PADRE potentes em TC-1 ratinhos portadores de tumor.

ratinhos C57BL /6 subcutaneamente (5 ratinhos /grupo) foram desafiados com o CT-1 células tumorais e subsequentemente tratados com várias combinações de cisplatina, e de CpG péptido PADRE como indicado. As PBMC foram analisadas uma semana após a última administração do antigénio. A presença de células T CD4 + específicas de PADRE em PBMCs foram analisados ​​utilizando a coloração de citocinas intracelulares para o IFN-γ e CD4 + coloração seguida por análise de citometria de fluxo. A. fluxo representativas citometria gráfico de contorno que descreve a frequência de células CD4 + T secretoras de IFN-y na circulação após serem pulsados ​​com péptido PADRE. B. gráfico de barra quantificação dos dados (média ± EP).

O tratamento com cisplatina, e PADRE CpG induz respostas locais tumorais específicas de antigénio de células T CD8 + em TC-1 ratos portadores de tumores

TC-1 ratos portadores de tumores foram tratados com várias combinações de cisplatina, e de CpG péptido PADRE, como mostrado na Fig. 1A. os linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) foram colhidas para análise 12 dias após a última administração do antigénio. A presença de células T CD4 + específicas de PADRE e células T CD8 + específicas de E7-TIL entre caracterizou-se utilizando a coloração de citocinas intracelulares para o IFN-γ, bem como a coloração de células CD4 e CD8 e analisadas por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 4A e C, os ratos tratados com cisplatina seguido por CPG e PADRE gerado a percentagem mais elevada de células T CD4 + específicas de PADRE entre células T CD4 + se infiltram no tumor em comparação com todos os outros grupos de tratamento. Além disso, os ratos tratados com cisplatina, o CPG e PADRE gerado o maior número de células específica de E7-T CD8 + entre as células tumorais em comparação com todos os outros grupos de tratamento (Fig. 4B e D). É importante notar que TILs recolhidos de dentro do microambiente do tumor estão num estado activado, onde os receptores de células T estão a ser internalizado. Assim, a coloração aparece como um gradiente com base nos vários níveis de TCR internalização. Este aspecto difere do padrão de coloração normalmente observados na avaliação de células T específicas de antigénio na circulação sistémica, onde seria observada uma população distinta. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que o tratamento com cisplatina, e CpG PADRE pode conduzir à apresentação cruzada do antigénio tumoral, E7, resultando em respostas melhoradas tumorais específicas para o antigénio T CD8 + mediadas por células imunitárias nos loci de tumor.

6 ratinhos C57BL /(5 por grupo) foram provocados subcutaneamente com o CT-1 e as células tumorais tratadas com várias combinações de cisplatina, e de CpG péptido PADRE como indicado. 12 dias após a última administração do antigénio, linfócitos infiltrantes de tumor foram colhidas para analisar os subconjuntos de células imunitárias. A. fluxo representativas análise de citometria que descreve a frequência de células T CD4 + IFN-y-secretores específicos do PADRE entre o tumor total de infiltração de células T CD4 +. B. Gráfico de barra quantificação de dados de A. (média ± EP). C. fluxo representativas análise de citometria que descreve o número absoluto de células T CD8 + de ligação de tetrâmero E7 em suspensão de células únicas de 5 x 10

5 preparados a partir de tumores. D. Gráfico de barra quantificação de dados de C. (média ± SE).

O tratamento com cisplatina, CPG e PADRE diminui mielóides derivadas de células supressoras em loci tumor

Para examinar ainda mais a efeitos da cisplatina, CpG e tratamento PADRE, analisamos as mielóides derivadas de células supressoras imunossupressores (MDSCs) entre tumor infiltrando linfócitos de ratos portadores de tumor TC-1 tratadas. Entre 30 e 35 dias após a inoculação do tumor, os tumores foram colhidos e analisados ​​por citometria de fluxo como mostrado na Fig. 5A. FIG. 5B mostra que os tumores dos ratos tratados com cisplatina, CPG e PADRE teve uma porcentagem significativamente menor de CD11b + Ly6G

