Sumário

É introduzida uma nova abordagem chemocentric para identificar alvos câncer relevante. Começando com uma grande colecção química, a estratégia utiliza a lista de molécula pequena remate resultante a partir de um rastreio de citotoxicidade diferencial em HCT116 de tumor e linhas de células normais MRC-5 para identificar proteínas associadas com o cancro emergentes a partir de um perfil alvo Virtual diferencial dos compostos mais selectivos detectados em ambas as linhas celulares. Mostra-se que esta combinação inteligente de diferencial

in vitro

e

in silico

rastreios (DIVISS) é capaz de detectar uma lista de proteínas que já são bem aceites alvos de drogas câncer, enquanto complementando-o com proteínas adicionais que, direcionados seletivamente ou em combinação com outros, pode levar a benefícios sinérgicos para cancro terapêutica. A lista completa de 115 proteínas identificadas como sendo atingido de forma exclusiva por compostos que apresentam efeitos antiproliferativos seletivos para linhas de células tumorais é fornecido

Citation:. Flachner B, Lörincz Z, Carotti A, Nicolotti O, Kuchipudi P, Remez N, et ai. (2012) A Chemocentric Abordagem para a identificação de alvos câncer. PLoS ONE 7 (4): e35582. doi: 10.1371 /journal.pone.0035582

editor: Steve Horvath, da Universidade da Califórnia em Los Angeles, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de julho de 2011; Aceito: 19 de março de 2012; Publicação: 25 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Flachner et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Comissão Europeia (CancerGrid, FP-6 LCHC-CT-2006-037.559), https://ec.europa.eu/research/fp6/index_en.cfm. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: Beáta Flachner, Zsolt Lörincz, Sándor Cseh e György Dorman são empregados em tempo integral pagos de TargetEx, Dunakeszi, Hungria e Miklós J. Szabó e Béla Bertók são empregados em tempo integral de AMRI Hungria Zrt., Budapeste, Hungria. Jordi Mestres é Presidente da Chemotargets SL. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer é uma doença da célula [1]. Esta afirmação bastante simples implica uma enorme complexidade quando se tenta identificar os agentes anticancerígenos eficazes. Um dos principais problemas associados com a pesquisa anticancerígeno é que as estratégias direcionadas-alvo tradicionais são confrontados com a essencialidade da função do alvo nas células saudáveis. Inevitavelmente, as proteínas alvo que têm funções essenciais são susceptíveis de conduzir a entidades químicas com janelas terapêuticas estreitas e efeitos significativos tóxicos [2]. Um desafio adicional é o status epigenética e genética instável de células cancerosas, passando por múltiplas mutações, alterações de cópias do gene, e anormalidades cromossômicas que têm um impacto direto sobre a eficácia de agentes anticancerígenos em diferentes estágios da doença [3]. Todos estes aspectos fazem a descoberta de drogas câncer extremamente difícil e levaram a pobres taxas de sucesso de aprovação clínicos em comparação com outras áreas terapêuticas [2].

O advento dos ensaios de citotoxicidade baseados em células de alto rendimento abriu novas perspectivas para a descoberta anticancerígeno [4]. A aplicação de telas de citotoxicidade diferenciada marcou a saída a partir de telas pequenas da molécula a alvos individuais de proteínas pré-concebidas e permitiu a identificação de pequenas moléculas potencialmente que actuam através de uma riqueza de mecanismos de acção [5], enquanto que mostra ao mesmo tempo efeitos antiproliferativos selectivos em células cancerosas em comparação com as células saudáveis ​​[6]. No entanto, tal como foi recentemente apontado [1], para essas estratégias à base de células para ter um impacto real na descoberta de medicamentos cancro, meios para descobrir o perfil alvo de pequenas moléculas bioactivas em ensaios de toxicidade ou antiproliferativos são absolutamente necessárias. A este respeito, extensa perfilamento proteomic é frequentemente aplicada posteriormente para identificar proteínas expressas diferencialmente em linhas celulares de cancro que podem explicar o efeito biológico de pequenos acertos molécula [7], [8]. No entanto, o perfil das atividades celulares de bibliotecas moleculares é tanto tecnicamente e logisticamente uma tarefa trabalhosa [9] e, portanto, abordagens alternativas para a criação de perfil rápido e eficiente de centenas de compostos sobre milhares de proteínas são necessárias.