Hi MDSCs nos loci tumor em comparação com todos os outros grupos de tratamento. Estes dados sugerem que o tratamento com cisplatina, e PADRE CpG induz efeitos antitumorais pelo menos em parte por redução da população de MDSCs no microambiente tumoral.

ratinhos C57BL /6 (5 por grupo) foram provocados subcutaneamente com TC- 1 e células tumorais tratadas com várias combinações de cisplatina, e de CpG péptido PADRE. Em 30-35 dias após a inoculação do tumor, quando os diâmetros do tumor excedeu 10 mm, as células infiltrantes tumorais foram colhidas para análise quanto à presença de CD11b + Ly6G

MDSCs hi. A. gráficos de contorno representativos que descrevem a frequência de CD11b + Ly6G

MDSCs hi em suspensão de uma única célula preparados a partir de tumor. B. Gráfico de barra quantificação de dados de um (média ± SE) (*

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células T CD4 + específicas do PADRE induz apoptose MDSC através Fas e Fas via ligando

Foi observado que o tratamento com cisplatina seguido por CPG e PADRE reduziu o número de MDSCs em loci tumor. Anteriormente, foi demonstrado que MDSCs expressam Fas e vai sofrer apoptose Fas-FasL mediada por se encontrar uma célula T que expressam FasL [17]. Portanto, caracterizado o efeito de células T CD4 + específicas de PADRE activados em MDSCs em termos de actividade apoptótica e descobriram que MDSCs incubadas com células T CD4 + específicas de PADRE tinham significativamente mais elevada expressão de anexina V em comparação com aqueles incubadas com meio de controlo, indicando que As células T CD4 + activadas são capazes de induzir apoptose de MDSCs (Fig. 6). Além disso, observou-se que MDSCs co-cultivadas com células específicas de PADRE T CD4 + combinadas com Fas-FasL antagonista Kp7-6 diminuiu significativamente a frequência de apoptose em comparação com o controlo (Fig. 7). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que as células T CD4 + específicas para o PADRE induzir apoptose em MDSCs através de uma via dependente de Fas-FasL-, indicando que a morte MDSC pode ocorrer através de uma via não-específica do antigénio.

esplénica purificada CD11b + Ly6G

Oi MDSCs foram incubadas com células T CD4 + específicas de PADRE ou controlo do meio durante 24 horas. A. fluxo Representante citometria de parcelas que descrevem a frequência de CD11b + Ly6G

Hi anexina V + MDSCs. B. Gráfico de barra quantificação dos dados A (média ± EP) (****

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A.. Expressão de Fas em MDSCs na presença e na ausência de células T CD4 + específicas de PADRE. B. Gráfico de barra quantificação dos dados em um (média ± EP). C. purificada baço Ly6G

Hi MDSCs foram incubadas durante 12 horas com anticorpo agonista Fas (JO2) ou IgG de controlo irrelevante, eo CD11b + Ly6G

células Oi foram analisadas para a frequência de apoptose (anexina V + e 7-AAD -). D. MDSCs foram co-cultivadas com células específicas de PADRE T CD4 + durante 24 horas combinados com IgG irrelevante de controlo ou Fas-FasL antagonista Kp7-6. Os CD11b + Ly6G

Hi células foram analisadas quanto à frequência de apoptose, caracterizado por anexina V + e 7-AAD-. fluxo representante citometria de gráficos de pontos que descrevem a frequência de CD11b + Ly6G

Hi anexina V + MDSCs. E. Gráfico de barra quantificação dos dados em D (média ± SE) (***

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Discussão

no presente estudo, demonstraram que o tratamento com cisplatina seguido por injecção intratumoral de um adjuvante potente, CpG e um epitopo reactivo Pan HLA-DR, péptido PADRE, gera potentes antígeno as respostas imunes mediadas por células e os efeitos anti-tumor específica. De nota, o tratamento com cisplatina, CPG e PADRE gerado efeitos antitumorais sistêmicas e foi capaz de controlar tumores em locais distantes. Além disso, o nosso tratamento reduziu a população de MDSCs em loci de tumor, reduzindo assim a imunossupressão no microambiente tumoral. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a cisplatina, CpG e PADRE melhorar a apresentação cruzada do antigénio tumoral de tumores para gerar respostas imunes mediadas por células T CD8 + específicas de antigénio. A combinação de quimioterapia, adjuvante e peptídeo imunogênico aqui apresentado representa uma abordagem universal para controle do tumor.