Nos últimos anos , a disponibilidade de uma quantidade crescente de dados de interacção proteína-ligando no domínio público promoveu o desenvolvimento de métodos computacionais à base de ligando com o objectivo de prever o perfil de afinidade de moléculas pequenas em múltiplos alvos [10]. Uma aplicação inicial delas foi a predição do espectro de actividade biológica de todas as pequenas moléculas contidas no banco de dados do Instituto Nacional do Cancro [11]. Ultimamente, perfilamento alvo virtual foi utilizado com sucesso para identificar novos alvos para drogas conhecidas [12], para prever o mecanismo de acção dos antimaláricos descobertas em uma tela à base de células high-throughput [13], e a sugerir os alvos contra os quais seleccionados compostos a partir de uma biblioteca química deverá ser testado, permitindo a identificação de novos antagonistas de todos os quatro membros da família de receptores de adenosina [14]. Tendo em conta os actuais níveis de desempenho alcançados, em termos de sensibilidade e especificidade, contra matrizes de interação ligando-proteína completa experimentalmente-determinados [15], esses métodos estão a emergir como uma verdadeira alternativa rápida e eficiente para a caracterização proteômica mais trabalhoso.

a integração de triagem de citotoxicidade diferencial e profiling alvo virtual para a identificação de alvos de câncer relevante foi posta em prática no contexto da CancerGrid, um projecto da Comissão Europeia ao abrigo do 6º Programa-Quadro [16]. Os detalhes sobre a abordagem seguida e os resultados obtidos são discutidos nas seções a seguir.

Resultados

Por uma questão de clareza, um esquema resumo do diferencial global

in vitro

e

in silico

rastreio processo (DIVISS) seguido neste trabalho está representado na Figura 1. a partir de uma colecção química dos compostos 30.000, rastreio de citotoxicidade diferencial resultou na identificação de dois conjuntos de pequena molécula sucessos mostrando antiproliferativa selectiva efeitos para as células tumorais e saudáveis, respectivamente, que por perfis alvo virtual conduziram finalmente, para a identificação de uma lista de 115 proteínas de relevância potencial para cancro. Os detalhes dos resultados obtidos em cada etapa desta nova abordagem chemocentric a identificação do alvo câncer são fornecidos a seguir.

de alta capacidade de triagem de citotoxicidade

Uma campanha de rastreio de citotoxicidade baseado em células foi realizada de uma colecção química composta de 30.000 diversas moléculas seleccionados principalmente a partir de todo o catálogo AMRI [17]. rastreio de ponto único destes compostos na concentração de 50 uM foi completada em duplicado em uma linha celular HCT116 do cancro do cólon. A correlação entre os dois valores de viabilidade independentes determinados para cada composto é representada na Figura 2a. fator de 0,58 Uma média Z ‘foi derivado a partir de análise destes dados duplicados, o que é indicativo da qualidade do ensaio e os dados obtidos. A distribuição do número de compostos que resultam em diferentes percentagens médias de viabilidade das células é fornecida na Figura 2b. Como pode ser observado, quase 50% dos compostos basicamente tinha nenhum efeito sobre a viabilidade das células HCT116. Mas o mais interessante, mais de 13% dos compostos mostraram efeitos tóxicos em células HCT116 notáveis, com valores de viabilidade de 20% ou inferior. Este citotóxica conjunto de 4.158 compostos foi selecionado para um rastreio de dose-resposta de acompanhamento.

a) Correlação dos dois valores de viabilidade independentes determinados para o mesmo composto e b) distribuição de valores de viabilidade para a biblioteca química de 30.000 compostos.

Diferencial citotoxicidade dose-resposta de triagem

Para optimizar a nossa capacidade de rastreio de dose-resposta, um conjunto diversificado de 2.000 moléculas foi selecionado pela primeira vez a partir dos 4.158 compostos citotóxicos identificados na alta anterior -throughput campanha [18] triagem. As curvas de dose-resposta em ambos HCT116 do tumor e as células normais MRC-5 foi determinada em duplicado para estes compostos 2.000. Para identificar as moléculas pequenas que têm níveis de toxicidade sobre as células de tumor significativamente mais elevados do que os observados em células saudáveis, a relação entre os

50 valores IC obtidos em células MRC-5, IC

50 (MRC-5), e os obtidos em células HCT116, IC

50 (HCT116), foi obtido para cada composto. Um total de 230 compostos foram identificados como sendo de 5 vezes ou mais citotóxicos em células de tumor do que nas células saudáveis ​​(IC