De nota, a abordagem de tratamento de combinação tripla atual não incluem a introdução do antigénio E7 através da vacinação. No entanto, a geração de células T CD8 + específicas de E7-se observa (Fig. 4B). Nós argumentar que a resposta de células específica de E7-CD8 + T observada é induzida por apresentação cruzada dos antigénios E7 libertados a partir de tumor seguindo a apoptose induzida pela cisplatina por células apresentadoras de antigénio. Tipo 1 Produção Interferon após o tratamento CpG também serve para promover a apresentação cruzada.

Aqui nós observamos que as células T CD4 + específicas-PADRE são capazes de matar MDSCs através da interação Fas-FasL. Em adição às células específicas do PADRE CD4 + T sendo capaz de matar MDSCs no microambiente tumoral, quaisquer outras células T activadas também poderia teoricamente matar MDSCs. De facto, demonstramos recentemente que células específicas de E7-T CD8 + e ot-1 células T são capazes de induzir a apoptose em MDSCs a seguir ao tratamento com cisplatina, e CpG péptido GP33 (Wu et ai, comunicação pessoal). Uma vez activadas, as células T CD4 + e CD8 + T libertar citocinas relevantes, tais como IL-2, levando a sobre-regulação da expressão de Fas em MDSCs. FasL é expresso pelas células T activadas próprios. Como resultado, quando uma célula T activada encontra um MDSC, o MDSC vai sofrer apoptose Fas-FasL mediada por [17]. A remoção dos MDSCs imunossupressores do microambiente do tumor contribua para o controlo do tumor.

O estudo atual serve como uma plataforma que pode ser aplicável a muitos doentes com vários cancros. Uma característica única do péptido PADRE é que o epitopo consiste em é específico para várias moléculas de MHC de classe II, e, por conseguinte, é aplicável a numerosos indivíduos. Além disso, presume-se que esta abordagem não exige a identificação do antígeno tumoral. O primeiro ciclo de tratamento pode induzir a morte de células tumorais e a libertação de antigénio do tumor para dentro do microambiente do tumor, bem como a geração de células T CD4 + específicas de PADRE (Fig. 3). Seguindo os ciclos subsequentes de tratamento, a libertação de antigénio de tumor conduz ao cross-priming e a geração de células tumorais específicas para o antigénio T CD8 +, que são do mesmo modo capaz de matar células de tumor (Fig. 4). Devido a este mecanismo, não é necessário conhecer antigénios imunodominantes tumorais, tornando a abordagem potencialmente amplamente aplicáveis.

Uma vez que a actual abordagem envolve a injecção intratumoral de agentes terapêuticos, é mais aplicável a tumores acessíveis, tais como a cabeça e pescoço, e tumores da pele do colo do útero. No entanto, a abordagem pode ser limitada no caso de tumores de difícil acesso, uma questão que precisa ser tratada, a fim de ampliar ainda mais este conceito para a tradução clínica. Isto pode ser resolvido através da modificação do péptido PADRE para incluir homing tumor ou ambiente tumoral segmentação aptâmeros. Por exemplo, o ligando CD13 tem sido mostrado para ser capaz de fornecer o péptido antigénico para loci do tumor [18], [19] e induzem uma resposta anti-tumoral antigénio-específica [1]. Além disso, mostrámos que mesotelina e NKG2D podem ser utilizados como módulos de tumor-homing em proteínas quiméricas, entregando as proteínas terapêuticas para loci do tumor [20], [21]. Futuros estudos são necessários para ampliar a aplicabilidade da abordagem atual para tumores inacessíveis.

A abordagem aqui apresentada pode ser um candidato ideal para a tradução clínica. Na verdade PADRE e CpG foram testados em vários ensaios clínicos e encontrado para ser seguro.