50 MRC-5 /IC

50 HCT116≥5). Uma análise quimiotipo agrupamento [19], em seguida, foi executada neste primeiro conjunto de 2.000 compostos para os quais foi produzido dados de dose-resposta. Uma pontuação de enriquecimento de citotoxicidade foi então atribuído a cada grupo de quimiotipo com base na sua presença relativa no conjunto de 230 compostos que apresentam efeitos anti-proliferativos mais selectivos sobre as células tumorais. Essas quimiotipos com taxa de acerto superior a 20% foram seleccionados e utilizados para recuperar compostos dos restantes 2158 para que apenas as medições de ponto único foram disponíveis. Esta tendência para quimiotipos citotóxicos selectivos do tumor levou à identificação de compostos que 150 foram complementadas com um conjunto adicional de 330 compostos adicionados na base de critérios de diversidade [18]. As curvas de dose-resposta em ambas as linhas celulares foram obtidas em duplicado para estes compostos 480, a partir do qual foi identificado um conjunto adicional de 35 compostos como tendo selectividade citotóxica para células tumorais em relação a células saudáveis. No total, 2.480 compostos passou por citotoxicidade dose-resposta diferencial

In vitro

triagem, que conduz à identificação de 265 compostos com a citotoxicidade selectiva para células tumorais (Figura 1). Em geral, 119,520 pontos de dados de citotoxicidade foram gerados, de 60.000 a partir dos exames preliminares de citotoxicidade em células HCT-116 (30.000 compostos em duplicado) e 59,520 a partir dos exames de dose-resposta (2.480 compostos a 6 concentrações, em duplicado em duas linhas de células), o que representa uma significativa rastreio de esforço.

as distribuições do CI médio resultante

50 valores para todos os compostos em 2.480 HCT116 do tumor e as células normais MRC-5 são ilustradas na Figura 3a. O fato de que compostos mais rastreadas ter determinado IC

50 valores abaixo de 25? M é uma boa indicação da validade da primeira triagem. A este respeito, a pouco mais de 12% dos compostos para células tumorais, em comparação com a quase 26% para as células normais, deu um

valor de IC50 superior a 25 uM, enquanto que 25% e 22% dos compostos rastreados no tumor e células normais, respectivamente, retornou um

valor de IC50 inferior a 5? M. A distribuição final dos rácios de citotoxicidade por composto é fornecido na Figura 3b, onde valores elevados estão associados a compostos promissores com algum grau de citotoxicidade selectiva em células tumorais em relação a células saudáveis. Como pode ser observado, a grande maioria dos compostos (mais de 60%) devolvido rácios de citotoxicidade entre 0,5 e 2 o que significa que eles eram, basicamente, não selectiva entre as células do tumor e saudáveis. Mas o mais interessante, 711 compostos (29%) foram encontrados para ser 2 vezes ou mais citotóxico em células tumorais do que em células saudáveis, com 265 deles mostrando rácios de citotoxicidade acima de 5. Em contraste, 277 compostos (11%) foram consideradas 2 vezes ou mais citotóxica em células saudáveis ​​do que em células tumorais, com 251 deles tendo índices de citotoxicidade abaixo de 0,2. Estes dois conjuntos de 265 e 251 compostos (Figuras S1 e S2), mostrando efeitos antiproliferativos seletivos para células tumorais e normais, respectivamente, serão transferidos para a próxima fase de perfilamento alvo virtual (Figura 1). A análise de similaridade (Figura S3) destacou a diversidade de estruturas químicas dentro de cada conjunto, mas também entre os dois conjuntos, um ponto importante ressaltar em apoio a triagem fenotípica abordagens sobre as estratégias direcionadas-alvo para doenças complexas.

a) distribuição da citotoxicidade (valores de IC50) dos compostos seleccionados em HCT116 e células MRC5 e b) a distribuição da citotoxicidade selectiva contra HCT116. NT significa “não tóxico”.

profiling alvo Virtual

Cada um dos conjuntos compostos à linha de células de duas seletivas foi processado

in silico

contra os 4.643 modelos de proteína à base de ligantes derivados do público recursos disponíveis [20] – [28] usando uma abordagem baseada na similaridade validado descrito anteriormente [14], [15]. No que diz respeito aos 265 compostos citotóxicos tumor selectivos, pelo menos, uma interacção alvo foi previsto para 173 delas (65%), o que reflecte que o espaço químico definido pelo conjunto de compostos selectivos de tumor foi decentemente cobertas por pequenas moléculas presentes em bases de dados chemogenomic públicas . Para estes compostos, um total de 2.356 interacções molécula de proteína foram previstos. Destes, 818 interacções entre 139 e 229 moléculas de proteínas foram previstos para ter actividades de 1 uM ou melhor (pAct≥6), o que significa que, em média, cada composto selectivo do tumor era esperado para potencialmente interagir com alvos 6. Em comparação, pelo menos, uma interacção alvo foi previsto para 117 dos 251 compostos citotóxicos selectivos sobre as células normais (47%), o que significa que 53% dos compostos foi encontrado como estando fora do âmbito de aplicabilidade definida por pequenas moléculas em bases de dados chemogenomic pública [ ,,,0],15]. Para estes compostos, um total de 1.023 interacções molécula de proteína foram previstos. Destes, 463 interacções entre 84 e 160 moléculas de proteínas foram previstos para ter actividades de 1 uM ou melhor (pAct≥6), resultando em um número médio de 5 proteínas que interagem por composto.

Uma análise comparativa da interações previstos a partir das duas linhas de células conjuntos compostos seletivos permite obter uma melhor visão sobre as proteínas que possam ser diferencialmente relevantes para linhas de células tumorais. Os resultados estão ilustrados no diagrama de Venn representado na Figura 4a, que mostra esquematicamente o grau de sobreposição e singularidade entre as duas listas de alvos. A este respeito, verificou-se que cerca de 114 proteínas foram previstos para ser atingido, pelo menos, uma vez por algum composto em qualquer um dos conjuntos, com a lista de proteínas sendo composta principalmente por receptores G acoplados à proteína (45%) e de enzimas (37% ). Em contraste, apenas 46 proteínas foram encontrados para ser apenas atingida por compostos com a citotoxicidade selectiva para células saudáveis, com uma distribuição entre famílias de proteínas muito semelhantes à obtida anteriormente para a lista de proteínas em comum (41% de receptores acoplados à proteína G e 37% de enzimas). Mas o mais interessante, foi identificada uma lista de 115 proteínas exclusivamente atingidos pelos compostos com a citotoxicidade selectiva para células de tumor (Tabela S1). Análise da sua composição entre as principais famílias de proteínas de interesse terapêutico revela uma assinatura claramente diferenciados dos outros duas listas de proteínas. Como se mostra na Figura 4b, a lista é composta principalmente de enzimas (58%) e a presença de receptores acoplados à proteína G foi reduzido de forma significativa (16%). Para complementar esse quadro, Figura 4c fornece a distribuição de classe das 67 enzimas encontradas nesta lista. Uma tendência clara no sentido de transferases (43%) é observado, muito de acordo com a importância conferida à quinases como alvos terapêuticos para o cancro [29], [30].

a) diagrama de Venn das proteínas alvo previsto para os compostos citotóxicos selectivos para HCT116 e linhas de células MRC-5; b) distribuição através de famílias de proteínas dos 115 alvos previsto para interagir exclusivamente com compostos citotóxicos selectivos para células tumorais; e c) a distribuição entre as classes de enzimas das 67 enzimas presentes na lista de 115 alvos de câncer putativos.

Prova de conceito

Pode não escapar do olho scrutinous do pesquisador de câncer que, dentro da lista de 115 proteínas seletivos potencial de tumor (Tabela S1), existem dois alvos anticancerígenos amplamente reconhecidas , ou seja, histona desacetilases (HDACs) e aquecer a proteína de choque 90-alfa (HSP90), sendo que ambos conhecidos a ser expresso em linhas celulares do cancro do cólon HCT116 [7], [8] e para conferir selectividade tumoral mediante pequena inibição molécula [31 ], [32]. Por conseguinte, numa tentativa para fechar o ciclo da abordagem DIVISS apresentado acima, os inibidores destas duas metas foram usadas para exemplificar, nesta fase, que os efeitos antiproliferativos de facto selectiva pode ser conseguida na HCT116 de tumor e linhas de células MRC-5 normais utilizados nesta trabalho.

Para este fim, ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA) e 17- (alilamino) -17-demetoxigeldanamicina (17AAG) foram seleccionados como representativos inibidores de HDAC e pan-HSP90, respectivamente. As curvas de dose-resposta em ambos HCT116 e linhas de células MRC-5 foram determinados para os dois inibidores (Figura S4). Os resultados confirmaram que ambos os compostos inibiram a proliferação de células HCT116 de uma forma dependente da dose, enquanto teve pouco ou nenhum efeito em células MRC-5. Em particular, o IC

50 valores de SAHA e 17AAG em células HCT116 foram de 0,64